Identifizierung von Antibiotika basierend auf strukturellen Unterschieden in der konservierten Allosterie vom mitochondrialen Häm

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 7591 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Antibiotikaresistenzen (AMR) sind ein globales Gesundheitsproblem. Trotz der enormen Anstrengungen, die im letzten Jahrzehnt unternommen wurden, nimmt die Bedrohung durch einige Arten, darunter die arzneimittelresistente Neisseria gonorrhoeae, weiter zu und wäre nicht mehr behandelbar. Die Entwicklung von Antibiotika mit einem anderen Wirkmechanismus ist dringend erforderlich. Hier haben wir eine allosterische Hemmstelle identifiziert, die in eukaryotischen mitochondrialen Häm-Kupfer-Oxidasen (HCOs), den lebenswichtigen Atmungsenzymen, vergraben ist. Die sterische Konformation um die Bindungstasche von HCOs ist bei Bakterien und Eukaryoten stark konserviert, letztere verfügen jedoch über eine zusätzliche Helix. Dieser strukturelle Unterschied in der konservierten Allosterie ermöglichte es uns, bakterielle HCO-spezifische Inhibitoren rational zu identifizieren: eine antibiotische Verbindung gegen Ceftriaxon-resistente Neisseria gonorrhoeae. Molekulardynamik in Kombination mit Resonanz-Raman-Spektroskopie und Stopped-Flow-Spektroskopie ergab eine allosterische Obstruktion im Substratzugangskanal als Hemmmechanismus. Unser Ansatz eröffnet neue Wege bei der Modulation von Proteinfunktionen und erweitert unsere Möglichkeiten zur Überwindung von AMR.

Antibiotikaresistenzen (AMR) sind ein globales Gesundheitsproblem1. Seit 2013 wurden viele Anstrengungen unternommen, um die Belastung durch AMR-Gefahren weltweit zu verringern, doch die Bedrohungen durch einige Arten nehmen ungeachtet weiter zu: Die arzneimittelresistente Neisseria gonorrhoeae ist eine von fünf dringenden Bedrohungen2,3. Resistenzen gegen Ceftriaxon, in den meisten Ländern die letzte Option für ein empirisches First-Line-Antibiotikum gegen Neisseria gonorrhoeae, wurden gemeldet und treten weiterhin weltweit auf4. Die Gonokokkeninfektion könnte aufgrund eines hohen AMR-Grades unbehandelbar werden, was zu schwerwiegenden Komplikationen führen würde: Unfruchtbarkeit, Eileiterschwangerschaft und vermehrter Übertragung von HIV. Das Auftreten resistenter Krankheitserreger gegen derzeit verfügbare Antibiotika ist sehr alarmierend; Daher ist die Entwicklung von Behandlungsoptionen zur Bekämpfung der Antibiotikaresistenz unerlässlich.

Die Atmungskette hat in jüngster Zeit große wissenschaftliche Aufmerksamkeit als potenzielles Angriffsziel für Antibiotika auf sich gezogen. Als Waffe zur Überwindung antimikrobieller Resistenzen wurden Verbindungen, die auf die Atmungskette abzielen, zugelassen oder befinden sich in klinischen Studien, beispielsweise Medikamente gegen Parasiten, Pilze und insbesondere gegen das arzneimittelresistente Mycobacterium tuberculosis5,6,7,8,9,10. Die meisten von ihnen sind jedoch kompetitive Inhibitoren orthosterischer Stellen. Da Atmungsenzyme lebenswichtig sind, bleibt ihre Kernstruktur im Allgemeinen artenübergreifend erhalten. Strukturelle Ähnlichkeit und Substratgemeinsamkeit mit Wirtsproteinen bergen das Risiko einer Kreuzreaktivität, die eine Ursache für Nebenwirkungen sein könnte11. Daher ist ein allosterischer Inhibitor eine praktikablere Wahl, da allosterische Stellen evolutionär in der Aminosäuresequenz weniger konserviert sind als orthosterische Stellen, was theoretisch die Selektivität verbessert und die Toxizität verringert12,13. Eine systematische und strategische Suche nach allosterischen Inhibitoren, insbesondere gegen Membranproteine, wurde jedoch noch nicht etabliert; Die meisten Atmungsenzyme sind Membranproteine.

HCOs sind terminale Atmungsenzyme, die in allen drei Lebensbereichen vorkommen: Bakterien, Archaeen und Eukaryoten. HCOs nehmen Elektronen aus der Atmungskette auf und reduzieren molekularen Sauerstoff zu Wasser. Diese exergonische Reaktion ist mit dem Pumpen von Protonen durch die Membran gekoppelt, was zur Aufrechterhaltung der Protonenantriebskraft beiträgt, die weiter für die ATP-Produktion verwendet wird14,15,16,17,18. HCOs sind Komplexe mit mehreren Untereinheiten und ihre Zusammensetzung variiert je nach Art; Untereinheit I ist jedoch eine katalytische Untereinheit, die allen HCOs gemeinsam ist. Es enthält ein Low-Spin-Häm und ein zweikerniges Zentrum (BNC), das katalytische Zentrum, das von einem High-Spin-Häm und einem Kupferion gebildet wird. Das Low-Spin-Häm empfängt zunächst Elektronen und überträgt sie zur Reduktion von Sauerstoff an den BNC16,17,18,19.

Eukaryoten entstehen aus der Symbiose zwischen Alphaproteobakterien und Archaeen20. Daher sind die mitochondrialen DNA-kodierten Untereinheiten I bis III der mitochondrialen Cytochrom-C-Oxidase (mtCcO), analog zu eukaryotischen HCOs, Nachkommen der Atmungsenzyme von Bakterien20,21 und funktionell wichtige Reste, und daher bleibt ihre Kernstruktur erhalten, obwohl die Die verbleibenden Rückstände sind nicht gleich. Darüber hinaus verfügt mtCcO von Säugetieren über 10 weitere Untereinheiten, die von genomischer DNA kodiert werden. Die physiologischen Rollen dieser Untereinheiten sind nicht vollständig geklärt16. Auch die Kernstrukturen grundlegender Proteine ​​wie RNA-Polymerasen oder Ribosomen sind bei den Arten ähnlich; Interessanterweise haben sie zusätzliche Untereinheiten erworben, die ihre Funktion entlang der molekularen Evolution modulieren22,23. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die Oberfläche der Kernstruktur von HCOs, die bei Säugetieren von zusätzlichen Helices bedeckt sind, allosterische Stellen enthalten könnte, die ihre Aktivität positiv oder negativ regulieren. Das Vorhandensein einer zusätzlichen Helix im mtCcO von Säugetieren unterscheidet die Taschen von bakteriellem HCO.

In dieser Arbeit identifizieren wir eine allosterische Hemmstelle, die im eukaryotischen mtCcO verborgen ist. Die sterische Konformation um die Bindungstasche von HCOs ist bei Bakterien und Eukaryoten stark konserviert, letztere verfügen jedoch über eine zusätzliche Helix. Der strukturelle Unterschied in der konservierten Allosterie ermöglicht es uns, bakterielle HCO-spezifische Inhibitoren rational zu identifizieren: eine antibiotische Verbindung gegen Ceftriaxon-resistente Neisseria gonorrhoeae.

Um diese Hypothese zu testen, müssen wir zunächst eine allosterische Hemmstelle identifizieren. Wir begannen mit mtCcO-Inhibitoren von Säugetieren, die durch Zufalls-Verbindungsscreening gewonnen wurden. Wir haben zuvor herausgefunden, dass ein endogenes Protein direkt mit mtCcO interagiert und die mtCcO-Aktivität allosterisch moduliert24,25. Dieser Befund veranlasste uns, ein Zufalls-Verbindungsscreening durchzuführen, das die mtCcO-Aktivität moduliert. Wir haben mtCcO-Inhibitoren identifiziert, die sich chemisch von den bekannten Inhibitoren unterscheiden, darunter Kohlenmonoxid, Stickoxid (NO) oder Cyanide. Wir haben mehrere allosterische Inhibitoren ausgewählt, nachdem wir ihre Enzymkinetik untersucht hatten (ergänzende Abbildung 1a – d). Anschließend versuchten wir, komplexe Kristallstrukturen von mtCcO und unseren Inhibitoren zu erhalten. Im Folgenden konzentrierten wir uns auf T113, da seine Bindungsstelle in einer säugetierspezifischen Helix, COX7C, verborgen war (Abb. 1a, b). Röntgenbeugungsdaten mit einer Auflösung von 2,2 Å wurden von einem mit T113 getränkten mtCcO-Kristall erhalten. Unter den gleichen Herstellungsbedingungen haben wir auch die Apostruktur von mtCcO bestimmt (Ergänzungstabelle 1). Die erhaltene komplexe Struktur zeigte eine klare Bindungsstelle für die Verbindung, die im Vergleich zum Protein eine zusätzliche Elektronendichte ergab und eindeutig im mtCcO zu finden war (ergänzende Abbildung 2a). Die Fo(T113)-Fo(DMSO)-Differentialkarte bestätigte, dass diese Elektronendichte nicht von Wasser- oder Lipidmolekülen stammte und den größten Unterschied aufwies (ergänzende Abbildung 2b). Die Bindungstasche unterschied sich von der Bindungsstelle für molekularen Sauerstoff oder Cytochrom C, dem Weg für den Elektronentransferweg, den Protonenweg oder dem Sauerstoffzugangskanal16,19, was darauf hindeutet, dass T113 ein echter allosterischer Inhibitor ist.

eine Röntgenstruktur von mtCcO mit T113. Die bei 1σ konturierte Elektronendichtekarte (2Fo–Fc) ist links dargestellt. Rechts ist das Bandmodell von mtCcO mit T113 in der Kugel dargestellt. T113 war von COX7C (rot) bedeckt und von der Oberfläche verborgen. b T113 war von 4 Transmembranhelices (TM1–3, COX7C) umgeben und von der Oberfläche aus gesehen vom Zwischenmembranraum aus vergraben. Die molekulare Oberfläche des Proteins wird in der Nahaufnahme grau dargestellt. Drei Helices der Untereinheit I, die die allosterische Stelle umgeben, sind dunkelblau dargestellt, die anderen Helices der Untereinheit I hellblau, die Untereinheit COX7C in mtCcO ist rot dargestellt.

