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Nature Plants Band 9, Seiten 157–168 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die letzten Schritte der Zellatmung – ein wesentlicher Stoffwechselprozess in Pflanzen – werden durch mitochondriale oxidative Phosphorylierung durchgeführt. Dieser Prozess umfasst eine Kette von Membranproteinkomplexen mit mehreren Untereinheiten (Komplexe I–V), die Anordnungen höherer Ordnung bilden, die als Superkomplexe bezeichnet werden. Obwohl Superkomplexe die physiologisch relevanteste Form der oxidativen Phosphorylierungskomplexe darstellen, sind ihre Funktionen und Strukturen weitgehend unbekannt. Hier präsentieren wir die kryogene elektronenmikroskopische Struktur des Superkomplexes I + III2 aus Vigna radiata (Mungbohne). Die Struktur enthält das vollständige Untereinheitenkomplement von Komplex I, einschließlich einer neu zugewiesenen, pflanzenspezifischen Untereinheit. Es zeigt auch Unterschiede in der mitochondrialen Prozessierungspeptidasedomäne von Komplex III2 im Vergleich zu einem zuvor bestimmten Superkomplex mit Komplex IV. Die superkomplexe Schnittstelle erinnert zwar an die in anderen Organismen, ist jedoch pflanzenspezifisch, wobei eine Hauptschnittstelle die mitochondriale Prozessierungspeptidasedomäne von Komplex III2 einbezieht und an der Brückendomäne von Komplex I nicht beteiligt ist. Die Struktur des Komplexes I legt nahe, dass die Brückendomäne den Winkel zwischen den beiden Armen des Enzyms festlegt und so groß angelegte Konformationsänderungen begrenzt. Darüber hinaus deuten die katalytischen Schleifen des Komplexes I und seine Reaktion in Aktiv-zu-Deaktiv-Assays darauf hin, dass der Ruhekomplex in V. radiata einen nichtkanonischen Zustand annimmt und selbst in Gegenwart von Substrat deaktive oder offene Konformationen aufnehmen kann. Diese Studie erweitert unser Verständnis der möglichen Konformationen und des Verhaltens von Komplex I und Superkomplex I + III2. Weitere Studien zum Komplex I und seinen Superkomplexen in verschiedenen Organismen sind erforderlich, um die universellen und kladenspezifischen Mechanismen der Atmung zu bestimmen.

Die Zellatmung ist ein wesentlicher Stoffwechselprozess in Pflanzen. Die letzten Schritte der Atmung erfolgen durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) in der inneren Mitochondrienmembran (IMM). In seiner kanonischen Form umfasst OXPHOS vier Proteinkomplexe mit mehreren Untereinheiten der Elektronentransportkette (Komplexe I–IV, CI–CIV) sowie die mitochondriale ATP-Synthase (Komplex V). Die Komplexe I–IV übertragen Elektronen von NADH oder Succinat über die Elektronenträger Chinon und Cytochrom c auf molekularen Sauerstoff und bauen einen elektrochemischen Protonengradienten über das IMM auf. Dieser Protonengradient wird dann vom Komplex V abgebaut, wodurch ATP1 entsteht. OXPHOS-Komplexe können unabhängig voneinander existieren, fügen sich jedoch häufiger zu stöchiometrischen Anordnungen höherer Ordnung, sogenannten Superkomplexen, zusammen, deren Funktionen unklar geblieben sind2,3,4,5,6,7. In Pflanzen wurde festgestellt, dass nach Detergenzienextraktion aus dem IMM und nativer Gelelektrophorese zwischen 50 % und 90 % des CI mit CIII2 (SC I + III2) assoziiert sind, was das Ausmaß superkomplexer Assoziationen in vivo wahrscheinlich unterschätzt8. Um die physiologischen Funktionen von CI – dem Haupteintrittspunkt der Elektronen in OXPHOS – vollständig zu verstehen, müssen wir es daher im Kontext seiner Superkomplexe untersuchen. Die biochemische und strukturelle Analyse von SC I + III2 ist ein entscheidender Schritt zum Verständnis respiratorischer Superkomplexe in Pflanzen.

Kürzlich wurden mehrere kryogene Elektronenmikroskopie-Strukturen (KryoEM) für pflanzliches CI oder CI-Fragmente erhalten9,10,11. Darüber hinaus sind Strukturen für SC I + III2 von Ovis aries (Schaf) und Tetrahymena thermophila verfügbar12,13. Obwohl diese Strukturen unser Verständnis der Pflanzen SC I + III2 unterstützen, reichen sie nicht aus. Beispielsweise sind alle Strukturen von Pflanzen-CI unvollständig, es fehlt die Untereinheit NDUA11 sowie die Dichte für Transmembranhelices (TMHs) in den Kernuntereinheiten Nad5 und Nad6. Darüber hinaus sind mehrere Dichten noch nicht zugeordnet, darunter auch die für eine mutmaßliche neue Untereinheit, deren Identität nicht bestimmt werden konnte9,10,11. Darüber hinaus fehlen in den Pflanzenhomologen Sequenzen, die an der SC I + III2-Bildung in O. aries und T. thermophila beteiligt sind (z. B. aus NDUB4 und NDUB9), und es gibt erhebliche Unterschiede in den SC I + III2-Schnittstellen zwischen Schaf und T . thermophila SC I + III2. Daher können diese Strukturen nicht direkt verwendet werden, um Vorhersagen über die SC-Schnittstelle(n) der Anlage zu treffen. Darüber hinaus sind zwar Rekonstruktionen der Pflanzen-SC I + III2 aus Subtomogramm-Durchschnittswerten von Asparagus officinalis7 und Negativfärbungs-Elektronenmikroskopie von Arabidopsis thaliana14 verfügbar, ihre Auflösungen sind jedoch zu niedrig, um detaillierte Bewertungen vorzunehmen.

In diesem Artikel präsentieren wir eine hochauflösende Struktur von SC I + III2 aus Vigna radiata (Mungbohne) aus einem biochemisch aktiven Präparat. Diese Struktur enthält das vollständige Komplement der Untereinheiten für Pflanzen-CI, einschließlich NDUA11 (B14.7), zuvor fehlende Fragmente von Nad5 und Nad6 und eine neu zugewiesene CI-Untereinheit (NDUP9). Darüber hinaus enthält CIII2 eine andere Isoform der Mitochondrial Processing Peptidase (MPP)-α-Untereinheit als die, die in isoliertem CIII2 und SC III2 + IV beobachtet wurde (Lit. 15). CI und CIII2 interagieren an drei Stellen, die nicht die Brückendomäne von CI betreffen. Im Gegensatz zu einer früheren Hypothese des CI von A. thaliana (Lit. 11) legt unsere Analyse nahe, dass die Öffnung des Komplexes eher auf den Probenabbau als auf einen regulatorischen Prozess zurückzuführen ist. Darüber hinaus legt eine Untersuchung der großräumigen Struktur, der katalytischen Schleifen und der Aktiv-zu-Deaktiv-Reaktion (A/D) von CI nahe, dass die Ruhekonformation von V. radiata CI ein intermediärer, nicht-kanonischer Zustand ist und dass CI in beiden Fällen ähnliche Zustände abtastet Abwesenheit und Anwesenheit von Substrat.

Wir haben Mitochondrien aus etiolierten Mungobohnen-Hypokotylen isoliert. Anschließend extrahierten wir Proteinkomplexe aus den Mitochondrienmembranen mit dem sanften Detergens Digitonin und stabilisierten sie mit amphipathischen Polymeren (Extended Data Abb. 1a,b). Unter Verwendung eines Saccharosegradienten haben wir Atmungskomplexe und Superkomplexe teilweise gereinigt (Extended Data Abb. 1c, d). Wir haben die Fraktionen, die SC I + III2 enthalten (Extended Data Abb. 1c, d), gepoolt, gepuffert und konzentriert und diese teilweise gereinigte Probe zum Blot von KryoEM-Gittern verwendet, wie zuvor beschrieben9,13,15. Wir haben SC I + III2 mithilfe der Größenausschlusschromatographie (SEC) weiter gereinigt (Extended Data Abb. 1e, f). Die endgültige biochemische Probe zeigte die erwartete NADH-Cyt-C-Oxidoreduktase-Aktivität, die durch die CI- und CIII2-Inhibitoren Piericidin A bzw. Antimycin A gehemmt wurde (Abb. 1a).

a, NADH-Cyt-C-Oxidoreduktaseaktivität von amphipolstabilisiertem, isoliertem SC I + III2 in Abwesenheit oder Anwesenheit von CI- oder CIII2-Inhibitoren (jeweils 20 μM Piericidin A und 1 μM Antimycin A). Die Werte sind Mittelwerte aus drei oder vier unabhängigen Messungen einer einzelnen gereinigten Probe von SC I + III2; Fehlerbalken zeigen den Varianzkoeffizienten an, der als Summe der Variationskoeffizienten jedes experimentell bestimmten Werts (Pfadlänge, Extinktionskoeffizient und Aktivität) multipliziert mit dem Durchschnitt berechnet wird. b, CryoEM-Dichtekarte von SC I + III2, gefärbt nach Untereinheit. Die ungefähren Positionen der mitochondrialen Matrix und des Intermembranraums (IMS) sind mit schwarzen Linien dargestellt. c, Verbesserung des Atommodells im Vergleich zu zuvor verfügbaren Strukturen von Pflanzen-CI. Verbesserte oder neue Untereinheiten werden in farbigen Cartoons auf einer halbtransparenten CI-Oberfläche angezeigt. Cter, C-Terminus. d,e, SC I + III2 dargestellt aus der Matrix (d) oder der Ebene der Membran (e). Komplex I (CI) in blauer Oberfläche, Komplex III2 (CIII2) in grüner Oberfläche.

Unsere KryoEM-Bildverarbeitung führte zu zwei ersten Rekonstruktionen von SC I + III2, die das gesamte Komplement an Untereinheiten („überbrücktes“ SC I + III2) mit einer Auflösung von 3,3 Å und 3,6 Å (Klasse 1 bzw. Klasse 2) enthielten (Extended Data Abb. 2 und erweiterte Datentabellen 1 und 2). Die dreidimensionale Variabilitätsanalyse (3DVA) aller verbrückten SC I + III2-Partikel zeigte, dass die größte Variabilität der verbrückten Partikel von der flexiblen Schnittstelle zwischen CI und CIII2 herrührte (Ergänzungsfilme 1 und 2), was zu einer Karte von insgesamt geringerer Qualität führte CIII2 in beiden Klassen (Extended Data Abb. 2). Um die inhärente Flexibilität der Partikel zu überwinden, führten wir gezielte Verfeinerungen an den verbrückten SC I + III2-Klasse-1-Partikeln durch, indem wir Masken um die Brückendomäne von CI, die „Ferse“ von CI, das N-Modul von CI, das Modul der distalen Pumpe (Pd) von CI und CIII2 ( Erweiterte Daten Abb. 3 und erweiterte Datentabelle 1). Eine weitere Verbesserung der CIII2-Kartenqualität wurde durch anschließende gezielte Verfeinerung rund um die MPP-Domänen erreicht (Extended Data Abb. 3 und Extended Data Table 1). Diese fokussierten, verfeinerten Karten wurden zu einer zusammengesetzten Karte mit einer nominalen Auflösung von 3,2–3,6 Å kombiniert (Abb. 1b, erweiterte Daten, Abb. 3 und erweiterte Datentabelle 1). Zusätzlich zu den überbrückten Klassen wurden weniger besiedelte Klassen für SC I + III2 ohne Ferredoxinbrücke und andere Untereinheiten („brückenloses“ SC I + III2) und für CI allein identifiziert (Extended Data Abb. 2 und Extended Data Table 2). ). Die brückenlosen Partikel könnten in vier Klassen eingeteilt werden, die weiter unten näher erläutert werden. Der Rekonstruktion isolierter CI fehlte eine klare Dichte für die Brücke, NDUA11 und TMHs in Nad4-Nad6 und sie zeigte eine schlechte Dichte für das Pd-Modul, was mit zuvor veröffentlichten Strukturen von Pflanzen-CI übereinstimmt (Lit. 10, 11). Dies deutet darauf hin, dass CIII2 in Pflanzen möglicherweise benötigt wird, um intaktes CI nach der Extraktion aus der Membran zu stabilisieren. Wie sich der Aufbau und die Integrität der einzelnen Komplexe auf die des anderen auswirken können, wurde bei Säugetieren untersucht16, muss bei Pflanzen jedoch noch vollständig untersucht werden.

