Die Herstellung und Bewertung von Mückenschutzcremes zum Schutz im Freien

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 2180 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Durch Mücken übertragene Infektionen wie Dengue-Fieber, Malaria, Chikungunya-Fieber usw. sind lästig und können bei den Menschen zu starken Beschwerden führen. Aufgrund der unangenehmen Nebenwirkungen und Toxizität, die mit synthetischen Pyrethroiden verbunden sind, sind Mückenschutzmittel auf N,N-Diethyl-3-methylbenzamid (DEET), N,N-Diethylphenylacetamid (DEPA) und N,N-Diethylbenzamid (DEBA) Basis Produkte entwickelten wir eine auf ätherischen Ölen (EO) basierende Mückenschutzcreme (EO-MRC) mit Nelken-, Citronella- und Zitronengrasöl. Anschließend wurde eine Studie zur Formulierungscharakterisierung, Biowirksamkeit und Sicherheit von EO-MRC durchgeführt. Die Expression von Anti-OBP2A- und TRPV1-Proteinen auf Mückenkopfteilen wurde durch Western Blot untersucht. Für die spezifischen Proteine ​​wurde auch ein In-silico-Screening durchgeführt. Eine FT-IR-Studie bestätigte die chemische Kompatibilität der in der EO-MRC verwendeten EOs und Hilfsstoffe. Das thermische Verhalten der besten EOs und ihrer Mischung wurde durch thermogravimetrische Analyse (TGA) charakterisiert. Die GC-MS-Untersuchung ergab verschiedene chemische Komponenten, die in EOs vorhanden sind. Die Wirksamkeit von EO-MRC korrelierte mit einer auf dem Markt erhältlichen Creme (DBMC) auf Basis von 12 % N,N-Diethylbenzamid (DEBA). Die vollständige Schutzzeit (CPT) von EO-MRC wurde mit 228 Minuten bestimmt. Eine Zytotoxizitätsstudie an der L-132-Zelllinie bestätigte die ungiftige Natur von EO-MRC bei Inhalation. Eine Studie zu akuter Hautreizung, eine Studie zur akuten dermalen Dosistoxizität und eine Studie zu akuter Augenreizung zeigten die ungiftige Natur von EO-MRC. Eine Nichtziel-Toxizitätsstudie an Danio rerio bestätigte, dass EO-MRC für aquatische Nichtzieltiere sicherer ist. Bei Wistar-Ratten, die Transfluthrin (TNSF) ausgesetzt waren, wurde eine Abnahme der Konzentration von Acetylcholinesterase (AChE) beobachtet. Während EO-MRC die AChE-Konzentrationen in den exponierten Tieren nicht veränderte. Die Ergebnisse des Western Blots bestätigten, dass die Anti-OBP2A- und TRPV1-Proteine ​​in TNSF-exponierten Mücken gehemmt waren. Mücken, die EO-MRC ausgesetzt waren, zeigten ein ähnliches Expressionsmuster für Anti-OBP2A und TRPV1 wie die Kontrollgruppe. In-silico-Studien ergaben, dass acht identifizierte EO-Verbindungen eine wichtige Rolle bei der Gesamtabweisungseigenschaft des entwickelten Produkts spielen. Die Studie betont die mückenabweisende Wirkung von EO-MRC, das eine wirksame, umweltfreundliche und sicherere Alternative zu den bestehenden synthetischen Abwehrmitteln für den persönlichen Schutz vor Mücken unter Feldbedingungen sein könnte.

Mücken sind die Hauptüberträger verschiedener Tropenkrankheiten, darunter Malaria, Filariose und Viruserkrankungen wie Dengue-Fieber, Chikungunya-Fieber, West-Nil-Fieber, Gelbfieber und Zika1,2,3,4. Die Verbreitung von Denguefieber durch Aedes aegypti (L.) und Aedes albopictus (Skuse) ist eng mit menschlichen Wohnsitzen in Metropolen verbunden5,6,7. Es wurde dokumentiert, dass durch Mücken übertragene Infektionen eine der Hauptursachen für Krankheiten bei Langzeitauswanderern, Reisenden und im Ausland stationierten Militäreinheiten sind, insbesondere in tropischen und subtropischen Gebieten8. Bei Einsätzen in Malaria-Endemiegebieten in Westafrika, Nordafrika, im Südpazifik und an den Grenzen zwischen China, Burma und Indien während des Zweiten Weltkriegs, des Koreakriegs und in Vietnam wurden verschiedene größere und kleinere Epidemien beim US-amerikanischen und ausländischen Militär registriert Konflikt9,10,11.

Bedauerlicherweise gibt es für die meisten durch Mücken übertragenen Krankheiten weder Impfstoffe noch spezifische Behandlungen12,13. Daher wird der Bevölkerung in Ländern, in denen die Krankheit endemisch ist, dringend empfohlen, Mückenstiche zu vermeiden, vor allem durch das Tragen geeigneter Kleidung und durch die Anwendung topischer Abwehrmittel auf den exponierten Körperteilen14,15,16. Die Vorbeugung von Mückenstichen in Innenräumen kann durch den Einsatz von langlebigen insektiziden Netzen (LLINs) und Indoor Residual Spray (IRS) erreicht werden, einer Leitempfehlung der Weltgesundheitsorganisation (WHO). Elektrische Verdampferformulierungen zur Mückenabwehr sind wirksam bei der Reduzierung der Mückendichte in Innenräumen. Abwehrmittel in Form von Cremes, Gels und Lotionen werden typischerweise auf die exponierte Haut aufgetragen, um sich im Freien vor Mückenstichen zu schützen17. Bei topischen Repellentien handelt es sich in der Regel um schwerflüchtige Verbindungen18, die eine Dampfsperre über der Haut bilden oder langsam in die Umgebungsluft verdunsten und die Arthropoden abwehren19,20. Konvektionsströme, die durch Luftzüge und Bewegungen der Gliedmaßen des Wirts verursacht werden, können die Dämpfe über der exponierten Haut reduzieren18. Repellentverbindungen mit einem hohen Siedepunkt sind aufgrund ihrer unzureichenden Verdunstungsrate nicht für die Herstellung topischer Formulierungen geeignet, wohingegen sich Komponenten mit niedrigen Siedepunkten schnell und einfach verflüchtigen21. N,N-Diethyl-3-methylbenzamid (DEET), N,N-Diethylphenylacetamid (DEPA), Dimethylphthalat (DMP), N,N-Diethylbenzamid (DEBA) und Allethrin werden in den meisten kommerziellen Mückenarten verwendet Abwehrmittelformulierungen11,22, bei denen es sich um langlebige synthetische Chemikalien handelt und die nicht biologisch abbaubar sind23. Ihre höhere Umweltbelastung kann das Ökosystem beeinträchtigen23,24,25. DEET kann Plastik auf Brillen, Armbanduhren usw. auflösen; Es hat einen starken Geruch, der ein öliges und brennendes Gefühl hervorruft und sogar Beschwerden verursachen kann, insbesondere bei der Anwendung in höheren Dosen26. Darüber hinaus geben neue Probleme im Zusammenhang mit der Entwicklung von Resistenzen, Nebenwirkungen, Toxizität für Nichtzielorganismen und ökologischen Bedenken bei diesen synthetischen Repellentien Anlass zu ernsthafter Besorgnis27. Benutzer bevorzugen daher Repellentien mit alternativen Wirkstoffen28.