Drei von vier Helices, die die allosterische Stelle von mtCcO umgeben, gehören zur Untereinheit I, die in HCOs häufig vorkommt. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die sterische Konformation der Helices in der Nähe des Low-Spin-Häms in bakteriellen HCOs gut konserviert ist (Abb. 2a und ergänzende Abb. 3). Diese Beobachtungen führten uns zu der Annahme, dass wir allosterische Inhibitoren sinnvoll aus Derivaten unserer mtCcO-Inhibitoren filtern könnten, die wahrscheinlich auf die entsprechende allosterische Stelle bakterieller Oxidasen abzielen.

a Allosterische Stellen von mitochondrialem mtCcO (links) und E. coli bo3 UqO (Mitte). Helices der Untereinheit I sind blau dargestellt, TM0 der Untereinheit I violett, Untereinheit COX7C rot und die anderen Helices gelb. Zusammengeführte Ansichten werden angezeigt (rechts) mit E. coli bo3 UqO in Grau. COX7C ist nahe genug, um den Inhibitor abzudecken. Alle Helices in Untereinheit I sind zwischen mtCcO und E. coli bo3 UqO verschmolzen, mit Ausnahme von TM0. b Screening von 434 Chemikalien bei 50 µM gegen E. coli bo3 UqO. Die Daten werden als Durchschnitt eines Duplikats dargestellt. c Dosisabhängige Hemmung der N4-spezifischen enzymatischen Aktivität von bo3 UqO. Die Daten werden als Durchschnittswert technischer Replikate über zwei unabhängige Experimente dargestellt. d Kinetische Analyse von bo3 UqO mit DMSO und 25 µM N4-Molekül. Anpassungslinien werden mithilfe der Michaelis-Menten-Gleichung mit dem nichtkompetitiven Hemmungsmodell berechnet. Die Daten werden als Durchschnittswert der technischen Replikation dargestellt. Die Reproduzierbarkeit wurde durch zwei unabhängige Experimente bestätigt. Quelldaten sind als Quelldatendatei verfügbar.

Zur Erstellung einer benutzerdefinierten Bibliothek verwendeten wir ein In-silico-Verbindungsscreening, das aus zwei mtCcO-Inhibitoren stammte, darunter T113 und T151, die wir im ersten Hochdurchsatzscreening erhalten hatten. Es wurde auch festgestellt, dass T151 die allosterische Stelle bindet (ergänzende Abbildung 1d). Strukturell ähnliche Verbindungen wie diese wurden hauptsächlich durch mehrere ligandenbasierte Suchalgorithmen aus 80 Millionen kommerziell erhältlichen Verbindungen gesammelt. Dann integrierte unser hauseigener Algorithmus sie, ordnete sie und wählte die erste Serie von 285 Verbindungen aus26,27. Wir fügten den zweiten Satz von 149 Verbindungen hinzu, die durch Docking-Simulation ausgewählt wurden, die dieselben 80 Millionen Verbindungen gegen die allosterische Tasche von mtCcO testete. Insgesamt haben wir eine benutzerdefinierte Bibliothek bestehend aus 434 Verbindungen erstellt, die mit hoher Wahrscheinlichkeit an die konservierte allosterische Stelle für HCOs binden. Wir testeten diese Bibliothek gegen mtCcO und als Ergebnis hemmten 47 Verbindungen mtCcO um mehr als 40 % bei 50 µM (11,4 %). 4a).

Wir verwendeten E. coli bo3-Ubiquinoloxidase (bo3 UqO), um unsere Hypothese als bakterielles HCO-Modell zu testen. Unsere benutzerdefinierte Bibliothek wurde gegen bo3 UqO gescreent und wir erhielten 15 Trefferverbindungen, die eine >40 %ige Hemmung für bo3 UqO bei 50 µM zeigten (Abb. 2b). Darunter wurden acht gemeinsame Inhibitoren für mtCcO und bo3 UqO und, was noch wichtiger ist, zwei spezifische Inhibitoren für bo3 UqO erfolgreich erworben (Abb. 2c). Wie erwartet passte einer dieser Inhibitoren, N4, gut zur allosterischen Hemmkurve, die anhand der Michaelis-Menten-Gleichung ermittelt wurde (Abb. 2d).

Um einen direkten Beweis dafür zu erhalten, dass N4 an die entsprechende allosterische Stelle bindet, haben wir die Struktur von N4-gebundenem bo3 UqO mit einem Fab-Fragment bei einer Auflösung von 3,0 Å mithilfe der kryogenen Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) bestimmt (Abb. 3a, ergänzende Abb. 5e– h und Ergänzungstabelle 2). Unter den gleichen Herstellungsbedingungen haben wir auch die Apostruktur von bo3 UqO bei 3, 1 Å bestimmt (ergänzende Abbildung 5a – d). Differentialkarten zwischen Holo- und Apostrukturen zeigten eine explizite zusätzliche Dichte, und diese Dichte war der größte gefundene Unterschied (ergänzende Abbildung 5i). Bemerkenswert ist, dass die Bindungsstelle der Oberfläche ausgesetzt war und an die Transmembranhelix 1 (TM1), TM2 und TM3 der Untereinheit I angrenzte, was unsere Hypothese stark bestätigt (Abb. 3b, c). Es gab Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Asp75, Arg71 und N4. Die elektrostatische Potentialoberfläche der Bindungsstellen zeigte, dass bo3 UqO eine hydrophilere Oberfläche als mtCcO aufweist, was darauf hindeutet, dass es unwahrscheinlich ist, dass hydrophobes T113 an bo3 UqO bindet (Abb. 3d). Mittlerweile ist relativ hydrophiles N4 kein geeignetes Bindemittel für die allosterische mtCcO-Tasche, eine hydrophobere Umgebung, was erklärt, dass N4 ein Derivat von T113 ist, sie sind jedoch gegenseitig ausschließende Inhibitoren für bo3 UqO bzw. mtCcO. Mutanten für Aminosäurereste um den Inhibitor in der Struktur zeigten eine signifikante Änderung der Hemmwirkung, was bestätigte, dass N4 definitiv bo3 UqO an der Tasche bindet (ergänzende Abbildung 5j).

eine Kryo-EM-Dichtekarte (links) und das Bandmodell (rechts) von bo3 UqO im Komplex mit N4 (links rot, rechts Kugel). Die allosterische Stelle von bo3 UqO ist freigelegt. b N4-Molekül in der allosterischen Stelle von bo3 UqO. Die Kryo-EM-Dichtekarte um N4 ist rot dargestellt. Molekulare Wechselwirkungen zwischen Asp75, Arg71 und N4 sind als gepunktete Linien dargestellt. c N4 ist von der Oberfläche aus zugänglich. Die Proteinmoleküloberfläche auf der Fe-Ebene in Häm b ist grau dargestellt. Das gesamte N4-Molekül wurde präsentiert. d Die elektrostatische Potentialoberfläche der allosterischen Stelle von bo3 UqO (links) und mtCcO (rechts). e Wachstumshemmung durch N4 für eine 24-Stunden-Kultur von Wildtyp-E. coli (Wild), bo3 UqO-Knockout-Stamm (Δbo3) und bo3 UqO-abhängigem Stamm (Δbd). f Ein zeit- und konzentrationsabhängiger Lebensfähigkeitstest. Eine gepunktete Linie zeigt die Inokulation an (1 × 105 KBE/ml). Die Daten werden durch biologische Triplikate (e) oder Duplikate (f) bestätigt. Die Farbe der Helices ist dieselbe wie in Abb. 2. Die Quelldaten sind als Quelldatendatei verfügbar.

Ein spezifischer Inhibitor bakterieller HCOs könnte das Potenzial als Antibiotikum haben. Um diese Möglichkeit zu testen, haben wir die Hemmung des E. coli-Wachstums durch N4 untersucht. In E. coli gibt es zwei Zweige für terminale Oxidasen in der Atmungskette, bo3 UqO und Cytochrom-bd-Oxidase (bd UqO). E. coli verwendet bo3 UqO unter aeroben Bedingungen, während es unter hypoxischen Bedingungen als Anpassung an die Umgebung vorzugsweise bd UqO verwendet28. Bei Wildtyp-E. coli gab es keinen Einfluss von N4 auf das Wachstum; Es verringerte jedoch das E. coli-Wachstum im bo3 UqO-abhängigen Stamm signifikant (Abb. 3e). Diese Wachstumshemmung wurde im bo3-UqO-Knockout-Stamm aufgehoben, was bestätigt, dass die Wachstumshemmung durch N4 ein Ergebnis der HCO-Hemmung und kein unspezifischer Effekt war. Um zwischen der bakteriziden und bakteriostatischen Wirkung der Verbindung zu unterscheiden, führten wir einen Koloniezahltest durch und stellten fest, dass die Wirkung unseres Inhibitors N4 auf E. coli bakteriostatisch ist (Abb. 3f).

Um unsere Erkenntnisse zu erweitern, testeten wir als nächstes die Chinol-abhängige NO-Reduktase (bb3 qNOR), ein entferntes Familienmitglied von HCO aus dem pathogenen Bakterium Neisseria. Bei der Gattung Neisseria stellt das Auftreten und die Ausbreitung multiresistenter N. gonorrhoeae ein erhebliches globales Gesundheitsproblem dar29. qNOR reduziert NO zu Lachgas (N2O) und ist ein entscheidendes Enzym bei der Denitrifikation, das Stickstoffverbindungen oxidiert, um unter anoxischen Bedingungen Energie zu erzeugen30. Die bakterielle Denitrifizierung spielt auch eine wichtige Rolle beim Schutz vor exogenem NO, das von Immunzellen des Wirts produziert wird, und ist daher an der Pathogenität mehrerer Bakterienarten beteiligt, darunter N. meningitidis und N. gonorrhoeae31,32. Diese legen nahe, dass qNOR in Neisseria ein Angriffspunkt für Medikamente sein kann. Wir haben N. meningitidis qNOR verwendet, weil die Aminosäuresequenzen von N. meningitidis qNOR und N. gonorrhoeae qNOR zu 98 % identisch sind, insbesondere zu 100 % im Transmembranbereich, und vor allem die Struktur von N. meningitidis qNOR aufgeklärt wurde33. Wir haben bestätigt, dass die sterische Konformation von drei Helices (TM 3–5 in bb3 qNOR) um das Low-Spin-Häm auch in bb3 qNOR konserviert ist (Abb. 4a)34. Für bb3 qNOR verwendeten wir den gleichen Ansatz wie für bo3 UqO. Zuerst haben wir unsere benutzerdefinierte Bibliothek gegen bb3 qNOR gescreent und 52 Trefferverbindungen erhalten, die eine >50 %ige Hemmung von bb3 qNOR bei 50 µM zeigten (Abb. 4b). Unter ihnen fanden wir einen bb3-qNOR-spezifischen Inhibitor, Q275. Q275 kreuzte sich weder mit mtCcO noch mit bo3 UqO (Abb. 4c). Q275 hatte keinen Einfluss auf die Zellatmung von Säugetierzellen und auch nicht auf deren Lebensfähigkeit (Abb. 4d, e). Wir haben bestätigt, dass Q275 einen allosterischen Hemmmodus aufweist (Abb. 4f). Darüber hinaus zeigten Aminosäure-substituierte Mutanten um die entsprechende allosterische Stelle von bb3 qNOR eine erhebliche Veränderung der Hemmwirkung, was bestätigt, dass Q275 an der Tasche an bb3 qNOR bindet (Abb. 4g).