Wir haben das Atommodell für V. radiata SC I + III2 (Abb. 1b – e) auf der Grundlage zuvor veröffentlichter Strukturen von Pflanzen-CI und CIII2 (Lit. 9, 11, 15) erstellt. Die verbesserte Dichte der Karte im Vergleich zu früheren Rekonstruktionen für das CI-Fragment von V. radiata und CIII2 ermöglichte es uns, mehrere zusätzliche C-zu-U-RNA-Editierungsstellen in Nad1, Nad2, Nad3, Nad4, Nad4L, Nad5, Nad6, NDUS2 und NDUS3 zu bestimmen (Ref. 9, 15, 17) (Erweiterte Datentabelle 3). Die SC I + III2-Karte enthielt auch Dichte für Untereinheiten oder Regionen von Untereinheiten an der Schnittstelle zwischen CI und CIII2, die zuvor in anderen CI-Strukturen fehlten. Dies waren die akzessorische Untereinheit NDUA11 (B14.7), der C-Terminus der Kernuntereinheit Nad5, die vierte Transmembranhelix (TMH4) der Kernuntereinheit Nad6 und die Schleife zwischen TMH3 und TMH4 von Nad6 (Abb. 1c und erweiterte Daten Abb. 4). ). Dies bestätigte, dass NDUA11 eine echte CI-Untereinheit in Pflanzen ist und stellte fest, dass der C-Terminus von Nad5 zwei TMHs enthält, wie in Hefe18. Die Positionen der TMH4- und TMH3-4-Schleife von Nad6 haben funktionelle Auswirkungen, die im Folgenden erläutert werden. Darüber hinaus enthielt die Karte eine erweiterte L-förmige Dichte für eine Untereinheit in der Nähe von NDUA11, die in früheren CI-Rekonstruktionen der Anlage nicht identifiziert wurde9,10,11. Diese L-förmige Dichte erstreckt sich bis in die Grenzfläche zwischen CI und CIII2 und sorgt für Kontakte zwischen Komplexen, die bei anderen Arten nicht zu sehen sind (Abb. 1c). Mithilfe der Dichte, um eine vorläufige Aminosäuresequenz zu erhalten, gefolgt von einer BLAST-Suche, konnten wir die Untereinheit als Produkt des V. radiata-Gens LOC106767179 (Homologe von A. thaliana At1g67785) zuordnen. Dies entspricht einem CI-Untereinheitskandidaten, der durch Massenspektrometriestudien19,20,21 ermittelt wurde und ursprünglich fälschlicherweise als NDUB5 (Ref. 22) zugeordnet und später in P4 (Ref. 23) umbenannt wurde. Da jedoch die Algen Chlamydomonas reinhardtii und Polytomella sp. enthalten die etablierten Komplex-I-Untereinheiten P4–P8 (Lit. 11, 24). Um Verwirrung zu vermeiden, schlagen wir vor, diese Untereinheit NDUP9 zu nennen. Diese Untereinheit scheint pflanzenspezifisch zu sein, da standardmäßige BLAST-Suchen nur Pflanzenarten ergaben. Insgesamt bietet diese SC I + III2-Karte die vollständige Ergänzung der pflanzlichen CI-Untereinheiten (14 Kern- und 34 Zubehörteile; erweiterte Datentabelle 3).

Die SC I + III2-Karte zeigte auch Unterschiede in der MPP-Domäne von CIII2 im Vergleich zu den zuvor verfügbaren Strukturen aus V. radiatas Superkomplex III2 + IV (SC III2 + IV) und CIII2 allein15. Pflanzen enthalten mehrere Isoformen von MPP-α (Extended Data Abb. 5a). Wir haben zuvor festgestellt, dass in SC III2 + IV beide MPP-α-Untereinheiten dem Gen LOC106774328 entsprechen (Lit. 15). Im Gegensatz dazu war in SC I + III2 die MPP-α-Untereinheit im CIII2-Protomer, die CI am nächsten liegt, eine andere Isoform (entsprechend dem Gen LOC106765382), wie aus der besseren Anpassung dieses Proteins an die Dichte von SC I + III2 hervorgeht ( Erweiterte Daten Abb. 5b). Für MPP-α im anderen Protomer von SC I + III2 ist die Dichte nicht eindeutig, wobei einige Positionen eher zur LOC106765382-Sequenz passen und einige Positionen eher zur LOC106774328-Sequenz passen. Dies deutet darauf hin, dass die Dichte möglicherweise den Durchschnitt einer gemischten Population darstellt oder dass Datenbanken möglicherweise falsch annotiert sind. Die Hauptunterschiede zwischen den Isoformen liegen im N-Terminus, einschließlich einer kurzen Region, die mit CI interagiert (siehe unten). Die funktionelle Relevanz dieser Unterschiede im MPP-α muss noch untersucht werden. Wir beobachteten auch Unterschiede im MPP-β. Während die MPP-β-Isoformen mit denen in SC III2 + IV identisch waren, war die Helix, die das katalytische Glutamat (Glu217) enthielt, in beiden Protomeren in SC I + III2 teilweise ungeordnet (Extended Data Abb. 5d, e). Dies führt dazu, dass das katalytische Zn2+ nicht koordiniert werden kann (Extended Data Abb. 5d, e), was dazu führen würde, dass die MPP-Domäne nicht mehr funktionsfähig ist. Ob dieser Verlust eine biologisch relevante Folge der Bildung von SC I + III2 ist, muss noch geklärt werden. Alternativ könnte der Verlust von Zn2+ eine Folge unseres Reinigungsverfahrens sein, das sich geringfügig von dem zur Gewinnung der SC III2 + IV-Probe verwendeten Verfahren unterschied, in dem Zn2+ in den aktiven Zentren des MPP zu sehen war15. Es wird interessant sein, diese Ergebnisse zu V. radiata SC I + III2 mit denen anderer Pflanzenarten zu vergleichen.

Die Mungbohnen-SC I + III2-Karte zeigte drei Schnittstellen zwischen CI und CIII2: (1) eine Matrixstelle, die zwischen NDUB9 (CI), MPP-β (CIII2) und MPP-α (CIII2) gebildet wurde, (2) eine gebildete IMS-Stelle zwischen NDUP9 (CI), NDUA11 (CI) und QCR6 (CIII2) und (3) eine Membranstelle zwischen NDUA11 (CI) und QCR8 (CIII2) (Abb. 2a – e). Im Gegensatz zu SC I + III von T. thermophila, wo die CI-Brückendomäne eine umfangreiche SC-Schnittstelle bereitstellt, war die CI-Brückendomäne von V. radiata nicht direkt an der Bildung dieses Superkomplexes beteiligt (Extended Data Abb. 6a, b). Die MPP-Domäne von CIII2 stellte die größte Schnittstelle bereit, hauptsächlich durch hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen zwischen MPP-β und NDUB9 (Abb. 2c). MPP-α interagiert auch mit NDUB9 über drei Aminosäuren in der N-terminalen Verlängerung von MPP-α, von denen sich zwei zwischen den MPP-α-Isoformen unterscheiden. Beim Vergleich der N-terminalen Erweiterung von MPP-α aus der SC I + III2-Struktur (LOC106765382) mit der in SC III2 + IV (LOC106774328) stellten wir fest, dass die Schleifen ungefähr dieselbe Position einnehmen (Extended Data Abb. 5c). Darüber hinaus ist der Aspartatrest, der so positioniert ist, dass er mit B9-Arg64 eine Salzbrücke bildet, in beiden MPP-α-Isoformen konserviert. Angesichts der strukturellen Ähnlichkeit, der Konservierung des Aspartats und des minimalen Beitrags von MPP-α zu dieser Schnittstelle ist es unwahrscheinlich, dass diese MPP-α-Schleife ausreichen würde, um die Bildung von SC I + III2 gegenüber SC III2 + IV unterschiedlich zu regulieren. Dennoch muss die Hypothese, dass CIII2 mit unterschiedlichen MPP-α-Isoformen selektiv in verschiedene CIII2-Superkomplexe eingebaut wird, noch experimentell überprüft werden. Im IMS kontaktierten NDUP9 und NDUA11 QCR6 (Abb. 2d). Während NDUP9 und QCR6 überwiegend hydrophobe Wechselwirkungen zeigten, waren die zwischen QCR6 und NDUA11 eher elektrostatischer Natur. Schließlich war die Membranstelle eine kleine Schnittstelle einiger Reste auf NDUA11 und QCR8 (Abb. 2e). Wie bei den SC I + III2-Wechselwirkungen von O. aries und T. thermophila wurden diese drei Stellen in V. radiata über die Beteiligung von QCR8 am verankernden β-Faltblatt von MPP-β vom IMS mit der Matrix verknüpft.

a,b, V. radiata SC I + III2-Matrix (a), Membran- und Intermembranraum-Schnittstellen (IMS) (b). Interagierende Untereinheiten werden als farbige Cartoons auf der halbtransparenten Oberfläche des Komplexes I (CI) (blau) oder der Oberfläche des Komplexes III2 (grün) dargestellt. Der Einschub in b zeigt die vom IMS aus gesehene Schnittstelle. c–e, V. radiata-Wechselwirkungsdetails für Matrix- (c), IMS- (d) und Membranschnittstellen (e). Untereinheiten werden als farbige Cartoons mit Schlüsselresten als nach Atomen gefärbte Stäbchen dargestellt. Einige Strukturelemente sind der Übersichtlichkeit halber ausgeblendet.

Obwohl die SC I + III2-Schnittstellen der Mungobohnen denen in O. aries und T. thermophila ähnelten (z. B. unter Beteiligung von NDUB9, NDUA11 und QCR8 in allen drei Organismen), waren die spezifischen Protein- und Aminosäureinteraktionen unterschiedlich (Erweiterte Daten). Abb. 6c–h). SC-Interaktionen über NDUP9 scheinen pflanzenspezifisch zu sein. Darüber hinaus zeigten Überlagerungen von V. radiata, T. thermophila und O. aries SC I + III2, dass der Annäherungswinkel zwischen CI und CIII2 zwischen den Organismen unterschiedlich war, wie aus den Durchschnittswerten des Subtomogramms hervorgeht7. Ein Vergleich der CI:CIII2-Wechselwirkungen und der Ausrichtung mit anderen Pflanzenarten wird bestimmen, ob die hier beobachteten Schnittstellen in allen Pflanzenfamilien gemeinsam sind.