Pflanzliche ätherische Öle (EOs) bestehen aus verschiedenen chemischen Komponenten, die insektizide, abstoßende und abschreckende Eigenschaften besitzen29. Verschiedene in EOs enthaltene chemische Zusammensetzungen tragen zur Wirksamkeit topischer Mückenschutzformulierungen bei. Studien deuten darauf hin, dass EOs fast so wirksam sein könnten wie DEET29,30,31. Das Center for Disease Control and Prevention in den Vereinigten Staaten empfiehlt aufgrund seiner Wirksamkeit gegen Insekten Zitronen- und Eukalyptusöl als Alternative zu DEET32. Internationale Organisationen wie die Environmental Protection Agency (EPA), die Vereinigten Staaten (US) und die Weltgesundheitsorganisation (WHO) sowie andere Länder haben mehrere EOs für ihre vielfältige Verwendung im Hinblick auf ihre Zugänglichkeit, Verfügbarkeit, Zuverlässigkeit, Wirtschaftlichkeit und geringe Kosten genehmigt Risikobewertung mit komplexer Chemie und unterliegen nicht den bundesstaatlichen Registrierungsanforderungen27,33. Zahlreiche natürliche EO-basierte Produkte werden als Insektenschutzmittel verwendet. Pflanzenprodukte wurden jedoch als sichere und wirksame topische Insektenschutzmittel registriert34, ihre Allergenität, Mutagenität, Genotoxizität und vollständige Schutzdauer sind jedoch immer noch fraglich. Umfangreiche Untersuchungen zu wirksamen, sicheren und umweltfreundlichen topischen Mückenschutzformulierungen für den Außenbereich mit verlängerter Schutzdauer haben nach und nach zugenommen35. Daher haben wir in der vorliegenden Forschung vierzehn EOs auf ihre abstoßende Wirkung gegen Aedes albopictus-Mücken untersucht und eine EO-basierte, länger anhaltende Mückenschutzcreme-Formulierung (EO-MRC) entwickelt, die die beste Mischung von EOs verwendet, nämlich. Citronellaöl, Nelkenöl und Zitronengrasöl. Eine Charakterisierungs-, Wirksamkeits-, Sicherheits- und Toxizitätsstudie des EO-MRC wurde mit einer molekularen Docking-Studie von Silico durchgeführt, um die Bindungsaffinität der EO-Komponenten an die Zielstelle zusammenzufassen. Wir untersuchten auch die Expression von Anti-OBP2A- und TRPV1-Antikörpern im Kopfteil einer Mücke durch Western Blot, was möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Mücken von der exponierten Haut eines Wirts spielt. Zusammenfassend besteht das Hauptziel unserer Studie darin, eine EO-basierte topische Cremeformulierung als Mückenschutzmittel mit reduzierter Toxizität zum Schutz im Freien zu entwickeln und zu charakterisieren.

Der prozentuale Mückenschutz von vierzehn EOs zeigte ihre Wirksamkeit gegen Aedes albopictus (Ae. Albopictus). Die maximale Reaktion war jedoch bei Citronellaöl (95,83 %), Nelkenöl (91,66 %), Lavendelöl (86,95 %) und Zitronengrasöl (95,83 %) im K&D-Modul-Bioassay erkennbar. Zitronengrasöl und Citronellaöl zeigten die höchste Abwehrwirkung, während Basilikumöl die geringste Abwehrwirkung hervorrief (29,16 %). In dieser Studie wurden die vier besten Öle der vierzehn ätherischen Öle im Rahmen des K&D-Moduls weiter auf ihre synergistische Wirkung gegen Mücken hin untersucht. Die Mischung aus Nelkenöl, Citronellaöl und Zitronengrasöl zeigte die höchste Abwehrwirkung (96 %), während die Mischung aus Zitronengrasöl, Lavendelöl und Nelkenöl die geringste Reaktion zeigte (80 %). Die prozentuale Abwehrwirkung für verschiedene Konzentrationen von vierzehn EOs und Mischungen der besten Öle sowie deren ED50 und ED95 sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die chemische Kompatibilität von EOs und Hilfsstoffen zur Verwendung in der EO-MRC wurde durch FT-IR-Spektroskopie bewertet. Die FT-IR-Spektren der Analyten sind jeweils in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt.

Citronella-Öl zeigte charakteristische Peaks bei 791/cm, 1380/cm und 1460/cm für die C-H-Biegung, was möglicherweise auf das Vorhandensein einer 1,2-disubstituierten Alkan- und Aldehydgruppe zurückzuführen ist. Ein Peak bei 1260/cm könnte auf die Anwesenheit von Alkylarylether zurückzuführen sein, ein weiterer Peak bei 1666/cm und 1714/cm könnte auf die Anwesenheit von α,β-ungesättigtem Ester und konjugiertem Keton zurückzuführen sein. Der Peak bei 1844/cm und 2908/cm könnte auf die Anwesenheit von Alkanen zurückzuführen sein, und ein weiterer charakteristischer Peak bei 3425/cm entspricht der Alkoholgruppe. Ein Peak bei 990/cm für C=C-Biegung; 1260/cm für C-O-Streckung; 1714/cm und 1666/cm für C=O-Streckung; 2844/cm und 2908/cm C-H-Streckung; 3425/cm für O-H-Streckung.

Nelkenöl zeigte einen Spitzenwert von 752/cm für die C-H-Biegung; 1308/cm für S=O-Streckung; 1714/cm für C=O-Streckung; 2932/cm für C–H-Streckung; 3472/cm für O-H-Streckung.

Zitronengrasöl zeigte einen Spitzenwert von 791/cm für die C-H-Biegung; 1030/cm für S=O-Streckung; 1284/cm für S=O-Streckung; 1515/cm N–O-Dehnung; 1610/cm für C=C-Streckung; 1746/cm für C=O-Streckung; 2932/cm für C-H-Streckung.

Glycerolmyristat zeigte Spitzenwerte bei 728/cm und 1465/cm ​​für die C-H-Biegung; 1181/cm für C–O-Streckung; 1730/cm für C=O-Streckung; 2844/cm und 2940/cm für die C-H-Streckung bzw. 3322/cm für die N-H-Streckung.

Cetylalkohol zeigte einen scharfen Peak bei 735/cm und 1465/cm ​​für die CH-Biegung; 1069/cm für die CO-Streckung, was auf die Anwesenheit von primärem Alkohol zurückzuführen sein könnte; 2836/cm und 2908/cm für C-H-Streckung, könnte auf die Anwesenheit von Alkan zurückzuführen sein; 3234/cm für O–H-Streckung; 3337/cm für N-H-Streckung.

Stearinsäure zeigte einen Spitzenwert von 754/cm für die CH-Biegung; 1284/cm für C–O-Streckung; 1730/cm für C=O-Streckung; 2971/cm für C–H-Streckung bzw. 3449/cm für O–H-Streckung.

Vanillin zeigte einen Peak bei 735/cm für die CH-Biegung, was möglicherweise auf einige monosubstituierte funktionelle Gruppen zurückzuführen ist; 1260/cm für die CO-Streckung, könnte auf das Vorhandensein einer aromatischen Estergruppe zurückzuführen sein; ein weiterer Peak bei 1515/cm N-O-Streckung; 1595/cm und 1658/cm für C=C-Streckung; 3218/cm für O-H-Streckung.

EDTA zeigte einen Spitzenwert von 776/cm für die C-H-Biegung; 995/cm für C=C-Biegung; 1269/cm für C–O-Streckung; 1412/cm für S=O-Streckung; 1595/cm für N-H-Biegung; 3218/cm für O-H-Streckung.

Methylparaben zeigte einen Peak bei 960/cm für die C=C-Biegung; 1465/cm ​​für C-H-Biegung; 1730/cm für C=O-Streckung; 2916/cm bzw. 3281/cm für C–H-Streckung.

Natriumbenzoat zeigte einen Spitzenwert von 831/cm für die C-H-Biegung; 1061/cm für die CO-Streckung, was auf die Anwesenheit von primärem Alkohol zurückzuführen sein könnte; 1412/cm für O-H-Biegung; 1547/cm für N–O-Streckung; 1603/cm für C=C-Streckung; 3027/cm und 3059/cm für C-H-Streckung; 3624/cm für O-H-Streckung.