a Die sterische Konformation um das Low-Spin-Häm bleibt in bb3 qNOR (PDB: 6fwf) erhalten. Ein roter Schatten zeigt die allosterische Stelle an, die sich von der Chinol-Bindungsstelle unterscheidet. b Screening von 434 Chemikalien bei 50 µM auf N. meningitidis bb3 qNOR (x-Achse) und E. coli bo3 UqO (y-Achse). Q275 ist ein spezifischer bb3-qNOR-Inhibitor, grün dargestellt. c Dosisabhängige und spezifische Hemmung von Q275 auf die bb3-qNOR-Aktivität. d Q275 hat keinen Einfluss auf die Sauerstoffverbrauchsrate in Säugetierzellen. N = 6 technische Replikate für jede Gruppe und in zwei unabhängigen Experimenten reproduziert. e Q275 zeigt keine Zytotoxizität in Kardiomyozyten von Ratten. NC; DMSO, PC; 1 % Triton X-100. N = 6 technische Replikate für DMSO, 3 für andere Gruppen. Die Reproduzierbarkeit wurde durch zwei unabhängige Experimente bestätigt. f Kinetische Analyse von bb3 qNOR mit DMSO und 10 µM Q275-Molekül. Anpassungslinien werden mithilfe der Michaelis-Menten-Gleichung mit dem nichtkompetitiven Hemmungsmodell berechnet. g Die Wirkung der Aminosäuresubstitution von bb3 qNOR. Die Positionen von Val293, Val289 und Trp334 sind in (a) dargestellt. h Minimale Hemmkonzentration (MHK) von Q275 gegen den N. gonorrhoeae-Referenzstamm WHO F und einen Ceftriaxon-resistenten FC428. Natriumnitrit (20 mM) wurde hinzugefügt, um einen NO-Zustand nachzuahmen. Die Daten repräsentieren doppelte Experimente. i Koloniezählung 24 Stunden nach Q275-Behandlung der N. gonorrhoeae WHO F-, FC428- und norB-defizienten Stämme. Natriumnitrit (20 mM) wurde hinzugefügt, um einen NO-Zustand nachzuahmen. Eine gepunktete Linie zeigt die Inokulation an (5 × 105 KBE/ml). c, f, g Die Daten werden als Durchschnittswert technischer Replikate über drei (f, g) unabhängige Experimente dargestellt. Quelldaten sind als Quelldatendatei verfügbar.

Schließlich testeten wir die antimikrobielle Wirkung von Q275 gegen einen klinisch isolierten Stamm von N. gonorrhoeae, der eine Resistenz gegen Ceftriaxon aufweist (FC428); Die Ausbreitung des superresistenten N. gonorrhoeae ist zu einem ernsten globalen Gesundheitsproblem geworden4. Bemerkenswert ist, dass Q275 antimikrobielle Wirkungen gegen FC428 sowie den Referenzstamm (WHO F) unter NO-herausfordernden Bedingungen (Angriff durch Immunzellen) zeigte und die infektiöse intravitale Umgebung nachahmte (Abb. 4h). Wir haben norB-defiziente, qNOR-kodierende Stämme sowohl im WHO-F- als auch im FC428-Hintergrund etabliert. Unter NO-herausfordernden Bedingungen (20 mM NaNO2) wuchsen norB-defiziente Stämme sowohl in WT als auch in FC428 nicht, was ein weiterer Beleg dafür ist, dass die Wachstumshemmung über qNOR vermittelt wird. Um bei Verwendung dieser norB-defizienten Stämme zwischen bakterizider und bakteriostatischer Wirkung zu unterscheiden, führten wir nach der Exposition gegenüber NaNO2 eine Kolonienzählung durch und stellten fest, dass die gezielte Bekämpfung von qNOR in N. gonorrhoeae bakteriostatisch ist (Abb. 4i). Diese Ergebnisse legen nahe, dass unser Ansatz bei Bedarf einen spezifischen Inhibitor gegen ein pathogenes bakterielles HCO mit einem engen Spezifitätsbereich entwickelt hat, der das therapeutische Potenzial zur Bekämpfung von AMR besitzt.

Als nächstes konzentrierten wir uns auf den Hemmmechanismus. Die Bindungsstelle von T113 auf mtCcO bildete einen schmalen Tunnel, der von insgesamt vier Helices umgeben war (Abb. 1b). Die Fo(T113)–Fo(DMSO)-Differenzkarte zeigte mehrere Unterschiede in der Struktur von mtCcO, die durch die Bindung des Inhibitors ausgelöst werden: die Austrittsstelle des Protonenwegs (Asp50, Asp51), eine Seitenkette von Ser382 von TM10 in der Untereinheit I und die Hydroxyfarnesylethylgruppe von Häm a (Ergänzende Abbildung 2b). Dies sind die Stellen, an denen über strukturelle Veränderungen zwischen der reduzierten und der oxidierten Form von mtCcO berichtet wurde, was die Möglichkeit erhöht, dass T113 mtCcO35 reduziert haben könnte. Um diese Möglichkeit zu testen, haben wir die Signatur von mtCcO analysiert, das durch Dithionit oder T113 reduziert wurde. Im Vergleich zu einem durch Dithionit induzierten vollständig reduzierten Zustand zeigte mtCcO gemischt mit T113 eine minimale Signatur der reduktiven Änderung in der Soret-Bande und einen Anstieg der Absorptionsspektren bei etwa 600 nm, die charakteristisch für reduzierte Häme sind, was darauf hindeutet, dass T113 kein reduktives Reagens ist (Ergänzende Abbildung 6). Daher erklärt die von uns beobachtete Strukturveränderung den Mechanismus der Hemmung nicht vollständig.

Im Mechanismus der Allosterie überträgt eine Effektorbindung das Signal durch einen Übergang von Konformationsensembles an die funktionelle Stelle, die orthosterische Stelle, was aufgrund seines Schnappschusscharakters oder möglicher Einschränkungen bei der Kristallisation oft schwierig durch Strukturanalyse zu erfassen ist36. Um einen mechanistischen Einblick zu erhalten, verwendeten wir daher eine Molekulardynamiksimulation (MD) von mtCcO mit oder ohne Inhibitor. Insgesamt zeigten MD-Simulationen mit dem Inhibitor (Holo-MD) keine signifikante strukturelle Verformung. Bemerkenswerterweise zeigten die durchschnittlichen Trajektorien mit dem Inhibitor, dass TM2 der Untereinheit I, eine der vier Helices, die die Inhibitor-Bindungstasche bilden, sich in die Richtung von TM5/6 beugte, obwohl sich TM3 zwischen den Holo- und Apo-MDs nicht veränderte (Abb . 5a–c). Diese Bewegung deutet darauf hin, dass der Kanal für molekularen Sauerstoff, der hydrophobe Hohlraum zwischen TM2/4 und TM5/6, verengt ist. Das Holo-MD zeigte, dass der Abstand zwischen Glu242 und Ile66, die beide dem Sauerstoffkanal zugewandt sind und einen Teil mit minimalem Querschnitt bilden, in Gegenwart des Inhibitors kleiner wurde. Im Gegensatz dazu änderte sich der Abstand zwischen Ile312 und Val287, die einem Austrittsweg für das produzierte Wasser gegenüberstehen, nicht (Abb. 5c, d). Darüber hinaus führten wir zusätzliche Simulationen mit Ligandenentfernung nach ligandengebundenem MD (Re-apo MD) durch. Re-Apo MD zeigte, dass TM2 sich in die ursprüngliche Apo-Struktur entspannte, obwohl sich die Änderung im Sauerstoffkanal während der Re-Apo MD nicht entspannte, was darauf hindeutet, dass die Wirkung des Inhibitors, der sich neben TM2 befindet, direkter auf TM2 ist als auf der Sauerstoffkanal. Diese Daten legen nahe, dass T113 den Sauerstoffzugang zum BNC beeinträchtigen und dadurch die Enzymreaktion hemmen könnte.

a Achsen von TM2 und 3 in einem repräsentativen Schnappschuss aus einer Flugbahn von Apo-MD, Holo-MD und Re-Apo MD. Die Achsen wurden mit UCSF Chimera-Tools berechnet und durch Zylinder dargestellt. Häm-a- und T113-Moleküle wurden als grüne Stäbchen dargestellt. b Verteilungshistogramme des Winkels für TM2 und 3. c Der fokussierte Bereich in der MD-Simulation. Die Bahnen des Sauerstoffkanals (rot) und des Wasserkanals (grün) wurden von CAVER berechnet und als fortlaufende Kugeln dargestellt. TM1-6 in Untereinheit I ist dunkelblau und die anderen Helices von Untereinheit I sind hellblau, Untereinheit COX7C in mtCcO ist rot und die anderen Helices gelb. d Verteilungshistogramme des Abstands zwischen Glu242-Ile66 im Sauerstoffkanal und des Abstands zwischen Ile312-Val287 im Wasserkanal. Pfeile zeigen die Bewegung von TM2 durch T113 in (a, c). Die Punktlinien in b und d zeigen den Medianwert. e Die angeregten Resonanz-Raman-Spektren bei 441,6 nm von mtCcO-Hämen ((i), (iii)) ohne und ((ii), (iv)) mit N62. Die mtCcO-Probe wurde zweimal mit einem Laser bestrahlt, dazwischen erfolgte eine 10-minütige Dunkelinkubation. Die Spektren ((1); blau) und ((2); grün) wurden bei der ersten 30-minütigen Bestrahlung von 0 bis 3 und 27–30 Minuten erhalten. Nach 10-minütiger Dunkelinkubation wurden die Spektren ((3) schwarz) und ((4) rot) von 0 bis 3 Minuten und von 27–30 Minuten bei der zweiten 30-minütigen Bestrahlung erhalten. Die Laserleistung betrug 1 mW für ((i), (iii)) und 0,1 mW für ((ii), (iv)). f Ein Stopped-Flow-Experiment zeigte, dass N62 die CO-Bindung an CcO fünfmal langsamer hemmte als die Kontrolle. Absorptionsänderungen bei 440 nm sind mit der Bindung von CO an das reduzierte mtCcO verbunden. g Absorptionsänderungen bei 430 nm im Zusammenhang mit der Bindung von CO an das reduzierte Wildtyp-bo3-UqO. Anpassungslinien werden durch ein einphasiges Zerfallsmodell berechnet. Der Datenbereich wird als Standardabweichung von vier Replikaten für CcO und drei Replikaten für bo3 UqO dargestellt. Quelldaten sind als Quelldatendatei verfügbar.