Bei mehreren Organismen wurde beobachtet, dass CI aufgrund der Verbindung zwischen seiner Membran und den peripheren Armen mehrere Konformationen annimmt18,25,26,27,28. Analoge Konformationen wurden für CI im Säugetier-SC I + III2 beobachtet, wo es einen ausgeprägten „geschlossenen“ Zustand und ein Ensemble von „offenen“ Zuständen annehmen kann12. Diese groß angelegten Änderungen gehen mit Konformationsänderungen in Schleifen in der Nähe der Chinon-Bindungsstelle (Nad1 TMH5-6, NDUFS2 β1-2-Schleife und NDUFS7 α1-2-Schleife und α2-β1) und an der Schnittstelle zwischen CIs einher Arme (Nad3 TMH2-3 und Nad6 TMH3-4) (Ref. 18,25,26,27,28). Darüber hinaus kann CI in einigen Organismen einen A/D-Übergang durchlaufen29,30,31. Dabei handelt es sich um einen Off-Pathway-Übergang, der CI in Abwesenheit eines Substrats in einen katalytisch inkompetenten Zustand versetzt und so vor ischämischen Reperfusionsschäden bei Säugetieren schützt30,31,32,33,34. Angesichts der Tatsache, dass der A/D-Übergang auch durch Konformationsänderungen erfolgt, blieb es umstritten, ob die offenen und geschlossenen Konformationen von CI Zwischenzuständen im Katalysezyklus von CI oder seinen aktiven und inaktiven Zuständen entsprechen28,35,36,37. In Pflanzen wurde das Vorhandensein des A/D-Übergangs noch nicht untersucht. Daher untersuchten wir die großräumigen und Schleifenkonformationen des CI von V. radiata in der SC I + III2-Struktur sowie die Fähigkeit von CI, den A/D-Übergang in Mitochondrienmembranen zu durchlaufen.

Unsere KryoEM-Bildverarbeitung identifizierte sechs verschiedene dreidimensionale Klassen: zwei Hauptklassen der oben beschriebenen verbrückten SC I + III2 (~72 % der superkomplexen Partikel) und vier kleinere brückenlose Klassen (~28 % der superkomplexen Partikel) mit unterschiedlicher Konformation und Zusammensetzung (Abb. 3 und erweiterte Daten Abb. 2). Die überbrückten Klassen zeigten nur einen geringen Unterschied in ihren Gesamt-CI-Konformationen (Abb. 3a, b und Extended Data Movies 1 und 2). Im Gegensatz dazu zeigten die brückenlosen Klassen eine progressive Vergrößerung des Winkels zwischen den peripheren und Membranarmen von CI und eine Abnahme der Krümmung des Membranarms von CI, sowohl untereinander als auch im Vergleich zu den überbrückten Klassen (Abb. 3c–f). . Die brückenlosen Klassen verloren nicht nur die Untereinheiten der Brückendomäne (NDUFX, NDUA6 und NDUAB1-α), sondern verloren auch zunehmend die Dichte der Untereinheiten oder Untereinheitensegmente an der Schnittstelle zwischen CI und CIII2 (NDUA11-Untereinheit, C-Terminus von NDUP9, die beiden C-Terminus von Nad5). -terminale Helices, TMH4 von Nad6, TMH3-4-Schleife von Nad6, C-Terminus von QCR6 und Transmembranhelix von QCR8) (Abb. 3g). Angesichts der Bedeutung einiger dieser Untereinheiten für die Katalyse ist es unwahrscheinlich, dass die brückenlosen SC I + III2-Klassen funktionsfähig sind oder dass der Verlust der Brücke ein regulatorischer Prozess ist, wie zuvor für A. thaliana CI vermutet (Lit. 11). ). Unserer Ansicht nach sind brückenlose Klassen eher das Ergebnis einer fortschreitenden Verschlechterung während der Probenreinigung und/oder der KryoEM-Gittervorbereitung.

a–c, überbrückte (a,b) und brückenlose Klassen von SC I + III2, betrachtet von der Seite (a) oder der Matrix (b,c). Brücke Klasse 1 in Grau, Klasse 2 in hellerem Grau. Brückenlose Klasse 1 bis Klasse 4 in zunehmend helleren Blautönen. Das Sternchen zeigt das Vorhandensein von NDUA11 in der brückenlosen Klasse 1 an. d–f, Unterschiede zwischen überbrückten und brückenlosen Klassen von SC I + III2, betrachtet von der Seite (d), der Matrix (e) oder der Rückseite von CI aus Ebene der Membran (f). Überbrücktes SC I + III2, Klasse 1, dargestellt in Grau, ausgerichtet auf brückenlose Klasse 4, in Hellblau. Drehungen sind in Bezug auf d angegeben. Das Öffnen des peripheren Arms und das Aufrichten des Membranarms werden mit Linien und Pfeilen dargestellt. g-, CI- und CIII2-Untereinheiten und Fragmente, die in der brückenlosen Klasse 4 verloren gehen, dargestellt in farbigen Cartoons auf der hellblauen Oberfläche der Klasse-4-Karte. h,i, Vergleich von V. radiata Bridge Klasse 1 (grau) und der offensten SC I + III2-Klasse von O. aries (PDB: 6QC4) (Ref. 12) (hellorange), gesehen von der Matrix (h) oder die Rückseite (i). Zur Orientierung sind die Positionen des Komplexes III2 (CIII2) und der CI-Untereinheit NDUFV1 (V1) dargestellt.

Wir verglichen auch den Winkel zwischen den CI-Armen bei O. aries und V. radiata SC I + III2. Obwohl V. radiatas überbrückter SC I + III2 geschlossener war (kleinerer Winkel zwischen den Armen) als SC I + III2 ohne Brücke, war er immer noch offener als der am weitesten geöffnete SC I + III2 von O. aries (Abb. 3h,i ). Daher ist allein aus diesem Blickwinkel unklar, ob davon ausgegangen werden sollte, dass sich das überbrückte SC I + III2 von V. radiata in einem „offenen“ oder „geschlossenen“ Zustand befindet.

Um mehr Klarheit über den Zustand von CI in V. radiatas SC I + III2 zu erhalten, verglichen wir die Merkmale seiner Chinon- und Schnittstellenschleifen mit denen von CI in zuvor beobachteten Zuständen, zum Beispiel offenen und geschlossenen Klassen in O. aries26, dem inaktiver Zustand bei Mus musculus25,27 und Yarrowia lipolytica CI im Umsatz- und inaktiven Zustand18.

Im Großen und Ganzen wurde bei mehreren Organismen beobachtet, dass Schleifen im geschlossenen oder Umsatzzustand geordnet und im offenen und inaktiven Zustand ungeordnet werden. Dennoch stimmten die V. radiata-Schleifen nicht vollständig mit einem einzelnen zuvor beobachteten Zustand überein (Abb. 4a – e und erweiterte Daten Abb. 7a, b). In der Chinon-Bindungsregion war die Nad1 TMH5-6-Schleife von V. radiata in einer Anordnung angeordnet, die der „Down“-Konformation der geschlossenen Klasse von Schaf-CI ähnelte, was auch im Hefeumsatz- und inaktiven Zustand zu sehen war (Abb. 4a). Allerdings befanden sich nicht alle wichtigen Glutamatreste (V. radiata Nad1-Glu207, Glu209 und Glu219) in einem angemessenen Abstand, um Salzbrücken mit wichtigen Argininresten in S7 (V. radiata S7 Arg111 und Arg115) zu bilden, wie in der geschlossenen Schafhefe zu sehen ist Umsatz und andere Strukturen18,26,38. Auch die Nad1-TMH5-6-Schleife von V. radiata entsprach nicht der geordneten Schleife im kürzlich beobachteten „offenen“ Zustand des Escherichia coli-CI37, da die Nad1-Glu211-Schleife von V. radiata von der S2-β1-2-Schleife weg zeigte. Darüber hinaus befand sich der Schlüsselrest S7 Arg111 in einer „nicht umgedrehten“ Position, ähnlich dem geschlossenen Schafzustand und der Hefe im Umsatz- oder inaktiven Zustand, jedoch mit einem β-Strang für die Reste S7-Pro81-Leu86, der typisch für den offenen Schafzustand und den inaktiven Zustand der Hefe ist (Abb. 4b). Die S2 β1-2-Schleife war in Übereinstimmung mit der offenen Klasse von Schafen und dem inaktiven Zustand der Maus ungeordnet, nicht jedoch im inaktiven Zustand der Hefe (Abb. 4c). Was die Schleifen an der Schnittstelle zwischen den CI-Armen betrifft, so war die Nad3 TMH1-2-Schleife über ihre gesamte Länge ungeordnet und ähnelte dem inaktiven Zustand der Maus (Abb. 4d). Die Nad6 TMH3-4-Schleife von V. radiata war geordnet, aber die Nad6 TMH3 zeigte die charakteristische π-Ausbuchtung, die in den offenen und inaktiven Säugetierstrukturen sowie in den inaktiven und Umsatzhefestrukturen zu sehen war (Abb. 4e). Wichtig ist, dass sich das TMH4 von Nad6 von V. radiata in einer „distalen“ Position an der Schnittstelle zwischen TMH1 von Nad4L und TMH16 von Nad5 befand (Abb. 4f). Dies ist etwa 14 Å von der Position von Nad6 TMH4 in den offenen/geschlossenen Klassen von Schafen entfernt, etwa 16 Å vom inaktiven Zustand der Maus und etwa 25 Å von der geneigten Position von Nad6 TMH4 im „deaktiven“ Zustand von Schafen26 (dem es an Dichte mangelt). für NDUFA11 und ND5 und ähnelt daher eher dem, was als „Zustand 3“-CI bezeichnet wurde, d. h. im Anfangsstadium des Abbaus28). Vielmehr ähnelte die Position von V. radiata Nad6 TMH4 am ehesten der in Thermus thermophilus mit oder ohne Substrate39,40 sowie der in E. coli in offenen, open-ready oder geschlossenen Strukturen37, mit Ähnlichkeiten zur Tetrahymena thermophila-Struktur13 und der Y. lipolytica inaktiver Zustand18 (Abb. 4f).