Leichtes flüssiges Paraffin zeigte einen Peak bei 1388/cm für die O-H-Biegung; 1460/cm für C-H-Biegung; 2852/cm bzw. 2955/cm C–H-Streckung.

Isopropylmyristat zeigte einen Peak bei 1093/cm für die CO-Streckung; 1380/cm für O-H-Biegung; 1467/cm für C-H-Biegung; 1738/cm für C=O-Streckung; 2860/cm und 2923/cm für C-H-Streckung; 3457/cm für O-H-Streckung.

Dimethicone zeigte einen Peak bei 1061/cm für die CO-Streckung; 1260/cm für C-O-Streckung; 1412/cm für O-H-Biegung; 1929/cm für C-H-Biegung; 2916/cm bzw. 2971/cm für C–H-Streckung.

Vitamin E zeigte einen Spitzenwert von 743/cm für die C-H-Biegung; 1770/cm für C=O-Streckung; 2868/cm für C–H-Streckung; 3504/cm für O-H-Streckung.

Rosmarinöl zeigte einen Spitzenwert von 982/cm für C=C-Biegung, 1465/cm ​​für C-H-Biegung, 1750/cm für C=O-Streckung und 2923/cm für C-H-Streckung.

Polyethylenglykol zeigte einen Peak bei 1308/cm für die CO-Streckung; 1475/cm für C-H-Biegung; 1714/cm für C=O-Streckung, 2844/cm und 2927/cm für C-H-Streckung.

Tween 20 zeigte einen Peak bei 1117/cm für die CO-Streckung; 1722/cm für C=O-Streckung; 2876/cm bzw. 2916/cm für C-H-Streckung.

Glycerin zeigte einen Peak bei 1110/cm für die CO-Streckung, was auf die Anwesenheit von sekundärem Alkohol zurückzuführen sein könnte, und ein charakteristischer Peak bei 1420/cm für die O-H-Biegung könnte jeweils der Alkoholgruppe entsprechen.

Propylparaben zeigte einen Peak bei 960/cm für die C=C-Biegung; 1269/cm für C–O-Streckung; 1436/cm für O-H-Biegung; 1690/cm für C=O-Streckung; 1937/cm für C-H-Biegung, 2964/cm für C-H-Streckung und Spitzenwert bei 3305/cm für O-H-Streckung.

Die physikalische Mischung zeigte einen Peak bei 1085/cm für die CO-Streckung, was auf die Anwesenheit von primärem Alkohol zurückzuführen sein könnte; 1167/cm für die CO-Streckung entspricht der Estergruppe; 1603/cm für C=C-Streckung aufgrund der Anwesenheit eines konjugierten Alkens; 1722/cm für C=O-Streckung; 1921/cm für C-H-Biegung für aromatische Verbindungen; 2852/cm und 2947 für C–H-Streckung; 3600/cm für die O-H-Streckung könnten jeweils auf das Vorhandensein einer alkoholischen Gruppe zurückzuführen sein.

Die FT-IR-Studie bestätigte die Kompatibilität der Formulierungsbestandteile. Die Peaks der physikalischen Mischung waren intakt und korrelierten mit den einzelnen Komponenten und es wurden keine Wechselwirkungen beobachtet.

Die thermische Stabilität von Citronellaöl, Nelkenöl, Zitronengrasöl und deren Mischung wurde durch TGA untersucht und die Ergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung S2 dargestellt. Citronella-Öl zeigte einen Massenverlust von 98,09 % unter 300 °C, der möglicherweise durch die Zersetzung des organischen Inhalts der Probe verursacht wurde. Das Gewicht des Nelkenöls blieb bis zu 60 °C konstant und begann bei 60 bis 171,7 °C mit der Zersetzung/Massenverlust. Im zweiten Gewichtsverlustbereich, von 171,7 bis 599,6 °C, hinterließ Nelkenöl eine Restmasse von jeweils etwa 0,87 %. Zitronengrasöl zeigte eine Zersetzung im Bereich von 60 bis 228 °C. Die Mischung aus Citronella-, Nelken- und Zitronengrasöl zeigte einen ersten Gewichtsverlustbereich von 30 bis 260 °C, in dem alle EO-Komponenten zersetzt wurden. Eine Restmasse von etwa −16,18 % verblieb bei 599,6 °C im zweiten Gewichtsverlustbereich (228–600 °C). Das TGA-Profil für EO-MRC zeigte erhebliche Unterschiede im Gewichtsverlustverhalten. Innerhalb eines Temperaturbereichs von 50 bis 260 °C kann es zu einer Entfernung von mit Wasser beladenen EO-Molekülen aus abstoßenden Cremegrundlagen kommen. Der zweite Gewichtsverlustbereich wurde zwischen 270 und 600 °C nachgewiesen, was möglicherweise auf die Zersetzung der zur Formulierung von EO-MRC verwendeten Hilfsstoffe zurückzuführen ist.

Die Optimierung erfolgte durch Festlegen der Kriterien für Erwünschtheitsfunktionen in der Design-Expert-Software. Mit der Software wurde ein dreidimensionales Antwortflächendiagramm erstellt (Abb. 1), das sehr nützlich ist, um die Interaktionseffekte der Faktoren auf die Antworten zu untersuchen. Reaktionsflächendiagramme beschreiben die Auswirkung verschiedener Faktoren auf die Reaktion zu einem bestimmten Zeitpunkt36. Hier zeigt Abb. 1 die Auswirkung unterschiedlicher EO-Konzentrationen auf die vollständige Schutzzeit (CPT) gegen Mücken. Die optimierte Formel basierte auf den festgelegten Kriterien der maximalen Schutzzeit. Daher wurden siebzehn Cremeformulierungen mit den vorhergesagten Mengen an Formulierungsfaktoren hergestellt. Das nichtlineare computergenerierte quadratische Modell war:

Dabei war „Y“ die vollständige Schutzzeit (CPT), die Antwortvariable, die jeder Faktorstufenkombination zugeordnet ist. und Citronellaöl (A), Zitronengrasöl (B) und Nelkenöl (C) waren die kodierten Niveaus (auf 2 Niveaus; niedriges und ebenso hohes Niveau) abhängiger Variablen.

Von der Software generiertes Reaktionsoberflächendiagramm, das die Auswirkung der ätherischen Ölkonzentrationen (X1, X2) auf die maximale Schutzzeit (Y1) zeigt. Die Optimierung erfolgte mithilfe der Design-Expert-Software (Version 6.0.8, Stat-Ease Inc., USA, https://www.statease.com/software/design-expert/). Die optimale Formulierung basierte auf den festgelegten Kriterien der maximalen Schutzzeit. Wobei CPT vollständige Schutzzeit, CLV Nelkenöl, LMG Zitronengrasöl, CNL Citronellaöl.

Die Variablen wurden zusammen mit ihren Niveaus auf der Grundlage der Ergebnisse vorläufiger Experimente ausgewählt und sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die experimentelle Designmatrix für die Mengen von A, B und C, die zur Vorbereitung jeder der siebzehn von der Software generierten Formulierungen verwendet wurde Die Reaktionen wurden beobachtet. ANOVA wurde mit derselben Software durchgeführt, um die effektivste Formulierung zu erhalten (Tabelle 3). Neun Formulierungslösungen wurden nach 17 Durchläufen, 3 Faktoren und 3 Ebenen im Box-Behnken-Design (BBD) generiert (Tabelle 4). Es wurde festgestellt, dass die beste EO-basierte Mückenschutzcremeformulierung die folgenden Zusammensetzungen aufwies: 8,13 % Citronellaöl, 4 % Nelkenöl und 4 % Zitronengrasöl sowie Hilfsstoffe auf 100 % (w/w) und die optimierte Formel für 50 g EO-MRC sind in Tabelle 5 aufgeführt.