Um zu testen, ob T113 eine allosterische Wirkung im Sauerstoffkanal hat, führten wir Resonanz-Raman-Spektroskopie durch, eine empfindliche Methode zur Erkennung struktureller Veränderungen, die durch Röntgenkristallstrukturanalyse nicht beurteilt werden können. Da T113 eine Autofluoreszenz aufweist, haben wir seine Derivate gescreent und N62 aufgrund seiner höheren Affinität ohne Autofluoreszenz ausgewählt (ergänzende Abbildung 4b, c). Wir haben bestätigt, dass N62 in der Cokristallographie an dieselbe Bindungsstelle gebunden ist (ergänzende Abbildung 4d) und einen kleinen Unterschied in der Hämabsorption um 440 nm ergab, ähnlich wie bei T113 (ergänzende Abbildung 4e). Im Folgenden verwendeten wir N62 für Raman-spektroskopische Analysen. Zuvor wurde berichtet, dass sichtbares Licht die Photoreduktion von mtCcO induziert, wobei Häm a zunächst reduziert wird, gefolgt von Häm a337. Abbildung 4e zeigt die Resonanz-Raman-Spektren von mtCcO mit und ohne N62, wobei der Schwerpunkt auf der Photoreduktion der Häme liegt. Die Resonanz-Raman-Bande bei 1356/1372 cm−1 lässt sich dem ν4-Modus der Häme (Häm a und Häm a3) zuordnen, einem Indikator für den Redoxstatus: 1356 cm−1 für den reduzierten Zustand, 1372 cm−1 für den oxidierter Zustand38. Unter Kontrollbedingungen ohne N62 zeigte die Laserbestrahlung mit einer Laserleistung von 1 mW eine Photoreduktion von Hämen. Als die Bestrahlung gestoppt wurde, bewirkte der verfügbare Sauerstoff eine Wiederherstellung der oxidierten Hämmoleküle und eine Umkehrung der Redoxmarkerbanden. Eine erneute Bestrahlung mit dem Laser zeigte eine erneute Reduktion der Hämmoleküle (Abb. 5e(i)). Im Gegensatz dazu zeigte mtCcO mit N62 ein anderes Photoreduktionsverhalten. Bei N62 konnte eine vergleichbare Reduktion der Hämmoleküle bereits bei einer geringen Laserleistung von nur 0,1 mW beobachtet werden. Bemerkenswert ist, dass das Absetzen der Laserbestrahlung die Reduktionsmarkierungsbande nicht verringerte und eine erneute Bestrahlung einen weiteren Anstieg zeigte (Abb. 5e (ii)). Diese Daten deuten darauf hin, dass N62 die Reoxidation der photoreduzierten Hämmoleküle durch Sauerstoff hemmt. Um die Sauerstoffbindung direkter zu untersuchen, analysierten wir als nächstes den Fe-His-Streckschwingungsmodus (νFe-His) von Häm a3, der Sauerstoffbindungsstelle, bei 215 cm−1, was den 5-koordinierten, reduzierten Zustand von Häm a3 darstellt. Die 215-cm-1-Banden verschwinden, wenn molekularer Sauerstoff an Häm a3 bindet. mtCcO ohne N62 zeigte einen Anstiegs-/Abfallzyklus der 215 cm−1-Bande (Abb. 5e(iii)); mtCcO mit N62 zeigte jedoch einen kontinuierlichen Anstieg der 215-cm-1-Bande (Abb. 5e (iv)), was einen experimentellen Beweis dafür liefert, dass N62 die Bindung von Sauerstoff an Häm a3 hemmt. Die Hemmung der Reoxidation des Häm-a3 durch Sauerstoff senkt die Schwelle der Photoreduktion, was darauf hindeutet, dass die Strukturänderung im mtCcO-Kristall vermutlich durch eine röntgeninduzierte Reduktion während der Datenerfassung verursacht wurde.

Um die Wirkung des Inhibitors auf den Sauerstoffkanal weiter zu verstärken, führten wir ein Stopped-Flow-Experiment durch, bei dem wir den Zugang von Kohlenmonoxid (Alternative zu molekularem Sauerstoff) zum zweikernigen Zentrum direkt beurteilen konnten39. Wie in Abb. 5F gezeigt, hemmte N62 die CO-Bindung an CcO fünfmal langsamer als die Kontrolle. Daher kamen wir zu dem Schluss, dass die allosterische Hemmung im Sauerstoffzugangskanal eine wichtige Rolle bei der Hemmung von mtCcO spielt.

Es ist plausibel, dass die in mtCcO gefundene Allosterie auch zwischen bakteriellen HCOs und ihren Inhibitoren erhalten bleibt. Zu diesem Zweck haben wir einen einzelnen Aminosäureaustausch in den Aminosäuren geschaffen, die dem Sauerstoffkanal von bo3 UqO zugewandt sind, der genetisch manipuliert werden kann. Unter den hergestellten Mutanten verringerten weniger sperrige Substitutionen von Glu286 und Phe112, die Glu242 und Phe67 in mtCcO entsprechen (Abb. 3c und 5c), die Hemmwirkung von N4 (ergänzende Abb. 6c). Um direkte Beweise zu erhalten, führten wir außerdem ein Stopped-Flow-Experiment mit bo3 UqO durch. Da N4 eine Absorption von etwa 400–450 nm aufweist, haben wir für dieses Experiment N62 verwendet. N62 ist ein Derivat von T113 und ein häufiger Inhibitor sowohl für mtCcO als auch bo3 UqO. Zunächst haben wir bestätigt, dass die hemmende Wirkung von N62 auf bo3 UqO ebenso wie bei N4 durch die Mutanten im Sauerstoffkanal verringert wurde (ergänzende Abbildung 6d). Ein Stopped-Flow-Experiment mit bo3 UqO zeigte, dass der Inhibitor auch die CO-Bindung in bo3 UqO verlangsamte, wie dies auch bei mtCcO der Fall war (Abb. 5g). Zusammen mit diesen multimodalen Analysen kommen wir zu dem Schluss, dass unsere HCO-Inhibitoren den Eintritt von molekularem Sauerstoff/NO zum BNC durch eine Konformationsänderung einer Transmembranhelix der Untereinheit I allosterisch behindern und dadurch die HCO-Funktion hemmen.

Medikamente mit einer einzigartigen Wirkungsweise sind von entscheidender Bedeutung für die Erweiterung unserer antimikrobiellen Optionen zur Überwindung antimikrobieller Resistenzen, insbesondere in Fällen, in denen die Krankheitserreger, einschließlich N. gonorrhoeae, Resistenzen gegen alle derzeit verfügbaren Antibiotika entwickelt haben, sich weltweit ausbreiten und nicht mehr behandelbar wären40. Die Atmungskette war ein potenzielles Ziel für die Entwicklung von Antibiotika; Allosterische Inhibitoren sind angesichts der Bedeutung der Atmungskette im Leben wünschenswerter als orthostatische, um das Risiko von Nebenwirkungen zu minimieren. Hier haben wir eine konservierte Allosterie in HCOs und eine zusätzliche Helix identifiziert, die nur in eukaryotischem mtCcO vorkommt. Dieser strukturelle Unterschied in der Allosterie ermöglichte es uns, die spezifischen Inhibitoren für zwei verschiedene bakterielle HCOs zu isolieren, darunter ein Antibiotikum gegen einen Ceftriaxon-resistenten N. gonorrhoeae, einer der fünf dringenden Bedrohungen im Bericht der Centers for Disease Control and Prevention aus dem Jahr 20193 .

Bei dieser Studie handelt es sich um einen Proof of Concept, und der Wirkstoff befindet sich noch im frühen Stadium der Arzneimittelentwicklung; Unsere Erkenntnisse werden jedoch den Weg für die Entwicklung von Antibiotika mit einem anderen Wirkmechanismus ebnen. Der Vergleich der veröffentlichten Strukturen von HCOs ergab, dass die sterische Konformation um das Low-Spin-Häm in allen HCOs aus Bakterien, Hefen, Pflanzen und Säugetieren weitgehend konserviert ist (ergänzende Abbildung 3)41, was darauf hindeutet, dass die allosterische Stelle durch identifiziert wurde uns dürften erhalten bleiben. Daher kann unser Ansatz bei Bedarf spezifische Inhibitoren, potenzielle Antibiotika, für jedes bakterielle HCO mit einem engen Spezifitätsbereich generieren. Die Entwicklung von Wirkstoffen mit schmalem Spektrum steht im Einklang mit der aktuellen Anforderung, die Auswirkungen auf das Wirtsmikrobiom zu minimieren und weit verbreitete Resistenzen zu verhindern42. Die Bekämpfung von HCOs ist möglicherweise nicht einfach, da pathogene Bakterien oft mehrere terminale Oxidasen in ihrer Atmungskette haben. Daher ist ein wünschenswerter HCO-Inhibitor als Antibiotikum derjenige, der speziell auf ein bestimmtes Infektionsstadium abzielt, in dem Krankheitserreger das HCO dringend benötigen, um sich an die Wachstumsumgebung anzupassen43, wie wir in dieser Studie gezeigt haben, dass qNOR ein therapeutisches Ziel für N. gonorrhoeae ist, oder kann mit anderen Antibiotika als Kombinationstherapie eingesetzt werden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Wirkungen des UqO-Inhibitors auf E. coli und des qNOR-Inhibitors auf N. gonorrhoeae beide bakteriostatisch waren. Obwohl die bakterizide Wirkung vorzuziehen scheint, wurde die Überlegenheit der bakteriziden Wirkung gegenüber der bakteriostatischen Wirkung selten dokumentiert44. Weitere Forschung und Entwicklung von HCO-Inhibitoren sind erforderlich, um den klinischen Bereich zu erreichen.