a–e, Artenvergleich der CI-Schleifen im Zusammenhang mit der Katalyse, Darstellung des V. radiata-Modells und der damit verbundenen Dichte (grüner Cartoon, transparente Karte) (links) und des Modells für die Struktur, der es am ähnlichsten ist, gefärbt nach Struktur (rechts). a, Nad1 TMH5-6-Schleife; O. aries heimisch, geschlossen (hellorange), PDB: 6ZKO26. b, NDUFS7 α1-2-Schleife (links) und α2-β1-Schleife (rechts). Wichtiger Argininrest (R) und β-Strang sind markiert; O. aries native geschlossene Klasse mit „nicht umgedrehtem“ Arginin in der β1-2-Schleife, β-Strang für die α2-β1-Schleife (hellorange, links), PDB: 6ZKO26 und O. aries natives offenes mit umgedrehtem Arginin und β-Strang ( gelb, rechts), PDB: 6ZKP26. c, NDUFS2 β1-2-Schleife; M. musculus deaktiv (dunkelorange), PDB: 6G72 (Ref. 25). d, Nad3 TMH1-2-Schleife; M. musculus deaktiv (dunkelorange), PDB: 6G72 (Ref. 25). e, Nad6 TMH3-4-Schleife; Thermus thermophilus nativ (hellblaugrün), PDB: 4HEA64. f, Position von Nad6 TMH4 über Organismen und Bedingungen hinweg. Von Nad6 ausgerichtete Strukturen. Zur Orientierung sind die V. radiata Nad5 TMH16 und Nad4L TMH1 dargestellt (grauer Cartoon). Struktur: V. radiata (grün, diese Studie), T. thermophilus nativ (hellblaugrün, PDB: 4HEA64), Tetrahymena thermophila nativ (cremefarben, PDB: 7TGH13), Yarrowia lipolytica deaktiv (braun, PDB: 7O71 (Ref. 18) ), O. aries nativ geschlossen (hellorange, PDB: 6ZKO26), O. aries nativ offen (gelb, PDB: 6ZKP26), M. musculus deaktiv (rot, PDB: 6G72 (Ref. 25)), O. aries ' deaktiv‘ (blau, PDB: 6KZS26). g,h, A/D-Übergang in den Mitochondrienmembranen von S. scrofa (g) und V. radiata (h). Die Membranen wurden isoliert mit 2 mM NEM (orange, grün) oder nach thermischer Deaktivierung (hellorange, hellgrün) in Gegenwart oder Abwesenheit einer Voraktivierung mit 5 μM NADH (S. scrofa) oder 5 μM dNADH (V . radiata). Die Werte sind der Prozentsatz der durchschnittlichen Aktivitäten (NEM/kein NEM), die aus vier bis zehn unabhängigen Messungen an einzelnen Proben isolierter S. scrofa- oder V. radiata-Mitochondrienmembranen ermittelt wurden, wie in Abb. 7 der erweiterten Daten dargestellt. Fehlerbalken entsprechen dem Variationskoeffizienten für Das Verhältnis wird als Summe des Variationskoeffizienten der einzelnen Sätze multipliziert mit dem Wert des Verhältnisses berechnet. Die statistische Signifikanz der Differenz zwischen den Verhältnissen wurde mithilfe eines zweiseitigen Z-Tests bestimmt. *P < 0,05 (P = 0,02 für deaktiviertes S. scrofa). NS, statistisch nicht signifikant (P > 0,05).

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Schleifenkonformationen in unserer V. radiata-Struktur nicht genau mit den zuvor beschriebenen offenen oder geschlossenen CI-Zuständen korreliert werden können und auch nicht vollständig dem inaktiven Zustand bei Säugetieren oder Hefen entsprechen. Dennoch lässt das Vorhandensein der π-Ausbuchtung im TMH3 von Nad6, die hydrophobe Reste in die hydrophile Achse von CI dreht und den Wasserdraht unterbricht, der vermutlich für das Protonenpumpen erforderlich ist, darauf schließen, dass unsere Struktur CI in einem Ruhezustand enthält.

Nach unserem Kenntnisstand wurde die Existenz des A/D-Übergangs in Pflanzen bisher nicht untersucht. Daher haben wir die Fähigkeit von V. radiata CI, den A/D-Übergang zu durchlaufen, mithilfe eines Standardtests mit isolierten Mitochondrienmembranen getestet30,31,41,42. In diesem Assay wird CI durch Inkubation der Membranen bei 37 °C in Abwesenheit von Substrat deaktiviert, was zu einer Störung des aktiven Zentrums und einer möglichen großflächigen Öffnung der Struktur führt27. Anschließend wird N-Ethylmaleimid (NEM) hinzugefügt, um CI in der inaktiven Konformation zu „fangen“, indem ein konserviertes Cystein in der TMH1-2-Schleife von Nad3 (Cys44 in V. radiata) modifiziert wird, das im inaktiven Zustand exponiert, im aktiven Zustand jedoch nicht zugänglich ist Zustand. Daher verhindert die NEM-Modifikation die Reaktivierung von CI, was zu einer Verringerung der beobachteten NADH-Oxidationsrate führt. Die schädlichen Auswirkungen von NEM können minimiert werden, indem der Komplex vor der Inkubation mit NEM mit einer geringen Konzentration an NADH (Substrat) voraktiviert wird.

Wir verglichen die Reaktion von V. radiata auf den A/D-Assay mit der von aus Sus scrofa (Schwein) isolierten Mitochondrienmembranen von Säugetieren, deren CI bekanntermaßen einen „klassischen“ A/D-Übergang durchläuft30. Wie erwartet verringerte die Exposition von Schweine-Mitochondrienmembranen gegenüber 2 mM NEM die CI-Raten, sowohl für thermisch deaktivierte als auch für „wie isolierte“ (nicht deaktivierte) Membranen. Der NEM-Effekt wurde in beiden Fällen teilweise durch Voraktivierung mit 5 μM NADH behoben. Darüber hinaus war die Hemmwirkung von NEM erwartungsgemäß bei deaktivierten Membranen höher als bei nicht deaktivierten Membranen (Abb. 4g und erweiterte Daten Abb. 7c).

Wir führten ähnliche Tests mit V. radiata-Mitochondrienmembranen durch. Um die Auswirkungen der mitochondrialen alternativen NADH-Dehydrogenasen von Pflanzen auszuschließen, verwendeten wir das NADH-Analogon DeaminoNADH (dNADH), das von CI, jedoch nicht von den alternativen Dehydrogenasen als Substrat verwendet werden kann43,44,45,46 (Extended Data Abb. 7d) . Obwohl V. radiata-Membranen auch anfällig für NEM waren, zeigte ihre Anfälligkeit bei thermischer Deaktivierung keine wesentlichen Veränderungen (Abb. 4h und erweiterte Daten Abb. 7d). Dies steht im Einklang mit der Inkubation ohne Substrate bei erhöhter Temperatur, die nicht zu einer erhöhten Exposition der THM1-2-Schleife von Nad3 führt. Darüber hinaus änderte sich die Anfälligkeit von V. radiata gegenüber NEM nach der Voraktivierung mit 5 μM dNADH nicht (Abb. 4h und erweiterte Daten, Abb. 7d). Das bedeutet, dass pflanzliches CI genauso anfällig für NEM war, unabhängig davon, ob das Enzym kürzlich aktiviert worden war oder nicht. Dies deutet darauf hin, dass Pflanzen-CI nicht in biochemisch unterschiedliche Zustände übergeht, die den A- und D-Zuständen entsprechen, die bei Säugetier-CI beobachtet werden, möglicherweise aufgrund des Vorhandenseins der Brückendomäne.

Insgesamt zeigte das CI von V. radiata in SC I + III2 nicht-kanonische Eigenschaften in Bezug auf seine großräumige Struktur, seine katalytischen Schleifen und sein Verhalten im Standard-A/D-Assay.

Hier präsentieren wir die KryoEM-Struktur von aktivem SC I + III2, gereinigt aus V. radiata-Mitochondrien, zusammen mit einer funktionellen Untersuchung des A/D-Übergangs in isolierten Mitochondrienmembranen.

Die SC I + III2-Baugruppe schützte mehrere CI-Untereinheiten an der Schnittstelle zu CIII2. Daher enthielt unsere Rekonstruktion die vollständige Struktur von CI, einschließlich der akzessorischen Untereinheit NDUA11, zusätzlicher TMHs der Kernuntereinheiten Nad5 und Nad6 sowie einer neu zugewiesenen, wahrscheinlich pflanzenspezifischen CI-Untereinheit NDUP9 (Abb. 1 und erweiterte Daten Abb. 1– 3). Unsere Struktur enthielt auch eine andere Isoform von MPP-α in einem CIII2-Protomer als die in SC III2 + IV (entsprechend den Genen LOC106765382 bzw. LOC106774328; erweiterte Daten, Abb. 5). Dies impliziert, dass CIII2-Superkomplexe je nach vorhandener MPP-α-Isoform unterschiedlich zusammengesetzt sein können. Darüber hinaus lässt das Fehlen von katalytischem Zn2+ in beiden MPP-β-Untereinheiten darauf schließen, dass die MPP-Funktion von CIII2 nicht aktiv ist, wenn CIII2 in SC I + III2 zusammengebaut wird. Nach unserem Kenntnisstand wurden die möglichen funktionellen Unterschiede der MPP-α- oder MPP-β-Isoformen nicht untersucht. In Kartoffeln wird MPP-α1 auf Messenger-RNA-Ebene in mehreren reifen Pflanzengeweben stärker exprimiert als MPP-α2, ohne wesentliche gewebespezifische Variation unter Standardbedingungen47,48. Darüber hinaus zielt MPP-α2 (At3g16480) in A. thaliana doppelt auf Chloroplasten und Mitochondrien ab48. Standardsequenz-Alignments zwischen den MPP-α-Isoformen von V. radiata und A. thaliana zeigten die Homologiebeziehungen zwischen den Isoformen nicht schlüssig auf. Die Hypothesen, dass MPP-Isoformen CIII2 in verschiedene Superkomplexe sortieren, dass das MPP von CIII2 in SC III2 + IV, aber nicht in SC I + III2 aktiv ist und dass Superkomplexe in bestimmten Geweben, Belastungen oder Entwicklungsstadien unterschiedlich zusammengesetzt sind, müssen noch experimentell überprüft werden.

Wie aus niedrigaufgelösten tomographischen Vergleichen7 und Sequenzvergleichen zu erwarten ist, sind die Details der SC I + III2-Schnittstelle pflanzenspezifisch (Abb. 2). Die Hauptschnittstelle in V. radiata befindet sich auf der Matrixseite zwischen MPP-β und NDUFB9, was die Flexibilität und Funktion der MPP-Domäne einschränken könnte. Ein Schlüsselmerkmal der SC I + III2-Schnittstelle in Pflanzen ist die Beteiligung der neuen CI-Untereinheit NDUP9. Die Funktionsanalyse von NDUP9-Mutanten wird die physiologischen Rollen von SC I + III2 und der Supercompex-Bildung im Allgemeinen beleuchten, wie sie bereits mit NDUFX- und NDUA11-Mutanten untersucht wurden49.

Ungeachtet spezifischer Details bleibt die breite Anordnung der Komplexe in SC I + III2 zwischen Pflanzen, Säugetieren12, Alveolaten13 und Hefen7 erhalten. Dies legt nahe, dass diese superkomplexe Anordnung evolutionäre Vorteile bietet, möglicherweise durch die Stabilisierung von Untereinheiten oder durch den Ausgleich des Elektronenflusses, um die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies zu begrenzen. Indem beispielsweise sichergestellt wird, dass CI und CIII2 nahe beieinander liegen, könnte die Bildung von SC I + III2 die Entstehung lokaler Unterschiede im Chinon-zu-Chinol-Verhältnis, insbesondere zwischen mitochondrialen Cristae, verhindern, die andernfalls die Produktion fördern könnten von reaktiven Sauerstoffspezies in Regionen, in denen der Pool überreduziert ist50.