EO-MRC zeigte vielversprechende Ergebnisse gegen Ae. albopictus. Der CPT-Wert für EO-MRC wurde bewertet und mit DBMC verglichen. Die Abwehrwerte wurden mit der Software IBM SPSS Statistics 21 ausgewertet. Durchführen der Kaplan-Meier-Überlebensfunktion. Die CPT für EO-MRC und DBMC wurde mit 228 bzw. 285 Minuten bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 und Abb. 2 dargestellt.

Kumulatives Überleben vs. Zeitdiagramm gegen EO-MRC und DBMC zur Bestimmung der vollständigen Schutzzeit (CPT). Der CPT-Wert wurde für EO-MRC- und DEBA-basierte vermarktete Cremes (DBMC) bewertet. Die Daten wurden mit der Software IBM SPSS Statistics 21 (Version 21.0, 1 New Orchard Road, Armonk, New York 10504-1722, USA, https://www.ibm.com/analytics/spss-statistics-software) ausgewertet. Mithilfe der Kaplan-Meier-Überlebensfunktion wurde die CPT für EO-MRC und DBMC bestimmt.

Basierend auf der GC-MS-Analyse der 14 EOs wurden verschiedene chemische Komponenten identifiziert, von denen bekannt ist, dass sie die wichtigsten chemischen Bestandteile dieser bestimmten Öle sind (Tabelle 7). Wir berichteten über die GC-MS-Ergebnisse für diese vierzehn EOs in unserem vorherigen Forschungsartikel37. Chemische Zusammensetzungen, nämlich Caren, Caryophyllen, Citral, D-Limonen, Betullaöl, Camphen, Carveol, Zimtaldehyd, Caryophyllen, Citronellal, Citronellol, Limonen, Eugenol, Geraniol, Isoneral, Linalool, Longifolen, L-4-Terpeneol und α- Terpineol wurde durch GC-MS identifiziert. Hier führten wir molekulares Docking durch, um uns auf die Bindungsaffinität dieser Chemikalien (Liganden) an die Antennenproteine ​​der Mücken zu konzentrieren. Dies könnte der erste Bericht zu diesem Untersuchungsgebiet sein.

Für Eugenol und Citronellol wurden Kalibrierungskurven mit vier Punkten (Konzentrationen) erstellt (ergänzende Abbildung S3). Der prozentuale Anteil von Eugenol und Citronellol im EO-MRC betrug 60,59 % bzw. 55,08 %. Das GC-MS-Chromatogramm von EO-MRC ist in Abb. 3 dargestellt. Verschiedene chemische Komponenten von EOs, nämlich Caren, Camphen, o-Cymol, D-Limonen, Eukalyptol, Linalool, Citronellal, Isoneral, Isoborneol, L-Alpha-Terpineol Citronellol, Citral, Geraniol, Eugenol, Caryophyllen und Isopropylmyristat wurden im EO-MRC identifiziert.

GC-MS-Chromatogramm von EO-MRC; wobei 1: 3-Caren; 2: Camphen; 3: o-Cymol; 4: d-Limonen; 5: Eukalyptol; 6: Linalool; 7: Citronellal; 8: isoneral; 9: Isoborneol; 10: L-Alpha-Terpineol; 11: Citronellol; 12: Citral; 13: Geraniol; 14: Citral; 15: Eugenol; 16: Caryophyllen; 17: Isopropylmyristat; 18: 1-Hexadecanol; 19: 1-Hexadecanol.

EO-MRC- und Placebo-Formulierungen wurden hergestellt, um eine gleichmäßige und stabile Öl-in-Wasser-Emulsion mit ästhetischem Aussehen zu erhalten. EO-MRC zeigte eine gute Gleichmäßigkeit und Ausbreitungsfähigkeit bei akzeptablem Geruch und Farbe. Der pH-Wert der EO-MRC- und der Placebo-Formulierung betrug 7,3 ± 0,08 bzw. 6,93 ± 0,13. Die Werte für Dichte (1,02 ± 0,01 g/ml) und Viskosität (28.878,33 ± 594,99) zeigten eine ausreichende Stabilität von EO-MRC an (Daten sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt). Darüber hinaus sind Studien zur Auswirkung einer Langzeitlagerung erforderlich, um die Haltbarkeit der Formulierungen zu ermitteln.

Mit steigenden EO-MRC-Konzentrationen wurde ein abnehmendes Muster der Sterblichkeit menschlicher Lungenepithelzellen (L-132) beobachtet, während nach Exposition gegenüber den verschiedenen EO-MRC-Konzentrationen eine deutliche Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen zu verzeichnen war. Abbildung 4 stellt die geschätzte Zelllebensfähigkeit durch MTT-Assay zur Kontrolle (unbehandelt) und 62 µg/ml, 125 µg/ml, 250 µg/ml, 500 µg/ml und 1000 µg/ml der EO-MRC-Formulierung dar L-132-Kulturen. Konzentrationen von 500 µg/ml und 1000 µg/ml führten nachweislich zu einer signifikanten Abnahme (p < 0,001) der Lebensfähigkeit der Zellen, jedoch hemmten 250 µg/ml auch die Lebensfähigkeit der Zellen (p < 0,05) und die EO-MRC-Konzentration betrug 62 µg/ml 125 µg/ml zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu unbehandelten L-132-Zelllinien. ANOVA gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstests, wobei NS = p > 0,05; *p ˂ 0,05; ***p ˂ jeweils 0,001.

Vergleichendes Histogramm der Zelllebensfähigkeitsstudie für EO-MRC bei verschiedenen Testkonzentrationen. Mit steigenden Konzentrationen des EO-MRC wurde ein abnehmendes Muster der Mortalität der menschlichen Lungenepithelzelllinie (L-132) beobachtet. Bei einer EO-MRC-Konzentration von 500 und 1000 µg/ml wurde eine signifikante Abnahme (p < 0,001) der Zelllebensfähigkeit festgestellt. L-132 wurde auch durch 250 µg/ml EO-MRC signifikant (p < 0,05) gehemmt, allerdings zeigten Konzentrationen von 62 und 125 µg/ml keine signifikanten Unterschiede in der Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zu unbehandeltem oder Kontroll-L -132-Zelllinie. ANOVA, gefolgt von Dunnetts mehreren Vergleichstests. Wobei NS = p > 0,05; *p < 0,05; ***p < 0,001.

In der Studie wurden nach 72-stündiger Behandlungsdauer weder in der Placebo- noch in der EO-MRC-behandelten Kaninchengruppe unerwünschte Hautreaktionen wie Erytheme oder Ödeme beobachtet. Allerdings entwickelten Kaninchen in der Positivkontrollgruppe nach 72-stündiger Behandlung schwere Erytheme und Ödeme. Der PII-Wert der mit Placebo und EO-MRC behandelten Gruppen betrug 0, was auf die nicht reizende Natur von EO-MRC hinweist. Die positive Kontrollgruppe zeigte einen PII-Wert von etwa 5,16, was gemäß den Standardrichtlinien auf eine schwere Reizung hinweist (Daten sind in der Ergänzungstabelle S2 verfügbar).

Während des Studienzeitraums wurden keine behandlungsbedingten klinischen Symptome beobachtet. Es traten weder Erytheme oder Ödeme auf, noch war die behandelte Hautstelle abgeschürft. Auch Abweichungen in der Bewegungsaktivität fehlten. Der tägliche Futter- und Wasserverbrauch war normal. Alle Ratten hatten ein normales Körpergewicht und wirkten aktiv und gesund. Histopathologische Beobachtungen der Haut mit normaler Architektur der Epidermis (ED), Dermis (D), Talgdrüse (SG) und Haarfollikeln (HF), dargestellt in Abb. 5a, Kontrollhaut; Abb. 5b EO-MRC-behandelte Haut. Eine wiederholte dermale Behandlung mit EO-MRC hatte im Vergleich zur Kontrollgruppe keine negativen Auswirkungen auf das Körpergewicht und den Futterverbrauch der Tiere. Es wurde festgestellt, dass alle Tiere während des gesamten Untersuchungszeitraums gesund waren.