Eine der vier Helices in mtCcO, die die allosterische Tasche umgeben, ist die genomkodierte Untereinheit COX7C, die die Oberfläche bedeckt, als ob sie die allosterische Stelle verbergen würde. Unsere phylogenetische Analyse ergab, dass die allosterische Stelle der alten HCOs freigelegt wurde und während der molekularen Evolution in eukaryontischen, mitochondrialen HCOs versiegelt wurde (ergänzende Abbildung 7). Die eukaryotische spezifische Untereinheit könnte mtCcO vor dem Zugriff auf Inhibitoren schützen, oder es könnte ein endogener Inhibitor vorhanden sein, der die mtCcO-Aktivität zu einem bestimmten Zeitpunkt negativ reguliert. Die evolutionäre Rolle der erworbenen Untereinheit erfordert weitere Forschung.

In Kombination mit Stopped-Flow-Experimenten, Resonanz-Raman-Spektroskopie und Mutantenanalyse kamen wir zu dem Schluss, dass unsere HCO-Inhibitoren den Eintritt von molekularem Sauerstoff/NO zum BNC durch eine Konformationsänderung einer Transmembranhelix der Untereinheit I allosterisch behindern und dadurch die HCO-Funktion hemmen. Insbesondere im Fall von bo3 UqO ist die N4-Bindungsstelle jedoch die Chinol-Bindungsstelle. Die Chinon-bo3-UqO-Struktur bestätigt, dass N4 den Raum einnimmt, an dem das Substrat bindet45. Asp75 und Arg71 sind die gleichen Aminosäuren, die N4 für die molekulare Interaktion verwendet wie Chinon45, was darauf hindeutet, dass N4 bo3 UqO hemmt, indem es die Substratbindung behindert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der von TM0 und TM1–3 von bo3 UqO umgebene Raum sowohl als Substratbindungsstelle als auch als allosterische Hemmstelle fungiert, die wir vorgeschlagen haben. TM0 kommt nur in Chinoloxidasen vor, einschließlich bo3 UqO. Es stabilisiert effektiv hydrophobes Ubiquinol in der Transmembranregion, sodass bo3 UqO als Substrat verwendet werden kann; Die Existenz von TM0 macht die Familie der Ubiquinoloxidasen einzigartig. TM0 kommt in anderen Arten von HCOs nicht vor, in denen sich die von uns vorgeschlagene allosterische Stelle von der Substratbindungsstelle unterscheidet, wie in qNOR gezeigt, das kein TM0 aufweist.

In Bezug auf mtCcO haben wir gezeigt, dass der Hemmmechanismus beim Sauerstoffeintritt eine signifikante Rolle bei der T113- und N62-Hemmung von mtCcO spielt; Es könnten jedoch auch andere Hemmmechanismen beteiligt sein, wie im Fall, den wir für N4 auf bo3 UqO besprochen haben. Wir haben die Strukturveränderung in Asp50/51 und Ser382 in der mtCcO-T113-Kristallstruktur gefunden. Wir kamen aus den folgenden Gründen zu dem Schluss, dass dies durch Photoreduktion während der Probenvorbereitung und durch strahlungsinduzierte Reduktion verursacht wurde. (1) Veränderungen in Asp50/51 und Ser382 finden sich in der reduzierten Form der CcO-Struktur; Die einfache Zugabe von T113 führte jedoch nicht zu einer Reduzierung von CcO (ergänzende Abbildung 6a, b). (2) Laserbestrahlung während der Raman-Datenerfassung verursachte eine CcO-Reduktion. Abbildung 5e legt nahe, dass der mtCcO-Inhibitor die Photoreduktionsschwelle senkte. (3) Die MD-Simulation mit dem Inhibitor verursachte keine strukturelle Veränderung in Asp50/51 (ergänzende Abbildung 6e). Diese Beobachtungen schlossen jedoch nicht die Möglichkeit aus, dass die Bindung von T113 die in Asp50/51 und Ser382 gefundene Strukturveränderung induziert. Die Veränderung dieser Reste könnte das Protonenpumpen oder den Elektronentransfer beeinflussen; Asp50/51 und Ser382 sind wesentliche Reste für das Protonenpumpen, insbesondere in mtCcO, und bilden den H-Kanal, wie von Yoshikawa et al.16 vorgeschlagen, obwohl der H-Kanal nur in mtCcO zu finden ist. Rich und Kollegen wiesen darauf hin, dass der H-Kanal als Dielektrikum fungiert17. Darüber hinaus berichtete die Sharma-Gruppe kürzlich, dass Konformationsänderungen in der Ser382-tragenden Domäne den Elektronentransfer beeinflussen46. Daher kann eine Störung in der Region zu einer Hemmung des Protonenpumpens oder des Elektronentransfers führen. Weitere Studien sind erforderlich.

Unsere MD-Simulation von 100 ns gab uns einen wichtigen Hinweis auf den allosterischen Mechanismus des mtCcO-Inhibitors; Allerdings zeigte Re-apo MD nicht, dass der Sauerstoffkanal Apo entspannt. Möglicherweise ist eine längere MD erforderlich, um molekularmechanistische Details zu klären.

Unser Ansatz kann auf die Suche nach allosterischen Modulatoren in anderen therapeutischen Zielen angewendet werden. Enzyme erwerben im Laufe der molekularen Evolution im Allgemeinen zusätzliche Domänen oder Untereinheiten22,23. Da die Atmungskette in der Bioenergetik grundlegend und lebenswichtig ist, sind auch andere Atmungsenzyme als HCOs bei den Arten konserviert, ebenso wie ihre Kernstrukturen. Die Molekülgröße dieser Atmungsenzyme ist bei Eukaryoten größer als bei ihren bakteriellen Gegenstücken. Sie könnten wahrscheinlich Allosterie innerhalb des Proteins an der Grenze der Strukturen zwischen Eukaryoten und Bakterien enthalten, was zur Entwicklung von Antibiotika führen würde, da die Atmungskette ein bewährtes Angriffsziel für Antibiotika ist. Darüber hinaus könnte jedes grundlegende Molekül, das für das Leben essentiell ist und bei den Arten konserviert ist, ein potenzielles Ziel sein. Außerdem könnten die zusätzlichen Peptide eine positive allosterische Stelle an der Grenze ihrer Kernstruktur enthalten; Ein positiver allosterischer Modulator für die Funktionsverlusterkrankung beim Menschen könnte eine therapeutische Richtung sein.

Im Allgemeinen ist die Suche nach einer allosterischen Stelle eine Herausforderung, da sie für jedes Zielprotein erhebliche experimentelle Arbeit erfordert und sich nur schwer auf andere übertragen lässt. Das Konzept der vergrabenen konservierten Allosterie wird dazu beitragen, einen systematischen Ansatz zu entwickeln, der von Kritikern gewünscht wurde. Die Anzahl der Proteinstrukturen ist durch das Aufkommen der Kryo-EM und jüngste Fortschritte in der Strukturvorhersage wie Alphafold2 und RoseTTAfold47,48 erheblich gestiegen. Der Vergleich von Proteinstrukturen verschiedener Arten, nicht nur statischer Strukturen, sondern auch durch MD erzeugter Ensembles, wird das Auffinden vergrabener konservierter allosterischer Stellen beschleunigen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Studie neue Wege in der Proteinwissenschaft und der therapeutischen Entwicklung eröffnen wird, insbesondere für Antibiotika mit unterschiedlichen Wirkmechanismen.

Rinderherz-Cytochrom-C-Oxidase-Lösung und Kristalle wurden wie in einer früheren Studie beschrieben hergestellt49. Vor dem Einfrieren wurden die Kristalle mit 2 mM Verbindung oder DMSO im Endmedium behandelt.

Röntgenexperimente wurden an den SPring-8-Beamlines BL26B1/B2 durchgeführt. Die Verarbeitung und Skalierung der Beugungsdaten erfolgte mit XDS50. Die Anfangsphase wurde von MOLREP51 unter Verwendung eines Modells des PDB-Codes 5B1A nach Entfernung von Nichtproteinmolekülen berechnet. Um die Dichte zu verbessern und die Modellverzerrung zu beseitigen, wurde die Methode der maximalen Entropie in Phenix52 durchgeführt. Für die Berechnung der Differenzelektronendichtekarte zwischen mit und ohne Verbindung wurde die Fo-Fo-Kartenberechnung in CNS53 mit einem Modell ohne Liganden verwendet. Der Neuaufbau wurde mit COOT54 durchgeführt. Die Modelle wurden mit REFMAC555 und phenix.refine56 verfeinert, wobei die atomaren Parameter von Dr. Tomitake Tsukihara überarbeitet wurden. Um die Modellverzerrung zu beseitigen, wurden alle beim Wiederaufbau verwendeten Elektronendichtekarten mit dem Compound-Omitted-Modell berechnet. Die Elektronendichtekarten wurden mit Replikatproben bestätigt. Die Verfeinerungsstatik ist in Tabelle S1 aufgeführt.

Gereinigtes mtCcO und Verbindungen wurden auf 96-Well-Platten 30 Minuten lang bei 30 °C in Testpuffer (pH 7,4, 50 mM Kaliumphosphat, 0,1 % Rinderserumalbumin, 0,025 % 14:0 Lyso PG) inkubiert. Um die enzymatische Reaktion zu starten, wurde der Mischung reduziertes Cytochrom c (1,5 µM) zugesetzt, dann wurden die Platten mit einem Plattenlesegerät bei 550 nm abgelesen. Die Steigung für 60 s wurde berechnet und die Änderung der mtCcO-Aktivität durch Vergleich mit der DMSO-behandelten Probe als Negativkontrolle exportiert.

mtCcO-Lösungen für die Spektroskopie wurden auf 15 µM mtCcO mit und ohne 50 µM N62 in 60 mM Natriumphosphatpuffer und 0,2 % n-Decyl-β-d-maltosid (pH 6,8) hergestellt und ihre Spektren wurden bei 4 °C gemessen, sofern nicht anders angegeben . Absorptionsspektren wurden in einer 3-mm-Pfadküvette mit einem Spektrophotometer (Lamda650, PerkinElmer) gemessen. Die Spektren wurden mit äquivalenten Absorptionswerten von 1 cm dargestellt. Oxidiertes mtCcO wurde unter Luft und Dithionit-reduziertes mtCcO unter N2 gemessen. Resonanz-Raman-Spektren wurden in einer rotierenden Zelle bei 2000 U/min und einer Anregungswellenlänge von 441,6 nm (ein HeCd-Laser, Kimmons) gemessen. Raman-gestreutes Licht wurde mit einem Raman-Spektrometer (500M, SPEX) erfasst, das mit einem CCD (Symphony II, Horiba) mit einer 90°-Streuungsgeometrie ausgestattet war. Eine ruhende oxidierte mtCcO-Lösung für Raman-Messungen wurde vorbereitet und bei einem Sauerstoffgehalt unter 100 ppm in die mit einem Gummiseptum versiegelte Rotationszelle in einer Handschuhbox (MM3-H60S, MIWA) überführt. Der verwendete Puffer und das Gummiseptum wurden entgast und über Nacht in der Handschuhbox inkubiert. Die so hergestellte Probenlösung enthielt nur eine geringe Menge Restsauerstoff, was die Beobachtung eines fünffach koordinierten, reduzierten Häm-a3-Anteils bei der Photoreduktionsmessung gewährleistete, während gleichzeitig eine sofortige vollständige Oxidation des gesamten Häm-a3 vermieden wurde.