Wie bei anderen Organismen ergab unsere KryoEM-Verarbeitung mehrere Klassen für SC I + III2 (Lit. 11, 12, 25, 26). Allerdings unterschieden sie sich nicht hauptsächlich im CI-Winkel, sondern auch in der kompositorischen Integrität von CI und der erhöhten Flexibilität von CIII2 (Abb. 3 und erweiterte Daten, Abb. 2). Vier der sechs Klassen zeigten einen Verlust der Brückendomäne („brückenloser“ SC I + III2). Dies ging mit einem Verlust oder einer Störung der akzessorischen Untereinheiten und Kernuntereinheiten einher (NDUA11 verloren; NDUP9, QCR6 und QCR8, Nad5 und Nad6 teilweise ungeordnet) sowie mit einer Vergrößerung des Winkels zwischen den Armen von CI und zwischen CI und CIII2. Die beiden „überbrückten“ Klassen wiesen eine gute Dichte für die Brückendomäne auf und unterschieden sich nur geringfügig im Winkel zwischen den CI-Armen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Brücke die Flexibilität von CI in Pflanzen einschränkt, den Winkel und die Bewegungsfreiheit der Arme einschränkt und dabei hilft, die Integrität der Zusammensetzung des Enzyms aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus sind NDUA11, der C-Terminus von Nad5 und TMH4 von Nad6 für die Katalyse von entscheidender Bedeutung, und ihr Verlust und ihre erhöhte Flexibilität wurden in Strukturen von Säugetier-CI in den Anfangsstadien des Abbaus („Klasse/Zustand 3“) festgestellt (Lit. 25, 28). , 51, 52). Daher ist unserer Ansicht nach der Verlust der Brücke und der zugehörigen Untereinheiten und die damit einhergehende Vergrößerung des CI-Winkels in den brückenlosen Klassen eher ein Ausdruck einer fortschreitenden Verschlechterung der Probe während der Vorbereitung als ein Regulierungsmechanismus für CI (Lit. 11). Unsere Ansicht steht im Einklang mit aktuellen Funktionsanalysen der A. thaliana-Knockout-Linien von NDUFX (einer der Brückenuntereinheiten)49, denen SC I + III2 fehlt. Trotz des Fehlens der Brücke und von SC I + III2 weisen diese Mutanten unter Standardbedingungen keine Wachstums- oder Entwicklungsdefekte auf, was zu erwarten wäre, wenn die Brückendomäne die Aktivität von CI reguliert. Darüber hinaus ist es angesichts der Tatsache, dass die NDUFX-Mutanten CI teilweise im Zwischenstadium der CI*-Assemblierung und nicht in brückenlosen Superkomplexen ansammeln, auch unwahrscheinlich, dass unsere brückenlosen Partikel aus Montagedefekten stammen49. Stattdessen spielt die CI-Brücke wahrscheinlich eine strukturelle Rolle dabei, die Arme von CI in einem permissiven Zustand für die Bildung von SC I + III2 zu halten49. Weitere Experimente zur Rolle der Brücke beim CI-Aufbau und der Bildung von Superkomplexen sind erforderlich.

Obwohl die überbrückten Klassen im Vergleich zu den brückenlosen Klassen „geschlossen“ (kleinerer Winkel) erschienen, waren sie offener als die offensten Säugetierklassen SC I + III2 (Abb. 3). Dies impliziert, dass die offenen und geschlossenen Bezeichnungen und Winkel relativ sind, und stützt die Ansicht, dass das Öffnen und Schließen der Struktur lediglich die inhärente, dem Organismus eigene Flexibilität des Komplexes widerspiegeln könnte38. Die Tatsache, dass die Brückendomäne in Pflanzen die Konformationsflexibilität von CI einschränkt und dass pflanzliches CI keine offeneren Zustände annehmen kann, ohne die Brücke zu verlieren, legt nahe, dass Änderungen im Winkel zwischen den Armen nicht Teil des konservierten katalytischen Mechanismus von CI sind. Darüber hinaus zeigt unsere Struktur, dass das Öffnen und Schließen des Winkels für die Ordnung oder Unordnung der katalytisch relevanten Schleifen in Pflanzen nicht notwendig ist. Dies steht im Einklang mit den Beobachtungen des CI von T. thermophila (Ref. 13), das ebenfalls eine Brückendomäne enthält, sowie des CI von Chaetomium thermophilum (Ref. 38), das keine Ferredoxinbrücke enthält, aber über zusätzliche Brücken verfügt Interaktionen über eine Erweiterung auf NDUA5. Es stimmt auch mit neueren Strukturen von E. coli-CI unter verschiedenen Bedingungen überein, die Unterschiede in der Rotation des PA, aber nicht im Winkel zwischen den Armen zeigen37. Dennoch muss noch untersucht werden, ob sich der Winkel des CI von V. radiata (sowie von T. thermophila und C. thermophilum) unter Umsatzbedingungen ändert. Unabhängig davon wird immer klarer, dass sich die Unterscheidung zwischen CI-Zuständen auf die Konformation der relevanten Schleifen und Helices konzentrieren sollte und nicht auf die großräumigen Winkel zwischen den Armen, wie kürzlich von anderen vorgeschlagen37,38.

Unsere Untersuchung der katalytischen Schleifen von CI ergab, dass das CI von V. radiata (isoliert in Abwesenheit von Substraten) eine Mischung von Merkmalen enthielt, die zuvor in den Zuständen offen/geschlossen und Umsatz/nativ/deaktiv beobachtet wurden, ohne sich genau an einen einzelnen Zustand anzupassen (Abb. 4 und). Erweiterte Daten Abb. 7). Die Chinon-Bindungsstelle erschien in einem halbgeordneten Zustand mit der Nad1-TMH1-2-Schleife in einer unteren Position. Allerdings befand sich nur ein Glutamat (Glu219) in Nad1 TMH1-2 in salzüberbrückender Entfernung zu wichtigen Argininresten in der S7-β1-2-Schleife (Arg115), obwohl Arg111 dem Nad1 TMH1-2 zugewandt war. Der Rest der Chinonstellenschleifen (S7 α2-β1-Schleife und S2 α1-2-Schleife) erinnerten an CI im inaktiven und offenen Zustand25,26. Unter den „Schnittstellen“-Schleifen erinnerte die stark ungeordnete Nad1-TMH1-2-Schleife an den inaktiven murinen Zustand und Nad6 enthielt eine π-Ausbuchtung, die typisch für inaktive, aber auch einige substratgebundene Strukturen ist18,25,26. Die Position von Nad6s TMH4 war „distal“, das heißt versteckt zwischen Nad5 und Nad4L, was an Nicht-Säugetier-Strukturen unter verschiedenen Bedingungen erinnert und sich stark von der Position in inaktiven Säugetier-Strukturen unterscheidet13,18,25,26,37,39 . Zusammengenommen lässt dies darauf schließen, dass sich die Ruhekonformation des Enzyms in einem „Zwischenzustand“ im Vergleich zu den zuvor beobachteten Zuständen in anderen Organismen befindet.

Die nicht-kanonische Schleifenkonfiguration steht im Einklang mit unseren Ergebnissen aus den A/D-Assays, bei denen V. radiata-Membranen anfällig für NEM-Hemmung waren, ihre Anfälligkeit (d. h. die Zugänglichkeit der Nad3 TMH1-2-Schleife) sich jedoch nicht änderte entweder nach Inkubation ohne Substrat bei 37 °C („Deaktivierung“) oder Voraktivierung mit Substrat (Abb. 4 und erweiterte Daten Abb. 7). Dies impliziert, dass die CI-Schleifen von Pflanzen eine Reihe von Konformationen entlang des katalytischen Kontinuums sowohl in Abwesenheit als auch in Gegenwart von Substrat abtasten können. Daher weisen Pflanzen möglicherweise eine niedrigere Energiebarriere zwischen den Zuständen entlang des katalytischen Pfads von CI und einen Mangel an offenen/geschlossenen und aktiven/deaktiven Zuständen auf, zumindest wie derzeit biochemisch definiert. Obwohl bereits kleine thermodynamische Barrieren zwischen den A- und D-Zuständen für Hefe nachgewiesen und für einen Mausstamm vorgeschlagen wurden, der eine P25L-Mutation in Nad6 TMH2 enthält (Lit. 41), sind diese Fälle nicht mit unseren Beobachtungen äquivalent. In Hefe und der P25L-Maus wandelt sich CI in Abwesenheit von Substrat schnell in einen stabilen D-Zustand um, mit einer nahezu vollständigen Anfälligkeit für NEM und Schutz durch Voraktivierung, wenn auch nicht im gleichen Ausmaß wie beim Wildtyp. Im Gegensatz dazu lag der V. radiata-CI in isolierten Membranen zu etwa 40 % in einem nicht-anfälligen „A-ähnlichen“ Zustand vor, ohne Schutz durch Voraktivierung. Daher erweitern Pflanzen das Repertoire an Beobachtungen, die in offenen/geschlossenen, aktiven/deaktiven Diskussionen berücksichtigt werden müssen.

Insgesamt stellten wir fest, dass V. radiata CI innerhalb von SC I + III2 eine Zwischenschleifenkonfiguration, einen nicht-kanonischen A/D-Übergang und sehr begrenzte Unterschiede im Winkel zwischen den CI-Armen in Gegenwart der Brückendomäne aufwies. Unsere aktuellen Definitionen und Tests für die CI-Struktur und -Funktion müssen möglicherweise im Lichte von Studien an Organismen außerhalb traditioneller heterotropher Modellsysteme aktualisiert werden. Es wird interessant sein, den A/D-Übergang und den umgekehrten Elektronentransfer in Pflanzen unter Verwendung von Mitochondrienmembranen, Submitochondrienpartikeln und rekonstituierten Proteoliposomen36 aus V. radiata und anderen Pflanzenarten weiter zu untersuchen. Es wird auch wichtig sein, die Struktur von Pflanzen-CI in Superkomplexen unter Zyklusbedingungen zu untersuchen, um zu untersuchen, ob ein Öffnen und Schließen der CI-Arme vorliegt. Die weitere Untersuchung von CI und seinen Superkomplexen in Pflanzen und verschiedenen Organismen im gesamten Lebensbaum wird ein differenzierteres Verständnis des Enzymmechanismus ermöglichen, einschließlich sowohl universeller als auch kladenspezifischer Merkmale.

Diese Arbeit wird zusammen mit einer Studie zur Kryo-EM-Struktur des Superkomplexes I + III2 aus Arabidopsis thaliana mit einer Auflösung von 2 Å veröffentlicht53. Vor der Annahme der Arbeiten wurden keine experimentellen Daten oder Manuskriptversionen zwischen den Gruppen ausgetauscht, sodass sich die unabhängigen Studien besser ergänzen und validieren würden.

V. radiata-Samen wurden 20 Minuten lang in 1 % (v/v) Bleichmittel inkubiert und gespült, bis das Wasser einen neutralen pH-Wert erreichte. Anschließend wurden die Samen etwa 24 Stunden lang im Dunkeln mit 6 mM CaCl2-Lösung getränkt. Die Samen wurden bis zu einer Enddichte von 0,1 g cm-2 auf zwischen feuchtem Käsetuch geschichteten Kunststoffschalen ausgesät und 5 Tage lang im Dunkeln bei 20 °C gekeimt. Den Samen wurden am ersten Tag der Aussaat 2 l Wasser und am zweiten Tag weitere 0,5 l Wasser gegeben. Am fünften Tag wurden die etiolierten Sprossen geerntet, indem die Hypokotyle von den Wurzeln und Keimblättern per Hand getrennt wurden. Hypokotyle wurden zur mitochondrialen Reinigung wie zuvor beschrieben weiterverarbeitet9,15. Kurz gesagt, Hypokotyle wurden in einem Waring-Mischer mit Homogenisierungspuffer (0,4 M Saccharose, 1 mM EDTA, 25 mM MOPS-KOH, 10 mM Tricin, 1 % w/v PVP-40, 8 mM Cystein und 0,1 % wv BSA, pH) homogenisiert 7.8), durch mehrere Lagen Miracloth filtriert und 10 min bei 1.000 g und 4 °C zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde erneut 30 Minuten lang bei 12.000 g und 4 °C zentrifugiert. Die Pellets wurden in Waschpuffer (0,4 M Saccharose, 1 mM EDTA, 25 mM MOPS-KOH und 0,1 % w/v BSA, pH 7,2) resuspendiert und 5 Minuten lang bei 4 °C und 1.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde 45 Minuten lang bei 12.000 g und 4 °C zentrifugiert. Die Pellets wurden in Waschpuffer resuspendiert und auf Saccharose-Stufengradienten (35 %, 55 % und 75 % w/v) geladen und 60 Minuten lang bei 72.000 g und 4 °C zentrifugiert. Saccharosegradienten wurden mit dem BioComp Piston Gradient Fractionator, verbunden mit dem Fraktionssammler Gilson F203B, nach der Absorption bei 280 nm fraktioniert. Relevante mitochondriale Fraktionen wurden gepoolt und 1:5 v/v in Verdünnungspuffer (10 mM MOPS-KOH und 1 mM EDTA, pH 7,2) verdünnt. Die Probe wurde 20 Minuten lang bei 16.000 g und 4 °C zentrifugiert. Das Pellet wurde im endgültigen Resuspensionspuffer (20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA und 10 % v/v Glycerin, pH 7,5) resuspendiert und 20 Minuten lang bei 16.000 g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet (gereinigte Mitochondrien) wurde aliquotiert, eingefroren und bei –80 °C gelagert.