Histopathologie von Hautgewebe im Rahmen einer wiederholten dermalen Toxizitätsstudie für EO-MRC an Ratten (a) Kontrollhaut; (b) EO-MRC-behandelte Haut. Im Rahmen der histopathologischen Untersuchung wurden bei EO-MRC-exponierten Hautgeweben keine bemerkenswerten Veränderungen beobachtet. Histopathologie des Kiemengewebes von D. rerio (c) Kontrollkieme; (d) EO-MRC freigelegte Kieme; (e) Deltamethrin-exponierte Kieme. EO-MRC-exponierte Kiemen zeigen die gleiche Gewebearchitektur wie die Kontrollgruppe. Die DLM-exponierte Gruppe (Negativkontrolle) zeigt eine Anomalie in der Gewebearchitektur. Weißer Pfeil: Basishyperplasie; EI: Erythrozyteninfiltration; EL: Epithellifting.

Unsere Ergebnisse aus einer Studie zur akuten Augenreizung an Kaninchen kategorisieren EO-MRC als nicht reizend (Abb. 6). Allerdings wurde Capsaicin (negative Kontrollgruppe) als bekannter Reizstoff, der speziell zur Verteidigung verwendet wird, in die Kategorie 2B (gemäß dem UN-GHS-System) eingestuft, da die Reizreaktionen innerhalb von 48 Stunden beobachtet wurden.

Studie zur akuten Augenreizung am Kaninchenauge nach 1 Stunde, 24 Stunden und 48 Stunden bei exponierten Gruppen mit Kontrolle (unbehandelt), EO-MRC und Capsaicin (Negativkontrolle). Capsaicin wurde hier als bekannter Reizstoff verwendet, der insbesondere in Capsigranade unter Verteidigungszwecken verwendet wird und zur Kategorie 2B gehört, da die Reaktion von Tieren umkehrbar ist. Die EO-MRC-exponierte Gruppe war nachweislich nicht reizend für das Augengewebe.

Die häufigsten pathologischen Veränderungen waren Epithellifting, Erythrozyteninfiltration und Basishyperplasie. Bei allen beobachteten morphologischen Veränderungen zeigte Deltamethrin (DLM) schwerwiegendere Auswirkungen auf die Kiemenstruktur. In der EO-MRC-exponierten Gruppe wurde eine minimale Toxizität für das Kiemengewebe beobachtet und durch Erythrozyteninfiltration und Basishyperplasie nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Abb. 5c dargestellt: Kontrollkieme; Abb. 5d EO-MRC freigelegte Kieme; Abb. 5e Deltamethrin freigelegte Kieme.

Am synaptischen Spalt befinden sich AChE-Enzyme, die den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) zu Acetat und Cholin hydrolysieren und die synaptische Übertragung beenden. Veränderungen der AChE-Aktivität können durch die Einwirkung bestimmter Chemikalien oder Insektizide verursacht werden, die als Cholinesterasehemmer wirken. Aus den in Abb. 7a gezeigten Werten ging hervor, dass das Aktivitätsniveau von AChE bei Transfluthrin (TNSF)-exponierten Ratten im Vergleich zur Kontrolle (177 ± 28 Einheiten) signifikant (p < 0,01) abnahm (83 ± 15 Einheiten). Bei EO-MRC-exponierten Ratten wurde keine signifikante Abnahme (p > 0,05) der AChE festgestellt und der Wert betrug jeweils 132 ± 13 Einheiten. ANOVA, gefolgt von Dunnetts mehreren Vergleichstests. Wobei NS = p > 0,05; **p < 0,01.

Eine Veränderung der AChE-Aktivität kann durch die Einwirkung bestimmter Chemikalien oder Insektizide verursacht werden, die als Cholinesterasehemmer wirken. Die meisten EO-Komponenten wurden als AChE-Inhibitoren beschrieben. (a) AChE-Aktivitätstest an Wistar-Ratten nach TNSF- und EO-MRC-Exposition; In der TNSF-exponierten Gruppe wurde eine signifikante Abnahme (p < 0,01) der AChE beobachtet. Die EO-MRC-exponierte Gruppe zeigte keine signifikanten Unterschiede (p > 0,05) in den AChE-Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe; (b) relative Expressionsniveaus von TRPV1 und Anti-OBP2A im Mückenkopfteil nach Exposition gegenüber TNSF und EO-MRC, quantifiziert durch ImageJ. Im EO-MRV-exponierten Mückenkopfteil wurde eine signifikante (p < 0,01) Überexpression von Anti-OBP2A beobachtet (13,02 ± 2,05), im Fall der TNSF-exponierten Gruppe war das Expressionsniveau jedoch gehemmt (p > 0,05). EO-MRC-exponierte Mücken zeigten ähnliche Expressionsniveaus wie die Kontrollmücken (p > 0,05). Ein ähnliches Expressionsmuster wurde auch für TRPV1 aufgezeichnet (p > 0,05). Die TRPV1-Expression war bei TNSF-exponierten Mücken im Vergleich zur Kontrolle geringer (p > 0,05). Bei EO-MRV-exponierten Mücken wurde jedoch eine höhere Expression von TRPV1 beobachtet, es wurde jedoch keine signifikante Veränderung (p > 0,05) in der EO-MRC-exponierten Mückengruppe im Vergleich zur Kontrolle festgestellt. ANOVA, gefolgt von Dunnetts mehreren Vergleichstests. Wobei NS = p > 0,05; **p < 0,01. Original-Blots/Gele sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. S9–Abb. S11.

Die für EO-MRV, EO-MRC, TNSF und Kontrollmücken erhaltenen Proteinkonzentrationen betrugen 7,14 mg/ml, 3,03 mg/ml, 9,146 mg/ml bzw. 3,275 mg/ml. Basierend auf diesen Konzentrationen wurde die Menge jeder Behandlungsprobe, die 50 μg Protein enthielt, berechnet und in die jeweiligen SDS-PAGE-Gele geladen. Basierend auf den oben genannten Konzentrationen wurden daher jeweils 6,68 μl, 16,4 μl, 5,46 μl und 15,26 μl EO-MRV-, EO-MRC-, TNSF- und Kontrollproben für die SDS-PAGE geladen.

Die durch ImageJ quantifizierten relativen Expressionsniveaus von TRPV1 und Anti-OBP2A sind in Abb. 7b dargestellt. Als Kontrolle wurde vor dem Blotting der anderen Antikörper mit dem Haushaltsgen β-Actin experimentiert, das eine ausgeprägte Expression im Kopfteil der Mücke zeigte. Die Expression von Anti-OBP2A betrug 22 kDa und zeigte eine höhere Expression (p < 0,01) im EO-MRV-exponierten Kopfteil der Mücke (13,02 ± 2,05), aber im Fall der TNSF-exponierten Gruppe war das Expressionsniveau gehemmt (3,37 ± 0,93). ), (p > 0,05). EO-MRC-exponierte Mücken zeigten ähnliche Expressionsniveaus (6,6 ± 1,5) wie Kontrollmücken (6,62 ± 1,43), es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet (p > 0,05). Es wurden keine signifikanten Veränderungen (p > 0,05) in der EO-MRC-exponierten Mückengruppe für TRPV1 (2,9 ± 0,28) im Vergleich zur Kontrolle festgestellt. TRPV1 im Kopfteil der Mücke zeigte Banden bei einem erwarteten Molekulargewicht von 100 kDa. In Bezug auf die Bandenintensität zeigte WB, dass die TRPV1-Expression geringer war, jedoch bei TNSF-exponierten Mücken (2,07 ± 0,58) im Vergleich zu den Kontrollproben (3,23 ± 0,88) nicht signifikant (p > 0,05) war. Bei EO-MRV-exponierten Mücken wurde jedoch eine höhere Expression (p > 0,05) von TRPV1 aufgezeichnet (4,95 ± 1,44). ANOVA, gefolgt von Dunnetts mehreren Vergleichstests. Wobei NS = p > 0,05; **p < 0,01.