Das Modellsystem wurde aus der reduzierten Rinder-mtCcO-Kristallstruktur (PDB-ID-Code 3AG2) konstruiert, um MD-Simulationen für alle Atome durchzuführen. Alle in der Atomstruktur des PDB-ID-Codes 3AG2 vorhandenen Kristallwassermoleküle wurden entfernt. Die fehlenden Wasserstoffatome der Systeme wurden mit dem Programm tleap in AmberTools 2020 hinzugefügt (Ref: https://ambermd.org/CiteAmber.php). Das Kraftfeld Amber ff14SB für Proteine, Wasser und Ionen57 und das Kraftfeld Amber Lipid14 für Lipide58 wurden in den MD-Simulationen übernommen. Das gesamte 13-Untereinheiten-monomere mtCcO wurde unter Verwendung von CHARMM-GUI59 in eine Lipiddoppelschicht eingetaucht, die aus 50 % Phosphatidylcholin und 50 % Phosphatidylethanolamin bestand. Das Protein mit Lipiddoppelschichten wurde dann mit dem TIP3P-Wassermodell in rechteckigen Kästen solvatisiert. Die Kästen wurden mit einem Abstand von 20 Å zu jedem Protein hergestellt, um künstliche Effekte durch periodisch wiederholte Bilder zu vermeiden. Die Parameter für Metallzentren und Aminosäuren stammen aus einer früheren Studie60. Kurz gesagt wurden CuA und Häm a oxidiert und Häm a3 und CuB reduziert. Die Protonierungszustände der Reste wurden mit der elektrostatischen Kontinuumsmethode bestimmt. Die Protonierungszustände der wichtigen Reste sind wie folgt: Alle Propione der Häme a und a3 wurden deprotoniert, Arg438 und 439 wurden deprotoniert, Asp364 und Glu242 wurden deprotoniert, His290 und His291 wurden in der δ-Position protoniert. Um jedes System mit Gegenionen zu neutralisieren, wurden einige Wassermoleküle zufällig ausgewählt und durch eine Reihe von Na+- oder Cl−-Ionen ersetzt. Für Coulomb-Wechselwirkungen wurde die Partikelnetz-Ewald-Methode (PME) eingesetzt61. Alle MD-Simulationen wurden mit der Software GROMACS 201962 durchgeführt. Das gesamte Membran-Protein-Lösungsmittel-System bestand aus 302.004 Atomen für Apo-MD und 302.029 Atomen für Holo-MD. Die MD-Simulationen wurden unter einem konstanten NPT-Ensemble (300 K und 1 atm) mit einem Zeitschritt von 2 fs durchgeführt.

Die folgenden Behandlungen (a–c) wurden in Betracht gezogen, um jedes System ins Gleichgewicht zu bringen: (a) Die Energieminimierung wurde für 10.000 Schritte durchgeführt. (b) Eine 100 ps MD-Äquilibrierung wurde mit dem V-Rescale-Thermostat63 bei 300 K unter 1 atm durchgeführt, und (c) eine 100 ps MD-Äquilibrierung wurde mit der Berendsen-Kupplung64 bei 300 K unter 1 atm durchgeführt. Jeder Schnappschuss wurde alle 1 ps65 aufgezeichnet. Schließlich wurde eine 100-ns-MD-Simulation unter einem Ensemble mit konstantem NPT (300 K und 1 atm) als Produktionsläufe durchgeführt und die letzten 80 ns wurden als Analysen verwendet. Um statistisch zuverlässige Flugbahnen zu erhalten, haben wir drei Durchläufe mit unterschiedlichen Anfangsgeschwindigkeiten für die Apo- oder Holostrukturen durchgeführt.

Für die erste Gruppe haben wir den Tanimoto-Koeffizienten zwischen vier mtCcO-Inhibitoren und jeder der 80 Millionen kommerziell erhältlichen Verbindungen auf der Grundlage von 2D-Fingerabdrücken (MACCS-Schlüssel, ECFP4, FCFP4 und GpiDAPH3) und 3D-Formmetriken (ComboScore) mit der Software berechnet Pipeline Pilot (BIOVIA, Dassault Systèmes), MOE (Chemical Computing Group) und ROCS (OpenEye Scientific Software). Verbindungen mit hohen Tanimoto-Koeffizientenwerten wurden anhand des ECFP4-Fingerabdrucks geclustert, und dann wurden Verbindungen in der Mitte jedes Clusters für den Enzymtest ausgewählt. Für die zweite Gruppe wurde die mtCcO/T113-Komplexstruktur mithilfe eines Vorbereitungsassistenten in der Schrödinger-Suite 2016-1 (Schrödinger, LLC) entsprechend vorbereitet und anschließend eine Rezeptorgittergenerierung für das Docking-Protokoll durchgeführt. 80 Millionen kommerziell erhältliche Verbindungen wurden mit Glide 7.0 einem molekularen Docking gegen mtCcO unterzogen. Die auf der Grundlage des Glide-Scores ausgewählten Verbindungen, die im Komplex den gleichen Platz wie T113 einnehmen, wurden anhand des ECFP4-Fingerabdrucks geclustert, und dann wurden die Verbindungen in der Mitte jedes Clusters für den Enzymtest ausgewählt. Schließlich wurden 434 Verbindungen ausgewählt und gekauft.

Das Plasmid, das bo3 UqO mit einem Carboxylterminus-His-Tag an der Untereinheit II kodiert, war ein Geschenk des Gennis-Labors66. bo3 UqO wurde auf der Grundlage der zuvor beschriebenen Methode67 gereinigt. Kurz gesagt, das Plasmid wurde in den Stamm C43 (DE3) Δcyo E. coli transformiert und die Zellen wurden in einem M63-Medium gezüchtet. bo3 UqO wurde durch 1 % n-Dodecyl-β-d-maltosid (C12M) solubilisiert und mit TALON-Harz, Super-Q-Harz und Größenausschlusschromatographie gereinigt und dann in einem Puffer mit 25 mM Tris-HCl, 200, gelagert mM NaCl und 0,02 % C12M (pH 7,5) in einer Konzentration von 10–15 mg/ml.

Das gereinigte E. coli bo3 UqO wurde in Liposomen rekonstituiert (Eigelb-Phosphatidylcholin: E. coli polares Lipid = 3:1). Weibliche BALB/c-Mäuse wurden fünfmal mit 0,1-mg-Dosen des rekonstituierten bo3-UqO mit 50 µg Lipopolysaccharid in Abständen von 7 Tagen immunisiert. Aus der Milz der immunisierten Mäuse wurden Einzelzellsuspensionen hergestellt und die Zellen mit P3U1-Myelomzellen unter Verwendung der herkömmlichen Polyethylenglykol (PEG)-Methode fusioniert68. Das Screening von Antikörpern wurde mit drei Methoden durchgeführt: Liposomen-Enzym-Immunoassay (L-ELISA), denaturierter ELISA (D-ELISA) und Größenausschlusschromatographie (SEC)69. Für den L-ELISA wurde das gereinigte bo3 UqO in Liposomen mit Biotinyl-PE rekonstituiert und auf Immobilizer-Streptavidin-Platten (Nunc) immobilisiert. Hochaffine Antikörper, die stabile Komplexe mit dem gereinigten bo3 UqO bildeten, wurden von SEC auf einer Superdex 200 5/150-Säule (GE Healthcare) selektiert. Antikörper, die die native Konformation von E. coli bo3 UqO erkannten, wurden mittels D-ELISA mit SDS-denaturiertem E. coli bo3 UqO getestet. Drei ausgewählte Klone wurden durch die Methode der limitierenden Verdünnungskultur isoliert und es wurden monoklonale Hybridomzelllinien etabliert, die Anti-bo3-UqO-Antikörper produzieren. Das Fab-Fragment eines monoklonalen Anti-bo3-UqO-Antikörpers wurde wie beschrieben hergestellt69. Die gereinigten bo3-UqO-Proteine ​​wurden 24 Stunden lang bei 4 °C mit dem Fab-Fragment gemischt, und die bo3-UqO-Fab-Komplexe wurden durch SEC gereinigt, gefolgt von einer Inkubation mit N4. Wir haben drei Klone mittels Kryo-EM getestet und den einen für die Strukturbestimmung ausgewählt.

Gereinigtes UqO und Verbindungen wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen bei 25 °C 60 Minuten lang in Testpuffer (pH 7,4, 50 mM Kaliumphosphat, 1 mM Ethylendiamin-N',N',N',N'-tetraessigsäure (EDTA) inkubiert ), 0,1 % Rinderserumalbumin, 0,15 % C12M). Um die enzymatische Reaktion zu starten, wurden der Mischung reduzierte 40 µM UQ-1 zugesetzt, dann wurden die Platten mit einem Plattenlesegerät bei 278 nm abgelesen. Die Steigung wurde berechnet und die Änderung der enzymatischen Aktivität durch Vergleich mit der DMSO-behandelten Probe als Negativkontrolle exportiert.