Alle Schritte wurden bei 4 °C mit vorgekühlten Materialien durchgeführt. Gefrorene mitochondriale Pellets von V. radiata wurden aufgetaut, in doppelt destilliertem Wasser mit 5 ml g-1 Pellet resuspendiert und mit einem Dounce-Glashomogenisator homogenisiert. Dem Homogenat wurde Kaliumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 0,15 M zugesetzt und erneut homogenisiert. Das Homogenat wurde 90 Minuten lang bei 45.000 g zentrifugiert. Die Pellets wurden erneut in Puffer M (20 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 % v/v Glycerin, 10 U ml−1 DNase I, 2 mM Dithiothreitol und 0,002 % Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, pH 7,4)) resuspendiert und homogenisiert ). Das Homogenat wurde dann 90 Minuten lang bei 4 °C und 45.000 g zentrifugiert. Die Pellets wurden in 3 ml Puffer M pro Gramm Ausgangsmaterial resuspendiert und erneut homogenisiert. Die Proteinkonzentration des Homogenats wurde mit einem Pierce BCA-Assay-Kit bestimmt wurde zur Lagerung bei –80 °C auf eine Endkonzentration von 20 mg ml−1 in 30 % (v/v) Glycerin verdünnt.

Mit V. radiata gewaschene Mitochondrienmembranen wurden auf Eis aufgetaut. Membrankomplexe wurden durch 60-minütiges Taumeln bei 4 °C mit Digitonin in einem Verhältnis von 4:1 (Gew./Gew.) und einer Konzentration von 1 % (Gew./Vol.) in Puffer MX (30 mM HEPES, 150 mM Kaliumacetat, 10 % v/v Glycerin, 1 mM EDTA und 0,002 % PMSF). Der Extrakt wurde dann 30 Minuten lang bei 4 °C und 25.500 g zentrifugiert und das amphipathische Polymer A8-35 wurde dem Überstand schrittweise bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % (Gew./Vol.) unter 40-minütigem Taumeln zugesetzt. Die Probe wurde dann auf Dialysemembranen mit einem Cut-off von 12.000–14.000 Da übertragen und in Dialysepuffer (30 mM HEPES, 150 mM Kaliumacetat, 1 mM EDTA, 5 % Glycerin (v/v) und 200 μM γ-Cyclodextrin, at) dialysiert pH 7,7) für 3 h bei 4 °C. Die Dialysemembran wurde dann in den zweiten Dialysepuffer (30 mM HEPES, 150 mM Kaliumacetat, 1 mM EDTA, 5 % Glycerin (v/v) und 0,04 % (w/v) BioRad Bio-beads SM-2 bei einem pH-Wert übertragen 7.7) und über Nacht (~16 h) bei 4 °C dialysiert. Die Probe wurde aus der Dialysemembran gewonnen und mit Zentrifugalproteinkonzentratoren mit einem Molekulargewichts-Cut-off von 100.000 Da konzentriert. Das Konzentrat wurde auf 20–45 % (w/v) lineare Saccharosegradienten (in 15 mM HEPES und 20 mM KCl, pH 7,8) geladen, die mit den Werkseinstellungen eines BioComp Instruments-Gradientenherstellers hergestellt wurden, und 23 Stunden lang bei 243.500 g zentrifugiert bei 4 °C. Die Gradienten wurden dann mit einem BioComp Piston Gradient Fractionator, der an den Fraktionssammler Gilson F203B angeschlossen war, nach der Absorption bei 280 nm fraktioniert. Während der gesamten Reinigung wurde die NADH-Dehydrogenase-Aktivität von SC I + III2 spektroskopisch mit einem Ferricyanid (FeCy)-Aktivitätsassay gemessen, der von Lit. übernommen wurde. 54 wie zuvor beschrieben9,15. Einzelheiten finden Sie im nächsten Abschnitt.

Für die KryoEM-Gittervorbereitung wurden relevante Fraktionen des Saccharosegradienten gepoolt, zur Entfernung der Saccharose gepuffert und auf eine Endproteinkonzentration von ~1,5 mg ml-1 konzentriert. Um die Saccharose zu entfernen, wurden die gepoolten Fraktionen in 30 mM HEPES, 150 mM Kaliumacetat, 1 mM EDTA und 0,002 % PMSF, pH 7,7, verdünnt und unter Verwendung von Zentrifugalproteinkonzentratoren mit einem Molekulargewichts-Cut-off von 100.000 Da konzentriert. Die Verdünnungs- und Konzentrationsschritte wurden mehrere Runden wiederholt, bis die geschätzte Endkonzentration an Saccharose <1 % (Gew./Vol.) betrug.

Zur vollständigen biochemischen Reinigung von SC I + III2 wurde die Probe auf ein Endvolumen von 200 µl konzentriert und einer SEC unterzogen. Die Probe wurde mit einem BioRad NGC-System und einem BioFrac Fraction Collector auf eine Superose 6 10-300-Säule injiziert. Die Absorption bei 280 nm und 420 nm wurde zur Sammlung relevanter Fraktionen überwacht. Ausgewählte SEC-Fraktionen wurden gepoolt und unter Verwendung von Zentrifugalkonzentratoren mit einem Cut-off von 30.000 Da konzentriert. Die Proteinkonzentration wurde mit einem Pierce BCA-Assay-Kit gemessen und in Puffer MX (siehe oben) und 30 % (v/v) Glycerin auf ~0,185 mg ml−1 verdünnt. Die Probe wurde aliquotiert und in flüssigem Stickstoff gelagert.

Probenaliquots wurden mit 5–8 µl Beladungsfarbstoff (5 % (w/v) Brilliant Blue G, 0,5 M Aminokupfersäure und 50 % (v/v) Glycerin gemischt und auf handgegossenes 3–12 % Tris geladen –Glycin-PAGE geliert und bei 4 °C laufen gelassen. Der Anodenpuffer bestand aus 25 mM Tris und 192 mM Glycin bei pH 8,3. Der dunkelblaue Kathodenpuffer bestand aus 25 mM Tris, 192 mM Glycin und 0,02 % Coomassie-Blau G-250 (Gew./Vol.); Der hellblaue Kathodenpuffer war identisch mit dem dunkelblauen Puffer, außer dass er 0,002 % Coomassie-Blau G-250 (w/v) enthielt. Die Gele wurden bei konstanter Spannung in dunkelblauem Puffer 30 Minuten lang bei 150 V laufen gelassen, dann auf hellblauen Puffer umgestellt und weitere 2 Stunden lang bei 200 V laufen gelassen.

Der In-Gel-NADH-Dehydrogenase-Aktivitätstest wurde auf der Grundlage von Ref. durchgeführt. 55. Die Gele wurden in 10 ml Reaktionspuffer (1,5 mg ml-1 Nitrotetrazolblau in 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 und 150 µM NADH) inkubiert und etwa 10 Minuten lang bei Raumtemperatur geschüttelt, während violette Banden auftraten (was auf NADH-Dehydrogenase hinweist). Aktivität) entwickelt. Sobald sich die Banden ausreichend entwickelt hatten, wurde die Reaktion mit einer Lösung aus 50 % (v/v) Methanol und 10 % (v/v) Essigsäure gelöscht. Nach der Bildgebung wurde das Gel mit Coomassie-Färbung (0,1 % w/v Coomassie Brilliant Blue R250, 10 % v/v Eisessig und 50 % v/v Methanol) gefärbt.

Die Tests wurden unter Verwendung von 96-Well-Platten in einem Spectramax M2-Spektrophotometer von Molecular Devices durchgeführt. Die folgenden Spezialreagenzien und Hersteller wurden je nach Bedarf verwendet: NADH (MilliporeSigma), dNADH (Nicotinamid-Hypoxanthin-Dinukleotid, MilliporeSigma), aus Pferdeherz gereinigtes Cyt C (MilliporeSigma), FeCy (MilliporeSigma), Decylubiquinon (DQ; Santa Cruz Biotechnology), Antimycin A ( MilliporeSigma), Piericidin A (Cayman Chemicals), Superoxiddismutase (MilliporeSigma) und KCN (Honeywell). Die NADH-Oxidation wurde bei 340 nm gemessen; Die Zytoplasma-Reduktion wurde bei 550 nm gemessen. Die Weglänge unserer Reaktion in den 96-Well-Platten und die in Aktivitätsberechnungen verwendeten Extinktionskoeffizienten von NADH und Cyt c wurden experimentell bestimmt (siehe unten). Für NADH und dNADH wurde ein Extinktionskoeffizient von 5,4 mM−1 cm−1 verwendet; Für reduziert-oxidiertes Cytochrom c wurde ein Extinktionskoeffizient von 6,5 mM−1 cm−1 verwendet. Die Pfadlänge unseres Tests betrug 0,531 cm. Die Messungen der anfänglichen Raten wurden in Replikaten durchgeführt (siehe unten), gemittelt und hintergrundkorrigiert. Die Abbildungen zeigen Durchschnittswerte und Standardfehler vom Mittelwert.

Um den Extinktionskoeffizienten von Cytochrom c experimentell zu bestimmen, haben wir Standardkurven für oxidiertes und reduziertes Pferde-Cytochrom c erstellt. Lyophilisiertes Cyt c wurde in 20 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl und 10 % Glycerin (v/v) auf eine Stammkonzentration von 25 mM verdünnt. Arbeitskonzentrationen wurden durch Verdünnen der Stammlösung in 20 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl und 10 % Glycerin (v/v) Puffer über einen Bereich von 25–125 μM hergestellt. Um Cytochrom c zu oxidieren oder zu reduzieren, wurden 400 μM Kalium FeCy oder 2 mM Natriumdithionit zu den Arbeitskonzentrationen von Cytochrom c hinzugefügt. Um den Oxidationszustand von Cytochrom c bei jeder Arbeitskonzentration sicherzustellen, haben wir alle 2 nm Spektralscans für 350–600 nm erstellt, die Spuren untersucht und das Verhältnis A550 nm/A565 nm berechnet. Ein A550-nm/A565-nm-Verhältnis >9,0 galt als vollständig reduziert. Mit diesen vollständig reduzierten und oxidierten Cytochrom-C-Proben haben wir die Absorption bei 550 nm gemessen, um Standardkurven für reduziertes und oxidiertes Cytochrom-C zu erstellen. Messungen der Standardkurve wurden in drei Wiederholungen mit fünf Cytochrom-C-Konzentrationen durchgeführt, gemittelt und hintergrundkorrigiert. Zur Berechnung des Fehlers wurde die Standardabweichung herangezogen. Durch Messung der Steigung ermittelten wir einen Extinktionskoeffizienten von 12,7 mM−1 für reduziertes Cytochrom c und 6,2 mM−1 für oxidiertes Cytochrom c bei 550 nm. Anschließend subtrahierten wir die Absorption des oxidierten Cytochrom c von der des reduzierten Cytochrom c und zeichneten eine Standardkurve, um einen Extinktionskoeffizienten für reduziert-oxidiertes Cytochrom c bei 550 nm von 6,5 mM−1 zu erhalten. Bei gegebener Küvettenweglänge (1 cm) entspricht dies einem Extinktionskoeffizienten von 6,5 mM−1 cm−1.