In molekularen Docking-Studien fanden wir acht Verbindungen, nämlich Betulaöl, Zimtaldehyd, Citronellal, Citronellol, Estragol, Eugenol, Methyleugenol und O-Cymol, die eine bessere Tendenz zur Bindung an das aktive Zentrum aller drei ausgewählten Zielproteine ​​zeigten ( Daten sind in der Ergänzungstabelle S3 verfügbar). Aber im Fall von OBP beider Mückenarten (Aedes und Anopheles) zeigte Betulaöl die besten Ergebnisse mit – CDocker-Energie – 23,5487 kcal/mol bzw. – 22,737 kcal/mol. Im Fall von TRPV1 von Ratten hingegen zeigte o-Cymol die besten Ergebnisse mit einer CDocker-Energie von − 19,981 kcal/mol. Die freien Bindungsenergien der besten Verbindungen gegenüber ihren jeweiligen Zielen sind in der Ergänzungstabelle S4 aufgeführt. Die Wechselwirkungen der drei Verbindungen mit ihren jeweiligen Zielen sind in Abb. 8 dargestellt, wo wir herausfanden, dass Betulaöl (Methylsalicylat) zwei herkömmliche Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen mit Phe123 und Ile125 bildete; eine Kohlenstoff-Wasserstoffbrücken-Wechselwirkung mit Leu124; sechs hydrophobe Wechselwirkungen (P-Pi Stacked, Alkyl und Pi-Alkyl) mit Phe15, His111, Trp114, Tyr122 und Ile125. Betulaöl bildete eine herkömmliche Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkung mit Asn84; eine Kohlenstoff-Wasserstoffbrücken-Wechselwirkung mit Tyr132; sieben hydrophobe Wechselwirkungen (Pi-Pi T-förmig, Amid-Pi gestapelt, Alkyl und Pi-Alkyl) mit Leu72, Tyr73, Val79, Ala121, Ala124, Phe125 und Tyr132 mit OBP von Anopheles-Arten. O-Cymol bildete zwei hydrophobe Wechselwirkungen mit Leu553 und Ile569; und eine Pi-Anion-Wechselwirkung mit Glu570 von TRPV1 von Ratten. Alle diese interagierenden Aminosäurereste sind die Schlüsselkomponenten der gemeldeten aktiven Bindungsstelle der ausgewählten Ziele. Die Wechselwirkungen der verbleibenden Verbindungen wurden in ergänzenden Materialien angegeben (Ergänzende Abbildungen S5 – Abbildungen S7).

Wechselwirkungen von Betulaöl (Methylsalicylat), Zimtaldehyd und Eugenol gegen. Geruchsstoffbindende Proteine ​​(OBP) von Aedes (a), OBP von Anopheles (b) und TRPV1-Proteine ​​von Ratten (c). Betulaöl bildete zwei herkömmliche Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen mit Phe123 und Ile125; eine Kohlenstoff-Wasserstoffbrücken-Wechselwirkung mit Leu124; sechs hydrophobe Wechselwirkungen (P-Pi Stacked, Alkyl und Pi-Alkyl) mit Phe15, His111, Trp114, Tyr122 und Ile125. O-Cymol bildete zwei hydrophobe Wechselwirkungen mit Leu553 und Ile569; und eine Pi-Anion-Wechselwirkung mit Glu570 von TRPV1 von Ratten. Alle diese interagierenden Aminosäurereste sind die Schlüsselkomponenten der gemeldeten aktiven Bindungsstelle der ausgewählten Ziele.

Synthetische Repellentien sind immer problematisch und werden von der Öffentlichkeit negativ wahrgenommen, da sie Nebenwirkungen und Toxizität für Anwender sowie schädliche Auswirkungen auf die Ökologie und Nichtzielorganismen haben38,39,40. EOs sind reich an Terpenoiden und wirken aufgrund ihrer insektiziden und abstoßenden Wirkung gegen Mücken. Sie sind wirtschaftlich, sicher, leicht verfügbar, weniger giftig und verringern aufgrund ihrer komplexen Chemie die Wahrscheinlichkeit einer Resistenz gegen Insekten. In unserer früheren Forschung haben wir über den Anziehungs- und Abwehrtest von vierzehn EOs gegen Musca Domestica unter Verwendung eines „Y“-Röhren-Olfaktometers berichtet. Die Mischung aus Nelken-, Citronella- und Zitronengrasöl zeigte eine maximale Reaktion auf die Flugorientierung. Auch in dieser Studie zeigte die Mischung aus Citronella-, Nelken- und Zitronengrasöl im Rahmen der K&D-Studie die besten Ergebnisse gegen Mücken. Die Wirksamkeit von EO hängt von den verschiedenen Phytobestandteilen ab, die in jedem Öl vorhanden sind.

Bei der Charakterisierung bestätigte die FT-IR-Studie, dass die EOs und andere Hilfsformulierungsbestandteile miteinander kompatibel sind und die Peaks der physikalischen Mischung intakt sind und mit den einzelnen Chemikalien korrelieren. Das TGA-Thermogramm zeigte die Gewichtsverlustraten von EOs als Funktion der Temperaturerhöhung von 30 auf 600 °C. Der anfängliche Gewichtsverlust von Nelkenöl wurde zuvor mit 80–90 °C41 angegeben. In unserer Studie zeigte EO-MRC einen ersten Gewichtsverlustbereich von 50 bis 260 °C, was möglicherweise auf die Entfernung beladener EO-Moleküle mit Wasseranteilen aus den abstoßenden Cremegrundlagen zurückzuführen ist. Der zweite Gewichtsverlustbereich wurde bei 270 bis 600 °C nachgewiesen, was möglicherweise auf die Zersetzung der zur Formulierung von EO-MRC verwendeten Hilfsstoffe zurückzuführen ist. Eine ähnliche Studie wurde von Sattary et al. durchgeführt; stellte ein in Zitronengrasöl und Nelkenöl eingekapseltes antimykotisches mesoporöses Siliciumdioxid-Nanopartikel gegen die Weizenkrankheit her42. GC-MS wurde zur Identifizierung der in Eos vorhandenen chemischen Zusammensetzungen und auch zur Bewertung des in EO-MRC vorhandenen Eugenol- und Citronellol-Tests eingesetzt. Für die Identifizierung und Quantifizierung flüchtiger und halbflüchtiger Verbindungen sorgte GC-MS für einen hohen Durchsatz und eine hohe Empfindlichkeit der Analyseergebnisse43.

Die Kaplan-Meier-Überlebensfunktion wurde zuvor von Gray et al. genutzt; um die tägliche Mortalität von Pyrethroid-resistenten Ae zu bestimmen. aegypti für jeden Tag nach der Insektizidexposition44. Um den Anteil der Probanden zu messen, die nach der Behandlung leben, überlebten oder geschützt waren, ist die Kaplan-Meier-Schätzung eine der besten Optionen45. In dieser Studie wurde ein Mücken-Bioassay durchgeführt, um die CPT gemäß den von der WHO46 empfohlenen Standardtestrichtlinien zu bestimmen. Die Wirksamkeit von EOs wurde bereits von Azeem et al.47 berichtet. Sie zeigten im Käfig-Bioassay eine Schutzzeit von mehr als 45 Minuten unter dem Arm47. Unsere Studienergebnisse bestätigen, dass das entwickelte Produkt nach der Verarbeitung der besten EO-Mischung zu Formulierungen einen vollständigen Schutz von jeweils bis zu 228 Minuten bot.