Eine 3-µL-Probe wurde auf ein glimmentladenes Quantifoil-Gitter (R1.2/R1.3 300 Mesh, Kupfer) aufgetragen, in 100 % Luftfeuchtigkeit bei 8 °C geblottet und mit Vitrobot MkIV in flüssiges Ethan getaucht. Die Kryo-EM-Analyse wurde zunächst mit einem Talos Arctica-Mikroskop bei 200 kV und einem Falcon3-Detektor am KEK durchgeführt. Die Datenerfassung erfolgte mit einem Glacios-Mikroskop mit einem Gatan K2 Summit-Detektor im Zählmodus bei RIKEN SPring-8. Die Filme wurden bei 45.000-facher Vergrößerung mit einer akkumulierten Dosis von 50,0 Elektronen pro Å2 über 40 Bilder aufgenommen. Die Pixelgröße betrug 0,889 Å. Die Daten wurden automatisch mit der Beam-Image-Shift-Methode unter Verwendung der SerialEM-Software70 erfasst.

Die Kryo-EM-Datenverarbeitung wurde mit RELION 3.171 durchgeführt. Rohe Filmstapel wurden mit MotionCor272 der RELION-eigenen Implementierung bewegungskorrigiert. Die CTF-Parameter wurden mit dem CTFFIND4-Programm73 ermittelt. Die Datenverarbeitungsabläufe für UqO (12.388 Filmstapel von Glacios) und UqO/Compound Complex (7173 Filmstapel von Glacios) sind in Abb. S3A – H zusammengefasst. Die endgültige Auflösung wurde durch Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelation (FSC) zwischen den beiden unabhängig verfeinerten Halbkarten (FSC = 0,143) geschätzt. Für die Modellbildung anhand der EM-Karte wurde ein erstes Modell durch Homologiemodellierung mit der MOE-Programmsuite (MOLSIS Inc.) generiert und mithilfe von Chimera74 an die endgültige Karte angedockt. Das Modell wurde dann manuell mit dem COOT-Programm54 verfeinert. Die Realraumverfeinerung im Phenix-Programm wurde mit den atomaren Parametern von Hämen durchgeführt, die gegenüber dem Standardwert überarbeitet wurden52. Eine Zusammenfassung der Modellparameter und der Kryo-EM-Kartenstatistiken finden Sie in Tabelle S2.

E. coli wurde über Nacht in LB-Medium gezüchtet und auf eine OD600 von 0,0132 verdünnt. In jede Vertiefung der 96-Well-Platte wurden 5 µL Zellen gegeben und mit einer Verbindung in Konzentrationen von 128 µg/ml oder zweifachen Reihenverdünnungen in 100 µL LB-Medium behandelt. Anschließend wurden die Platten 24 Stunden lang ohne Schütteln bei 37 °C inkubiert und mit einem Plattenlesegerät bei 600 nm ausgelesen, um das Zellwachstum zu quantifizieren. C43 (DE3)-Färbung und C43 (DE3) Δcyo wurden von Dr. Yoshio Nakatani bereitgestellt und als Wildtyp-Stamm bzw. bo3-UqO-Knockout-Stamm verwendet. C43 (DE3) ΔcydΔappx wurde von Dr. Robert Gennis bereitgestellt und für den bo3 UqO-abhängigen Stamm verwendet. Da N4 bei 32 µg/ml eine Wachstumshemmung durch den obigen Test zeigte, führten wir einen zeit- und konzentrationsabhängigen Lebensfähigkeitstest bei 32, 128 µg/ml N4 durch. Es wurde ein Inokulum mit etwa 1 × 105 KBE/ml hergestellt und dann bei 37 °C ohne Schütteln inkubiert. Die überlebenden Kolonien wurden zu festgelegten Zeitpunkten (12, 24, 48 und 72 Stunden) gezählt.

Neisseria meningitidis bb3 qNOR wurde vom Shiro-Labor bereitgestellt. Expression und Reinigung wurden wie zuvor berichtet mit Modifikation durchgeführt34.

Für die antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung wurden der N. gonorrhoeae-Referenzstamm WHO F75 und ein Ceftriaxon-resistenter FC42876 verwendet. N. gonorrhoeae wurde in GW-Medium unter 5 % CO2 bei 37 °C ohne Schütteln kultiviert77. Wir haben die Medienvorbereitung an das Research Institute for the Functional Peptides Co., Ltd. ausgelagert. Die Mikrobrühe-Verdünnungs-MIC-Methode wurde verwendet, um die antibakterielle In-vitro-Aktivität von Q275 gegen die Bakterienstämme quantitativ zu messen. Die niedrigste Antibiotikakonzentration, die das Wachstum verhinderte, wurde als MHK interpretiert. Dem Medium wurde Natriumnitrit (20 mM) zugesetzt, um einen NO-herausfordernden Zustand (Angriff durch Immunzellen) nachzuahmen. Für den Koloniezahltest haben wir ein Inokulum von etwa 5 × 105 KBE/ml hergestellt und es dann 24 Stunden lang bei 37 °C ohne Schütteln inkubiert. Die überlebenden Kolonien wurden gezählt.

Neisseria gonorrhoeae-Mutanten wurden wie zuvor beschrieben78 konstruiert. Kurz gesagt, um die N. gonorrhoeae-norB-defiziente Mutante zu konstruieren, wurde ein 4,3 kb großes DNA-Fragment aus chromosomaler DNA von N. gonorrhoeae FA1090, das das norB-Gen enthielt, mit den Primern norB-1 und norB-2 durch PrimeSTAR Max DNA-Polymerase amplifiziert ( Takara Bio) und in die SmaI-Stelle des pMW119-Vektors (4,2 kb) (Nippon-Gen) kloniert, um pHT1729 (8,5 kb) zu konstruieren. Die 6,5-kb-DNA-Region von pHT1729 wurde mit den Primern norB-3 und norB-4 durch PrimeSTAR Max-DNA-Polymerase amplifiziert und mit einem Kanamycin-Resistenzgen (kan) ligiert, um pHT1739 zu konstruieren. Ein 3-kb-DNA-Fragment, das das norB-Allel enthielt, in dem das norB-Strukturgen durch das kan-Gen ersetzt wurde, wurde mit den Primern norB-1 und norB-2 von pHT1739 amplifiziert und in N. gonorrhoeae-Stämme und Kanamycin-resistente Klone transformiert ausgewählt, was zu norB-defizienten Mutanten führte. Verwendete Primer sind:

norB-1TCGAGCTCGGTACCCGATGTAGAACTCTTTATCCACTTTCGGCAG

norB-2CTCTAGAGGATCCCCCAGGCGGGCAGCCGCCGTTTCCAACGGTTTG

norB-3GGGAAAACCCTGGCGGTTTTAGCCTGAAAATGGAAACCG

norB-4CATAGCTGTTTCCTGTTTGAGAGCTCCTTTTAATAAATC

Um das vollständig reduzierte Enzym herzustellen, wurde eine Enzymlösung (1 µM mtCcO oder 0,5 µM bo3 UqO), gemischt mit DMSO oder 200 µM N62, abwechselnd unter Vakuumdruck und N2-Atmosphäre inkubiert und dann mit Dithionit reduziert. Eine CO-Lösung wurde durch abwechselndes Inkubieren unter Vakuum und einer 20 % CO-Atmosphäre für mtCcO bzw. 100 % CO für bo3 UqO hergestellt. Um die Bindung von CO an das reduzierte Enzym zu untersuchen, wurden ein gleiches Volumen der reduzierten Enzymlösung und der CO-Lösung in einem Stopped-Flow-Spektrometer bei 4 °C gemischt.

Zur Messung der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) wurde ein XFe96 Extrazellulärer Flussanalysator (Agilent) verwendet. Maus-C2C12-Zellen wurden einen Tag vor der Messung in eine XFe96-Kulturmikroplatte (1,0 × 104 Zellen pro Vertiefung) ausgesät. Die OCR jeder Vertiefung wurde in ungepuffertem DMEM mit 2 mM L-Glutamin und 1 mM Natriumpyruvat unter Basisbedingungen und als Reaktion auf 1 µM Oligomycin A (Oligo A), 2 µM Fluorcarbonylcyanidphenylhydrazon (FCCP) und 0,5 µM gemessen Rotenon + 0,5 µM Antimycin A (Anti/Rote). Die OCR für die ATP-Produktion wurde mit dem Mito Stress Test Report Generator als basale OCR-Oligo-A-OCR berechnet.

Zur Bestimmung der Zytotoxizität von Q275 wurde ein Mikroplatten-LDH-Assay (Cytotoxicity LDH Assay Kit, Dojindo, CK12) verwendet. Bei den verwendeten Säugetierzellen handelte es sich um neonatale Kardiomyozyten von Ratten, die in DMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, kultiviert wurden. Die Zellen wurden in eine mit Gewebekultur behandelte Platte mit 96 Vertiefungen und flachem Boden ausgesät und bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das Medium abgesaugt und durch frisches Medium, das die Testverbindungen enthielt, ersetzt. Nach 24-stündiger Inkubation wurde die LDH-Aktivität im Überstand gemäß den Herstellerangaben bewertet.

Um die Aminosäuresequenz aus der Datenbank zu erhalten, wurde vorzugsweise die Sequenz ausgewählt, deren Kristallstruktur aufgeklärt und in der PDB registriert wurde (PDB-ID wurde angezeigt). Für andere Aminosäuresequenzen wurden gemäß dem vorherigen Bericht repräsentative Sequenzen im Taxon aus den HCO-Enzymtypen A, B, C und NOR ausgewählt41. Diese zeigten wie folgt an: Bos taurus (5B1A_1), Homo sapiens (5Z62_1), Saccharomyces cerevisiae (6T15_11), Pseudomonas stutzeri (3MK7_1), Rhodobacter capsulatus (6XKX_4), Thermus thermophilus (A2: 2YEV_1, ba3: 1EHK_1), Escherichia coli ( 1FFT_1), Bacillus subtilis (bo3: 6KOB_1, aa3: P24010), Mus musculus (BBA31677), Aquifex (A1: O67935, A2: O67937), Rhodothermus marinus (CAC08532), Paracoccus denitrificans (P08305), Yersinia pestis (WP042593520), Pseudomonas aeruginosa (MXH36788), Snodgrassella alvi (WP_100091491), Rickettsiales-Bakterium (MBB19300), Lacrimispora indolis (VDG67555), Halobacterium (WP_010902450), Natronomonas pharaonis (CAA71525), Geobacillus stearothermophilus (3AYG ) und Pseudomonas aeruginosa (3O0R).