Der Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm wurde experimentell bestimmt, indem der A340 nm von reduziertem NADH bei verschiedenen Konzentrationen in 20 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl und 10 % Glycerin (v/v) gemessen wurde. Messungen der Standardkurve wurden in drei Wiederholungen mit fünf NADH-Konzentrationen über einen Bereich von 10–100 μM durchgeführt, gemittelt und hintergrundkorrigiert. Zur Berechnung des Fehlers wurde die Standardabweichung verwendet. Wir haben einen Extinktionskoeffizienten für reduziertes NADH bei 340 nm von 5,4 mM−1 ermittelt. Bei gegebener Küvettenweglänge (1 cm) entspricht dies einem Extinktionskoeffizienten von 5,4 mM−1 cm−1.

Wir haben die Pfadlänge von 200 μl unseres Reaktionspuffers (20 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl und 10 % Glycerin (v/v)) in 96-Well-Platten mithilfe der PathCheck-Funktion des Spectramax M2-Spektrophotometers gemäß den Anweisungen des Herstellers berechnet. Kurz gesagt wurde die PathCheck-Funktion verwendet, um die Pfadlänge von 200 μl unseres Puffers in einer 96-Well-Platte zu bestimmen, normalisiert durch einen PathCheck-Referenzwert von 1 ml Puffer in einer 1-cm-Küvette, beide bei 550 nm. Eine weitere A550-Messung wurde für die 96-Well-Platte ohne PathCheck durchgeführt. Die Plattenweglänge wurde als A550 nm (kein PathCheck)/A550 nm (mit PathCheck) berechnet. Messungen der Weglänge wurden in drei Wiederholungen durchgeführt und die Standardabweichung wurde zur Berechnung des Fehlers verwendet. Wir haben die Weglänge von 200 μl unseres Reaktionspuffers mit 0,531 cm ermittelt.

Nach der Bestimmung des oben Gesagten wurden die Varianzkoeffizienten der Aktivitätsmessungen, die Extinktionskoeffizienten und die Pfadlänge zur Berechnung des Varianzkoeffizienten des Aktivitätsassays verwendet. Der absolute Fehler wurde durch Multiplikation der durchschnittlichen spezifischen Aktivität und des Varianzkoeffizienten des Aktivitätstests berechnet.

Die Proteinprobe wurde zu 1 ml Master-Mix aus Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl und 1 mM FeCy, pH 7,4) gegeben und durch Vortexen gründlich gemischt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von NADH bis zu einer Endkonzentration von 200 µM gestartet. Die Vertiefungen wurden durch Pipettieren und Plattenrühren für 5 Sekunden gemischt, bevor alle 4 Sekunden 3 Minuten lang aufgezeichnet wurde. Die Messungen wurden in vier Wiederholungen durchgeführt.

Der Reaktionsmastermix bestand aus 20 mM HEPES, pH 7,4, 50 mM NaCl, 10 % Glycerin (v/v), 50 U ml-1 Superoxiddismutase, 100 µM DQ, 4 µM KCN, 100 µM des entsprechenden Cyt c, und der entsprechende Atemwegshemmer (1 µM Antimycin A und 20 µM Piericidin A, beide gelöst in DMSO). SC I + III2-Proben wurden der entsprechenden Mischung in einer Menge von 7,6 µg ml−1 (5 nM) zugesetzt, durch Taumeln gemischt und in der 96-Well-Platte auf ein Gesamtvolumen von 200 µl aliquotiert. Jede Reaktion wurde durch Zugabe von 10 µM NADH initiiert und kurz durch Pipettieren gemischt, bevor alle 5 s 10 min lang aufgezeichnet wurde. Die Messungen wurden in drei bis vier Wiederholungen durchgeführt.

Der Reaktionsmastermix bestand aus 20 mM HEPES, 50 mM NaCl, 10 % Glycerin (v/v), 0,1 % BSA (w/v), 0,1 % CHAPS (w/v), 0,1 % Digitonin (w/v) und 100 μM DQ, pH 7,4. Gewaschene Mitochondrienmembranen von V. radiata oder S. scrofa wurden der entsprechenden Mischung in einer Menge von 40 μg ml–1 zugesetzt, durch Taumeln gemischt und in die 96-Well-Platte auf ein Gesamtvolumen von 200 μl aliquotiert. Für den deaktivierten Zustand für V. radiata wurde die Platte 20 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, wonach 15 μM Piericidin A (oder eine äquivalente Menge DMSO) und 5 μM DeaminoNADH (dNADH; oder eine äquivalente Menge Puffer) hinzugefügt wurden in die entsprechenden Vertiefungen geben und durch Pipettieren mischen. Zehn Sekunden nach dieser Zugabe wurden 2 mM NEM oder Wasser in die entsprechenden Vertiefungen gegeben und durch Pipettieren gemischt. Nach der NEM-Zugabe wurde die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (25 °C) inkubiert und vor Licht geschützt. Die Reaktionen wurden unmittelbar danach durch Zugabe von 100 μM NADH oder 100 μM dNADH in die entsprechenden Vertiefungen gestartet und kurz durch Pipettieren gemischt, bevor alle 4 s 5 Minuten lang aufgezeichnet wurde. Der Assay unter isolierten Bedingungen verwendete einen ähnlichen Aufbau, mit der Ausnahme, dass keine 20-minütige Inkubation bei 37 °C durchgeführt wurde. Die Messungen wurden in vier Wiederholungen durchgeführt. Für S. scrofa-Membranen wurden äquivalente Bedingungen verwendet, mit der Ausnahme, dass Piericidin A und dNADH nicht verwendet wurden. Die Messungen wurden in 6–12 Wiederholungen durchgeführt.

Die Probe für die Gittervorbereitung war eine heterogene Probe, nämlich gepoolte, konzentrierte, gepufferte Fraktionen aus dem Saccharosegradienten: ~1,5 mg ml−1 Protein in 30 mM HEPES, 150 mM Kaliumacetat, 1 mM EDTA und 0,002 % (v/ v) PMSF, pH 7,7. Im letzten Schritt wurde der Probe Digitonin in einer Endkonzentration von 0,2 % (Gew./Vol.) Digitonin zugesetzt. Quantifoil-Kupfergitter mit einer Maschenweite von 1,2/1,3 wurden vor dem Auftragen der Probe 60 s lang einer Glimmentladung bei 30 mA unterzogen. Die Probe (4 µl) wurde bei 10 °C und 90 % Luftfeuchtigkeit auf jedes Gitter aufgetragen und 20 s lang auf dem Gitter inkubiert, bevor sie 4 s lang geblottet und mit einem Leica EM GP2-Tauchfroster in flüssiges Ethan eingefroren wurde.

Mit SerialEM v3.8.5 wurden auf einem 200-kV-Glacios-Mikroskop, das mit einem Quantum-K3-Detektor ausgestattet ist, insgesamt 21.815 hochwertige Filme bei einer Nennvergrößerung von 56.818 (0,44 Å pro Pixel im Superauflösungsmodus) gesammelt. Eine Dosis von 20 Elektronen Å−2 s−1 bei 3 s Belichtung wurde für jeden Film in 75 Bilder aufgeteilt.

Rohe Super-Resolution-Filme wurden zweifach gruppiert, was zu einer Pixelgröße von 0,88 Å führte. Diese Filme wurden mit der patchbasierten Bewegungskorrektur von cryoSPARC bewegungskorrigiert, gefolgt von einer Schätzung der Kontrastübertragungsfunktion pro Mikrograph mit CTFFIND4.1, beide implementiert in cryoSPARC56. Die Partikel wurden zunächst mit dem manuellen Picker von cryoSPARC ausgewählt, der dann zum Trainieren der Topaz57-Implementierung in cryoSPARC in drei Iterationen verwendet wurde. Es folgten eine 2D-Klassifizierung, eine 3D-Ab-initio-Rekonstruktion und eine 3D-Verfeinerung in cryoSPARC. Bei der letzten Topaz-Iteration wurden 593.080 Partikel extrahiert, zweifach heruntergerechnet (Pixelgröße von 1,76 Å) mit 300 Pixel2-Boxen und umfassend 2D-klassifiziert, um 278.675 Partikel entsprechend SC I + III2 und 58.798 Partikel entsprechend CI allein zu ergeben. Diese Partikelsätze wurden dann ohne Downsampling (Pixelgröße von 0,88 Å) mit 600 Pixel2-Boxen erneut extrahiert und in mehreren Runden der Ab-initio-Multimodellgenerierung in cryoSPARC zur Klassifizierung der Partikel verwendet. Diese Runden der Ab-initio-Modellgenerierung entfernten zusätzliche Partikelbilder von schlechter Qualität und führten zu sechs Klassen von SC I + III2-Partikeln (zwei Klassen mit der Ferredoxin-Brücke und vier ohne) und einer einzigen Klasse von CI-Partikeln allein.

Für jede Partikelklasse wurde zunächst eine homogene Verfeinerung mit C1-Symmetrie durchgeführt, gefolgt von iterativen Verfeinerungsrunden mit Defokussierung pro Partikel, Aberrationen höherer Ordnung und Skala pro Partikel. Schließlich wurde eine Runde uneinheitlicher Verfeinerung58 durchgeführt, die zu den endgültigen Karten für jede Klasse führte. Die ausgerichteten, skalierten und korrigierten Partikel aus der am weitesten geschlossenen verbrückten Klasse SC I + III2 (Klasse 1; 123.461 Partikel) wurden in einer Reihe lokaler Verfeinerungen mit Maskierung bestimmter Teile des Komplexes verwendet. Diese lokalen Karten wurden mit dem Phenix-Tool zum Kombinieren von Karten59 zu einer zusammengesetzten Karte kombiniert. Der Zugriff auf alle für die Datenverarbeitung und -verfeinerung verwendeten Softwarepakete mit Ausnahme von cryoSPARC erfolgte über das SBGrid-Konsortium60.