In EOs vorhandene lipophile Moleküle könnten direkt in die Lungenzellen des Benutzers gelangen, da nur eine Zellmembran durchdringt werden muss. Dabei kann die Wirkung des Einatmens von EO-Düften aus EO-MRC beträchtlich sein. Aufgrund der übermäßigen Verwendung von EO besteht möglicherweise die Möglichkeit einer Lungentoxizität, die tatsächliche Konzentration wurde jedoch nicht ermittelt und es liegen nur sehr wenige Studien vor48. Die Flavor and Extract Manufacturers Association (FEMA) hat den meisten EOs den Status „Allgemein anerkannt als sicher“ (GRAS) verliehen und sie sind von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (US FDA) für die Verwendung in Lebensmitteln, Kosmetika und pharmazeutischen Produkten zugelassen. Nach einer Bewertung durch das Expertengremium der FEMA wurde dies 1996 überprüft. Grundsätzlich können die meisten Aromastoffe mit weniger als 100 ppm für die Exposition verwendet werden, und Vorhersagen hinsichtlich ihrer Sicherheit können beurteilt werden49. Aufgrund unserer Studienergebnisse zu L-132 könnte EO-MRC als wirksames Mückenschutzmittel angesehen werden, ohne schädliche Auswirkungen auf die Lungenzellen zu haben.

Die Bestimmung akuter Hautreizungen ist nützlich, wenn die Formulierung der Haut ausgesetzt werden soll. Es liefert Informationen über Gesundheitsgefahren, die bei einer kurzzeitigen Exposition über die Haut entstehen können50. Eine Studie zur akuten Hautreizung von EO-MRC an Kaninchen und eine Studie zur dermalen Toxizität bei wiederholter Gabe an Wistar-Ratten bestätigen, dass EO-MRC sicher ist und keine schädlichen Auswirkungen auf die Haut hat. Im Rahmen einer Studie zur akuten Augenreizung hat EO-MRC seine nicht reizende Wirkung auf das Augengewebe nachgewiesen. Eine Testsubstanz wird als augenreizender Stoff der Kategorie 2A des Global Harmonisierten Systems zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (UN GHS) der Vereinten Nationen eingestuft, wenn sie eine positive Reaktion einer Bindehautrötung ≥ 2 zeigt; Bindehautödem ≥ 2 Hornhauttrübung ≥ 1; Iritis ≥ 1; geschätzt als mittlere Werte nach Einstufung in verschiedenen Zeitintervallen von 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Instillation der Testsubstanz, die sich innerhalb einer Beobachtungszeit von 21 Tagen vollständig umkehren. Wenn die oben genannten Effekte innerhalb einer Beobachtungszeit von 7 Tagen vollständig reversibel sind, würde die Testsubstanz in die Kategorie 2B51 eingestuft.

Synthetische Pyrethroide und Organophosphate werden zu einer Bedrohung für Fische und andere Wassertiere52. Hedayati et al. berichteten über hämatologische und kiemenhistopathologische Daten von schillernden Haien (Pangasius hypophthalmus), die Organophosphat- und Pyrethroid-Insektiziden ausgesetzt waren53. In unserer Studie bestätigt die Nicht-Ziel-Toxizität bei D. rerio die ungiftige Natur von EO-MRC. Auch hier wurde DLM als Negativkontrolle verwendet. Es wurde festgestellt, dass die Fischkiemen-Histopathologie von EO-MRC die gleiche Gewebearchitektur aufweist wie die unbehandelten (Kontroll-)Kiemen. Unser Befund zu D. rerio-Kiemen liefert ähnliche Ergebnisse wie zuvor zur Histopathologie von Fischkiemen.

Im Gehirn von Ratten, die TNSF ausgesetzt waren, wurde eine verminderte AChE festgestellt, was mit einem Anstieg der Lipidperoxidation54 und der Möglichkeit einer Störung der Stoffwechsel- und Nervenaktivitäten55 verbunden sein könnte. Allerdings zeigten EO-MRC-exponierte Ratten keinen signifikanten Unterschied zu den Kontrollratten. Eine erhöhte Aktivität von AChE führt zu einer verringerten Menge an ACh, was zu einer Verringerung des Blutflusses und der Gefäßerweiterung führt56. Bei einer Minderdurchblutung des Gehirns durch Unterbindung der A. carotis communis ist die Verringerung der ACh im Hippocampusbereich für Gedächtnis- und Lernstörungen verantwortlich57. In verschiedenen Forschungsstudien wurde über den Verlust perivaskulärer cholinerger Enden bei Alzheimer-Patienten berichtet58,59. Darüber hinaus ist bekannt, dass AChE-Inhibitor-Medikamente die cholinerge Funktion bei Patienten, die mit hypobarer Hypoxie behandelt werden (↓AChE-Aktivität, ↑ACh-Spiegel und Hochregulierung von Cholinacetyltransferase, einem Enzym, das eine Rolle bei der ACh-Bildung spielt) und schließlich die Gedächtnisfunktion beeinflussen60.

Geruchsstoffbindende Proteine ​​(OBPs) sind die ersten Relais bei der semichemischen Rezeption bei Insekten, da sie die Verbindung zwischen dem Luftmedium, das chemische Signale sendet, und Geruchsrezeptoren darstellen, die sich in olfaktorischen Strukturen (hauptsächlich der Antenne und dem Oberkiefermark) der Peripherie des Insekts befinden sensorisches System61. Es wurde keine signifikante Expression von OBP-2A im Kopfteil von EO-MRC-exponierten Ratten beobachtet, jedoch zeigten Mücken, die EO-MRV ausgesetzt waren und die gleichen EOs enthielten, eine Überexpression von OBP-2A. Dies könnte auf das Expositionsmuster von EO bei den Zielgruppen zurückzuführen sein. Es bestätigt, dass EOs die Fähigkeit haben, OBP von Mücken zu überexprimieren. Im Falle eines synthetischen TNSF-exponierten Mückenkopfteils wurde OBP-2A gehemmt. Im Fall von TRPV1 zeigte der EO-MRV-exponierte Mückenkopfteil eine Überexpression dieses Proteins, während die EO-MRC-exponierte Gruppe keine Veränderungen und die TNSF-exponierte Gruppe eine Hemmung von TRPV1 zeigte. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass TRPV1 stärker in entzündeten Geweben exprimiert wird, was seine Bedeutung in der antennenartigen Entzündungskaskade von Mücken in Verbindung bringt. Die gleichen Ergebnisse wurden auch im Fall des Anti-OBP2A-Antikörpers beobachtet. Dies ist der erste Bericht, der die Expression von TRPV1 und Anti-OBP2A-Antikörpern im Kopfteil einer Mücke nachweist. Insekten nutzen mindestens drei Familien von Geruchsrezeptoren, nämlich Geruchsrezeptoren (ORs), ionotrope Rezeptoren (IRs) und Geschmacksrezeptoren (GRs)12,62. DEET maskiert die Geruchsrezeptorneuronen (ORNs) gegenüber Lockstoffen und verringert die Empfindlichkeit gegenüber Milchsäure, einem menschlichen Schweißbestandteil, indem es die Reaktion von durch Milchsäure angeregten Neuronen verringert und die Hemmung von durch Milchsäure inhibierten Neuronen erhöht12.

EO-MRC zeigte sehr vielversprechende Ergebnisse gegen Mücken. Die WB-Analyse bestätigte die signifikante Expression der Zielproteine ​​bei Behandlung mit einer entwickelten Formulierung, die die EOs als Wirkstoffe enthielt. Daher haben wir in der In-silico-Studie versucht, die genauen Moleküle herauszufinden, die in den EOs vorhanden sind und für die abweisende Aktivität verantwortlich sind. Aus der In-silico-Docking-Studie wurden acht Verbindungen identifiziert, die eine bessere Affinität zur Bindung an die Zielproteine ​​der Mücken- und Rattenarten zeigten, um einen stabilen Protein-Ligand-Komplex zu bilden. Die In-silico-Studie ergab, dass die acht identifizierten Verbindungen der EOs eine wesentliche Rolle für die Gesamtabweisungseigenschaft des entwickelten Produkts spielen.