Das Alignment mehrerer Aminosäuresequenzen wurde mit Clustal Omega v1.2.1 durchgeführt, nachdem der N-Terminus gekürzt wurde, um die Gesamtlänge des Alignments auszurichten79. Es wurde ein Standardparameter verwendet und die Erhaltung von Regionen, die für den Protonenweg (Protonenkanal) in HCOs wesentlich sind, wie z. B. Metallliganden und die katalytischen Tyrosinreste, wurde visuell bestätigt. Neighbor-Joining (NJ)-Bäume wurden mit dem BioNJ-Algorithmus80 unter Verwendung von PhyML v2016011581 mit den folgenden Parametern abgeleitet: 1000 Bootstraps, 100 Seeds und Korrektur für mehrere Substitutionen. In Dendroskop v3.7582 wurde ein Mehrheitskonsensbaum erstellt und visualisiert.

Mit Ausnahme der SD-Analyse für Abb. 5f, g wurden keine Statistiken angewendet. Die Experimente wurden mindestens zweimal wiederholt und bestätigten die Reproduzierbarkeit.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die Kryo-EM-Karten wurden in der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) unter den Zugangscodes EMD-33293 (apo-bo3 UqO) und EMD-33294 (holo-bo3 UqO) hinterlegt. Die Koordinaten befinden sich in der Proteindatenbank (PDB) unter den Zugangscodes 7XMA (apo-mtCcO), 7XMB (holo-mtCcO), 7XMC (apo-bo3 UqO), 7XMD (holo-bo3 UqO). Zuvor veröffentlichte Zugangscodes, die in dieser Arbeit verwendet wurden, lauten: 5B1A wurde für die Anfangsphasenberechnung im Röntgenbeugungsexperiment verwendet. 3AG2 wurde für die MD-Simulation verwendet. Für ergänzende Abb. 7, 5Z62, 5B1A, 6GIQ, 6KOB, 6WTI, 1QLE, 2YEV, 1EHK, 6XKW, 5DJQ, 3AYG, 3O0R. Quelldaten, die den Abbildungen zugrunde liegen. 2B–E, 3E, 4B–I, 5B, D, F, G, S1A–C, S4A–D, S5D, H, J, S6A–D werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden in diesem Dokument bereitgestellt.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35600-y

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Referenzen herunterladen

Zuallererst danken alle Autoren Dr. Tomitake Tsukihara und Dr. Shinya Yoshikawa für ihre aufschlussreichen Ratschläge und Diskussionen zum Projekt. Wir danken Frau Akiko Ogai sehr für die Hilfe bei der Proteinzubereitung; Frau Satomi Kobayashi, Frau Kanami Inagaki, Frau Keiko Shingu und Frau Satomi Gion für Laborunterstützung; Frau Yuko Okada, Frau Hisae Kawasaki und Frau Yukako Kurokawa für die Unterstützung als Sekretärin; Dr. Yuki Nakamura für die Hilfe bei der Datenerfassung in SPring-8 BL26; Dr. Hiroshi Aoyama für seine Hilfe bei der Kristallpräparation für das Röntgenexperiment; Dr. Takeshi Yokoyama, Dr. Tomomi Uchikubo, Dr. Mikako Shirouzu für die Anleitung zur Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse; Dr. Naruhiko Adachi und Dr. Masato Kawasaki für das erste Screening zur Kryo-EM-Datenerfassung des Bo3-Oxidase-Präparats aus E. coli (unter BINDS 1721); Dr. Robert Gennis und Dr. Sangjin Hong für die Bereitstellung von E. coli-Stämmen und dem E. coli-bo3-Oxidase-Konstrukt; Dr. Yoshio Nakatani für die Bereitstellung von E. coli-Stämmen; Dr. Ken Daniel Inaoka und Dr. Kiyoshi Kita für die Bereitstellung von E. coli-Stämmen und Ratschläge zur bo3-Proteinzubereitung; Dr. Vivek Sharma für seine Hilfe bei der Vorbereitung auf die MD-Simulation; Dr. Hiroshi Sugimoto für Ratschläge zur bo3-Strukturanalyse; Dr. Naoki Mochizuki, Dr. Kazu Kikuchi und Dr. Hajime Fukui für Kommentare zum Manuskript, Dr. James Pearson für die englische Bearbeitung; Frau C. Shintani für ihre Ratschläge zur Figurvorbereitung. Diese Forschung wurde vom Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) unter den Fördernummern JP19am0101113, JP21am0101070, JP20am0101071 unterstützt , JP21am0101082, JP20am0101109, JP20am0101083 (Unterstützungsnummern 1096, 1099, 1721, 2161, 2310 und 2357). Die Synchrotronstrahlungsexperimente wurden am SPring-8 mit Genehmigung des Japan Synchrotron Radiation Research Institute (JASRI) durchgeführt (Vorschlag Nr. 2016A2529, 2016B2711, 2017A2555 und 2017B2721, 2018A2721, 2021B2523, 2022A2713). Diese Arbeit wurde durch Mittel der Japan Science and Technology Agency-Core Research for Evolutional Science and Technology (CREST) ​​unter der Fördernummer JPMJCR14M2 an ST AMED unter der Fördernummer JP19im0210617, JP21ek0109499 und JP22fk0108632 an YShintani unterstützt. JP21fk0108605 an MO Grants-in-Aid for Scientific Research von der Japan Society for the Promotion of Science unter den Grant-Nummern 21H02914 an ST, 21K15443 an YN, 19H05784 an MK und 20K03794 an KK Grants-in-Aid for Innovative Research „Biometal“. Sciences“ unter der Fördernummer 20H05497 an Y. Shigeta.

Hideki Shigematsu

Aktuelle Adresse: Strukturbiologieabteilung, Japan Synchrotron Radiation Research Institute, SPring-8; Sayo, Hyogo, Japan

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Sachiko Yanagisawa, Rikuri Morita.

Abteilung für Molekulare Pharmakologie, Nationales Zentrum für Zerebral- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Suita, Osaka, Japan

Yuya Nishida, Chisa Nakabayashi, Takemasa Nagao, Tasneem Qaqorh, Yusuke Takahashi, Satoru Yamazaki und Yasunori Shintani

Abteilung für medizinische Biochemie, Graduiertenschule für Frontier Biological Science der Universität Osaka, Suita, Osaka, Japan

Yuya Nishida, Takashi Iwamoto, Chisa Nakabayashi, Hisakazu Kato, Tasneem Qaqorh, Seiji Takashima und Yasunori Shintani

Graduate School of Science, Universität Hyogo, Hyogo, Japan

Sachiko Yanagisawa, Kyoko Shinzawa-Itoh, Waka Matsumura, Kazumasa Muramoto, Yoshitsugu Shiro und Minoru Kubo

Zentrum für Computerwissenschaften, Universität Tsukuba, Tsukuba, Ibaraki, Japan

Rikuri Morita, Ryuhei Harada und Yasuteru Shigeta

RIKEN SPring-8 Center, 1-1-1 Kouto, Sayo, Hyogo, Japan

Hideki Shigematsu, Chai Gopalasingam und Takehiko Tosha

RIKEN-Zentrum für Biosystemdynamikforschung, Yokohama, Kanagawa, Japan

Hitomi Yuki und Teruki Honma

Fachbereich Chemie, Graduate School of Science, Universität Chiba, Inage, Chiba, Japan

Satoshi Ogasawara und Takeshi Murata

Abteilung für Bakteriologie I, Nationales Institut für Infektionskrankheiten, Tokio, Japan

Ken Shimuta, Hideyuki Takahashi, Yukihiro Akeda und Makoto Ohnishi

Forschungszentrum für antimikrobielle Resistenz, Nationales Institut für Infektionskrankheiten, Tokio, Japan

Ken Shimuta

Zentrum für integriertes Lernen in der Grundbildung, Kanagawa Institute of Technology, Atsugi, Kanagawa, Japan

Katsumasa Kamiya

Abteilung für Proteinkristallanalyse, Japan Synchrotron Radiation Research Institute, SPring-8, Sayo, Hyogo, Japan

Nobuhiro Mizuno und Takashi Kumasaka

Abteilung für Mikrobiologie und Infektionskrankheiten, Toho University School of Medicine, Tokio, Japan

Yoshikazu Ishii

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Y. Shintani konzipierte das Projekt und führte das mtCcO-Inhibitor-Screening durch. Y. Shintani und YN entwarfen die experimentelle Strategie und analysierten die Daten. YN führte Röntgenkristallographie, Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse, In-Silico-Verbindungsscreening und die meisten biochemischen Experimente durch. S. Yanagisawa führte Resonanz-Raman-spektroskopische Experimente durch und analysierte die Daten mit WM und MKRM, führte eine MD-Simulation durch und analysierte die Daten mit KK, RH, HY, YN und Y. Shigeta. HS führte die Kryo-EM-Datenerfassung durch und half bei der Datenanalyse. NM und TK trugen zur Kristalldatenerfassung bei und halfen bei der Röntgenstrukturanalyse. KSI stellte während des gesamten Projekts gereinigtes Rinder-mtCcO und mtCcO-Kristalle zur Verfügung. YN führte mit HY unter der Aufsicht von THSO ein In-silico-Verbindungsscreening durch und TM generierte die monoklonalen Antikörper für die Bo3-Oxidase-Kryo-EM-Analyse. KS, HT, YA und MO stellten die N. gonorrhoeae-Stämme bereit und führten die MHK-Bestimmung durch. YI analysierte die N. gonorrhoeae-Experimente und gab dazu Ratschläge. TI führte ein biochemisches Bo3-Experiment durch. CN führte ein biochemisches Experiment mit Neisseria meningitidis bb3 qNOR durch. HK führte eine OCR-Messung mit dem XFe96 Fluxanalyser durch. S. Yamazaki, TN, TQ und YT führten eine Datenanalyse einschließlich phylogener Analyse und Figurenvorbereitung durch. CG, KM, TT und Y.Shiro stellten das bb3-qNOR-Enzym, das Expressionskonstrukt und die experimentelle Einstellung für qNOR zur Verfügung. Y. Shintani, YN hat das Originalmanuskript erstellt. ST half bei der Überarbeitung des Originalmanuskripts und akquirierte Fördermittel. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und bearbeitet.

Korrespondenz mit Yasunori Shintani.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Nishida, Y., Yanagisawa, S., Morita, R. et al. Identifizierung von Antibiotika basierend auf strukturellen Unterschieden in der konservierten Allosterie von mitochondrialen Häm-Kupfer-Oxidasen. Nat Commun 13, 7591 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34771-y

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Eingegangen: 15. Mai 2022

Angenommen: 07. November 2022

Veröffentlicht: 08. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34771-y

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