Als Vorlagen wurden Modelle für den peripheren Arm und das proximale Pumpmodul (PP) von V. radiata CI und CIII2 verwendet9,15. Für das distale Pumpmodul (Pd) und die Brückendomänen von CI wurden die A. thaliana-Modelle11 nach der Sequenzkorrektur in V. radiata-Homologe als Ausgangsmodelle verwendet. Diese Modelle wurden in die höchstaufgelösten fokussierten Verfeinerungskarten für den separaten Atommodellaufbau von CI und CIII2 in Coot61 eingepasst. Die Verfeinerung des Modells im realen Raum erfolgte in Phenix59, und die Parameter der atomaren Gruppenverschiebung wurden im reziproken Raum verfeinert. Visualisierungsfiguren wurden in ChimeraX62,63 erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Rohe KryoEM-Mikroaufnahmen, die in dieser Studie verwendet werden, sind in der Datenbank Electron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR) mit dem Zugangscode EMPAIR-11225 verfügbar. Die zusammengesetzte Karte, fokussierte Verfeinerungen und das Modell für das überbrückte SC I+III2 von V. radiata sind in der Electron Microscopy Database (EMDB) und der Protein Data Bank (PDB) mit den Zugangscodes EMD-27934 für das überbrückte zusammengesetzte SC I+III2 verfügbar Karte der Klasse 1 und PDB-8E73 für das Strukturmodell. Weitere Karten sind auf EMDB mit den Zugangscodes verfügbar: EMD-29088 (CI-Bridge-fokussiert); EMD-29089 (CI-Fersenfokus); EMD-29090 (fokussiert auf die distale Pumpendomäne von CI); EMD-29091 (CIII2 fokussiert); EMD-29092 (CI N-Modul fokussiert); EMD-29093 (fokussiert auf die proximale MPP-Domäne von CIII2); EMD-29094 (fokussiert auf die distale MPP-Domäne von CIII2); EMD-29095 (SC I+III2 überbrückt, Klasse 2); EMDB-28798 (brückenlose SC I+III2 Klassen 1); EMDB-29191 (brückenlose SC I+III2 Klassen 2); EMDB-29190 (brückenlose SC I+III2 Klassen 3); EMDB-29203 (brückenlose SC I+III2 Klassen 4); und EMDB-28799 (CI allein). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01373-5

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Referenzen herunterladen

Wir danken R. Murguia, Q. Zhou, H. Tan, K. Campos und allen Labormitgliedern für ihre Beiträge zu den mitochondrialen Isolierungen von V. radiata. Der KryoEM-Datensatz wurde in der UC Davis BioEM Core-Einrichtung gesammelt. Wir danken F. Guo für die hervorragende technische Unterstützung. Dieses Material basiert auf Arbeiten, die vom US-Energieministerium, Office of Science und Office of Basic Energy Sciences unter der Fördernummer DE-SC0022293 unterstützt werden. Dieser Bericht wurde als Bericht über die von einer Behörde der US-Regierung geförderte Arbeit erstellt. Weder die US-Regierung noch eine ihrer Behörden oder ihre Mitarbeiter geben eine Garantie, weder ausdrücklich noch stillschweigend, noch übernehmen sie eine rechtliche Haftung oder Verantwortung für die Richtigkeit, Vollständigkeit oder Nützlichkeit der offengelegten oder dargestellten Informationen, Geräte, Produkte oder Prozesse dass seine Verwendung nicht gegen private Rechte verstoßen würde. Verweise hierin auf ein bestimmtes kommerzielles Produkt, Verfahren oder eine bestimmte Dienstleistung durch Handelsnamen, Marken, Hersteller oder auf andere Weise stellen nicht notwendigerweise eine Billigung, Empfehlung oder Begünstigung durch die US-Regierung oder eine ihrer Behörden dar oder implizieren diese. Die hier geäußerten Ansichten und Meinungen der Autoren geben nicht unbedingt die Ansichten der US-Regierung oder einer ihrer Behörden wieder.

M. Maldonado

Aktuelle Adresse: Department of Plant Biology, University of California, Davis, CA, USA

Abteilung für Molekular- und Zellbiologie, University of California, Davis, CA, USA

M. Maldonado, Z. Fan, KM Abe & JA Letts

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Konzeptualisierung: JAL und MM Methodik: JAL und MM Untersuchung: JAL, MM, KMA und ZF Visualisierung: JAL, MM, KMA und ZF Finanzierungseinwerbung: JAL und MM Projektverwaltung: JAL Betreuung: JAL und MM Schreiben – Originalentwurf: MM Schreiben – Rezension und Redaktion: JAL, MM, KMA und ZF

Korrespondenz mit M. Maldonado oder JA Letts.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Plants dankt Markus Schwarzlander, Ian Møller und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(a) Reinigungstabelle mit detaillierten Angaben zur Proteinkonzentration (mg/ml), der Gesamtaktivität (μmol/min), der spezifischen Aktivität (μmol/(min*mg) und der Wiederfindung (%, normalisiert auf extrahiertes Protein) für jeden Hauptreinigungsschritt. (b ) Complex I (CI)-In-Gel-Aktivitätsassay der in (a) beschriebenen Fraktionen unter Verwendung von blau-nativer PAGE. Lila Banden zeigen CI-Aktivität an. (cd) Saccharosegradientenfraktionierung der Fraktion nach der Konzentration (7 in Panel a) nach Ultrazentrifugation. (c) Saccharose-Gradientenchromatogramm (blaue Linie, Absorption bei 280 nm) und Gesamtaktivität (μmol/min) (grüne Dreiecke, bestimmt mit spektroskopischem Ferricyanid-Assay) für jede Saccharose-Gradientenfraktion. Die gestrichelte Box zeigt gepoolte Fraktionen für die Größenausschlussspalte ( SEC). (d) CI-In-Gel-Aktivitätsassay ausgewählter Fraktionen aus (c). (ef) SEC-Reinigung gepoolter Fraktionen aus (cd). (e) Chromatogramm bei 280 nm und 420 nm. (f) CI-In- Gelaktivitätsassay der aus (e) gesammelten Fraktionen. Fraktionen, die SC I + III2 entsprechen, sind mit einem gestrichelten Kästchen markiert. C, konzentrierte Probe nach SEC; L, laden. Diese Ergebnisse sind repräsentativ für 26 SC I + III2-Präparate.

Quelldaten

(a) Repräsentative mikroskopische Aufnahme von 21.815 gesammelten Exemplaren. Der Maßstabsbalken beträgt 100 nm. (b) Repräsentative 2D-Klassen von SC I + III2-Partikeln. (c) Erste 3D-Klassifizierungs- und Verfeinerungspipeline. Fourier-Shell-Korrelationskurven (FSC) für die einzelnen Klassenverfeinerungen werden für keine (orange), lockere (grün) und enge (blau) Maskierung angezeigt. Angegeben ist die Auflösung, bei der der streng maskierte FSC die Goldstandardgrenze von 0,143 überschreitet (gestrichelte Linie).

Zur Verbesserung der Kartenqualität wurden einzelne maskierte Verfeinerungen mit den in Magenta dargestellten Masken durchgeführt. Fourier-Shell-Korrelationskurven (FSC) für die einzelnen fokussierten Verfeinerungen werden für keine (orange), lockere (grün) und enge (blau) Maskierung angezeigt. Angegeben ist die Auflösung, bei der der FSC mit enger Maske den Goldstandard-Grenzwert von 0,143 (gestrichelte Linie) überschreitet. Die mit grünen Kästchen hervorgehobenen fokussierten Karten wurden zur endgültigen zusammengesetzten Karte des überbrückten SC I + III2 (oben links) kombiniert.

Untereinheiten in farbigen Cartoons über halbtransparenter Dichte in Grau dargestellt.

(a) Sequenzausrichtung der im V. radiata-Proteom annotierten MPP-α-Isoformen. Isoform modelliert in SC I + III2 (LOC106765382) in Blau, Isoform modelliert in SC III2 + IV (entsprechend LOC106774328) in Grau. Transparente braune Box, Signalsequenz. Transparente orangefarbene Box, Schnittstellenreste mit CI's NDUB9. Abweichende Rückstände sind in roter Schrift markiert. Transparenter gelber Kasten, glyreiche Schleife, die an der MPP-Substraterkennung beteiligt ist. (b) Schlüsselregionen der Karte-zu-Modell-Anpassung der für SC I + III2 und SC III2 + IV modellierten MPP-α-Untereinheiten passen in die SC I + III2-Karte. LOC106765382 (SC I + III2) in Blau, LOC106774328 (SC III2 + IV) in Grau. (c) MPP-α-Schnittstelle mit CIs NDUB9. Protein entsprechend LOC106765382 (SC I + III2) in Blau und LOC106774328 (SC III2 + IV) in Grau. (de) MPP-β-katalytische Triade im Protomer proximal zu CI (d) und distal zu CI (e). Beachten Sie die fehlende Dichte für ein mutmaßliches Zn2+.

(ab) Vergleich der Ferredoxinbrücke (gelbe Oberfläche) in V. radiata (a) und T. thermophila (b) (PDB 7TGH13,). Durch CIII2 ausgerichtete Superkomplexe. CI und CIII2 gefärbt wie in (a). (ch) Vergleich der SC I + III2-Schnittstellen zwischen den Arten in V. radiata (c,f), O. aries (d,g PDB 6QC512) und T. thermophila (e,h). Die wichtigsten interagierenden Untereinheiten werden im Cartoon dargestellt. (ce) Matrixschnittstellen mit MPP-α (α) und MPP-β (β), ausgerichtet durch MPP-β. (fh) Membran- und Zwischenmembranraumschnittstellen, ausgerichtet durch NDUA11. Beachten Sie, dass V. radiata QCR7 zum Vergleich angezeigt wird, aber nicht an der Schnittstelle teilnimmt.

(ab) Zusammenfassung der CI-Schleifenkonformationen. (a) Schlüsselschleifen, Helices und β-Stränge, die im Text besprochen werden, dargestellt als farbiger Cartoon über der transparenten SC I + III2-Oberfläche. Der Einschub (gestricheltes Quadrat) ist im Detail in (b) dargestellt. Die Konfiguration jeder Schleife sowie wichtige Reste und Funktionen werden markiert. (cd) Aktivitätsraten für den A/D-Übergang in Membranen von Schweinen (S. scrofa, Schweinesymbol) (c) und V. radiata (Pflanzensymbol) (d). Die Aktivität in Gegenwart oder Abwesenheit von 2 mM NEM, 20 μM Piericidin A, Voraktivierung mit 5 μM NADH oder 5 μM dNADH und thermischer Deaktivierung wird für 4–12 Wiederholungen gezeigt. Die Daten werden als Einzelwerte und Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Statistische Analyse mit einfaktorieller ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Šídák. **, p < 0,01; ****, p < 0,0001. Die Daten sind repräsentativ für zwei vollständig charakterisierte (NADH und dNADH) V. radiata-Mitochondrienmembranisolierungen.

3D-Variabilitätsanalyse aller überbrückten SC I + III2-Partikel von V. radiata (Komponente 000). Der Film zeigt die begrenzte Bewegung zwischen den Matrix- und Membranarmen von CI und die Flexibilität der CI-CIII2-Schnittstelle innerhalb der Membranebene.

3D-Variabilitätsanalyse von V. radiata aller verbrückten SC I + III2-Partikel (Komponente 001). Der Film zeigt die Flexibilität der CI-CIII2-Schnittstelle senkrecht zur Membranebene.

Unbeschnittene blau-native Gele, dargestellt in Extended Data Abb. 1b, d, f.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Maldonado, M., Fan, Z., Abe, KM et al. Pflanzenspezifische Merkmale des respiratorischen Superkomplexes I + III2 aus Vigna radiata. Nat. Pflanzen 9, 157–168 (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-022-01306-8

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Eingegangen: 02. September 2022

Angenommen: 08. November 2022

Veröffentlicht: 29. Dezember 2022

Ausgabedatum: Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-022-01306-8

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