EOs von Basilikum (Ocimum basilicum L.), Bergamotte (Citrus bergamia Risso & Poit), Kampfer [Cinnamomum camphora (L.) J. Presl.], Zimt (Cinnamomum zeylanicum Blume), Citronella [Cymbopogon nardus (L.) Rendle] , Gewürznelke (Eugenia caryophyllus Wight), Eukalyptus (Eucalyptus globulus Labill.), Jasmin (Jasminum officinale L.), Lavendel (Lavandula angustifolia Mill.), Zitronengras [Cymbopogan citratus (DC.) Stapf], Mentha (Mentha piperita L. ), Rosmarin (Rosmarinus officinalis L.), Patschuli (Pogostemon patchouli Benth) und wilde Kurkuma (Curcuma aromatica Salisb.) wurden von Talent Technologies (Talent Technologies, Kanpur, Indien) bezogen. Acetylcholinesterase (AChE)-Aktivitätstestkit, Anti-OBP2A-Antikörper, ELISA-Kits, 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Radioimmunpräzipitationspuffer (RIPA) und Phosphatpuffersalzlösung (PBS) wurden von Sigma Aldrich (Sigma Aldrich Chemical) erworben Co., St. Luis, USA). Der TRPV1-Antikörper wurde von Santa Cruz (Santa Cruz, Kalifornien, USA) gekauft. 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (CDNB) wurde von Cayman (Cayman Chemical Company, Michigan, USA) bezogen. Die humane normale Lungenzelllinie (L-132) wurde vom National Center for Cell Sciences (NCCS), Pune, Indien, bezogen. Aceton für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde von Merck (Merck Pvt. Ltd., Mumbai, Indien) bezogen. Alle anderen verwendeten Chemikalien hatten die höchste verfügbare Analysequalität.

5–7 Tage altes erwachsenes Weibchen Ae. Albopictus-Mücken wurden im Laborinsektarium der Abteilung für Pharmazeutische Technologie des Verteidigungsforschungslabors in Tezpur, Assam, Indien, untergebracht. Die Mücken wurden aufgezogen, indem die Temperatur bei 27 ± 2 °C, die relative Luftfeuchtigkeit bei 75 ± 5 % RH und 14 L:10 D h abwechselnde Hell-Dunkel-Zyklen in Holzkäfigen in Standardgröße (75 cm × 60 cm × 60 cm) gehalten wurden Ärmelöffnung auf einer Seite wie zuvor beschrieben63. Zur Ernährung wurde 10 %ige Saccharoselösung ad libitum bereitgestellt. Vor dem Test wurden die Mücken 24 Stunden lang ausgehungert.

Es wurde eine Dosis-Wirkungs-Studie durchgeführt, um die besten Öle unter den vierzehn EOs zu bewerten. Diese Studie wurde vom Institutional Human Ethical Committee (IHEC) des Tezpur Medical College & Hospital (TMCH), Tezpur, Assam, Indien, genehmigt (Genehmigungsnummer: 032/2021TMCH, 28.08.2018) und alle Experimente wurden durchgeführt gemäß den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften. Es werden fünf Freiwillige ausgewählt, die nicht allergisch gegen Mückenstiche sind, und alle Freiwilligen haben eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben. Der Oberschenkel eines Freiwilligen wurde entsprechend der Türöffnung des K&D-Moduls markiert, wie von Klun und Debboun64 beschrieben. Es besteht aus Plexiglas und die Basis des rechteckigen Käfigs (26 cm × 5 cm × 5 cm) weist sechs Löcher mit jeweils rechteckigen 3 × 4 cm großen Löchern auf, die durch eine Schiebetür geöffnet und geschlossen werden (Ergänzende Abbildung S8: Bereitstellen). das Foto des K&D-Moduls). Der Beugebereich der Unterarme eines freiwilligen Menschen wurde mit vier rechteckigen (3 cm × 4 cm) Testbereichen umrissen. Ein Volumen von 25 µL jeder Konzentration der EOs in Sojaöl (40, 4 und 0,4 µg/cm2) und 25 µL Sojaöl (Verdünnungsmittel) als Kontrolle wurden auf die markierten Bereiche aufgetragen. Nach 5-minütiger Lufttrocknung wurde ein K&D-Modul mit passenden Ausschnitten im Boden über den behandelten Bereichen platziert, wobei sich in jedem Loch fünf nullipare 5–7 Tage alte weibliche Mücken befanden. Die Türen der Zellen wurden geöffnet und die Anzahl der in jede Zelle stechenden Mücken wurde innerhalb einer 2-minütigen Exposition aufgezeichnet, danach wurden die Türen geschlossen. Nach Abschluss jeder Beobachtung wurden die Mücken befreit, indem die Zellen des K&D-Moduls in einem abgeschirmten Käfig mit Ärmeln geöffnet wurden. Für jeden Test werden frische Mückenpaare verwendet. Für jeden Test wurden fünf Wiederholungen durchgeführt. Die Wirksamkeit von EOs wurde anhand der prozentualen Abwehrwirkung gegen Mücken unter Verwendung der Formel oder Gl. bestimmt. (2) beschrieben von der WHO46.

Dabei ist C die Anzahl der Mücken, die im Kontrollbereich landen oder dort stechen. T ist die Anzahl der Mücken, die auf der behandelten Fläche landen oder dort stechen.

Für die einzelnen Formulierungsbestandteile ist eine Untersuchung der chemischen Kompatibilität erforderlich. Alle Formulierungsbestandteile besitzen einen spezifischen Wert der Schwingungsfrequenz und weisen unterschiedliche funktionelle Gruppen in ihren chemischen Strukturen auf. Zur Kompatibilitätsstudie wurden alle EOs, die in der Cremeformulierung zu verwendenden Hilfsstoffe und ihre physikalische Mischung einzeln über die Probenplatte des FT-IR-Instruments (Bruker, ALPHA, Billerica, MA, USA) gelegt. Die Abdecksonde wurde über der Probe platziert und IR-Spektren wurden über eine Wellenlänge von 2,5–25 μm bei Raumtemperatur aufgenommen. Die funktionellen Gruppen jedes einzelnen Inhaltsstoffs sollten in ihrer physikalischen Mischung identisch sein, was ihre Kompatibilität bestätigt37.

Das thermische Verhalten von Citronellaöl, Nelkenöl, Zitronengrasöl, deren Mischung und EO-MRC wurde mit einem Thermoanalysator (TG 209 F1 Libra®, NETZSCH-Gerätebau GmbH, 95100 Selb, Deutschland) bewertet. Jedes Mal wurden etwa 10 mg Probengewicht in den Tiegel gegeben. Als Schutzgas wurde Stickstoff verwendet. Das Heizprogramm wurde auf 30–600 °C mit einer Geschwindigkeit von 10 °C/min festgelegt.

Zur Optimierung wurde ein Box-Behnken-Design (BBD) mit 17 Durchläufen, 3 Faktoren und 3 Ebenen verwendet. Ein Polynommodell zweiter Ordnung wurde mit der quadratischen Antwortflächenmethode (RSM) unter Verwendung der Design-Expert-Software (Version 6.0.8, Stat-Ease Inc., USA) erstellt. Insgesamt wurden siebzehn Formulierungen erhalten, wobei die EO-Konzentrationen als abhängige Variablen gegenüber der vollständigen Schutzzeit (CPT) als unabhängige Variable oder Reaktionsvariable verwendet wurden. Die Varianzanalyse (ANOVA) wurde mit derselben Software durchgeführt, um die effektivste Formulierung zu erhalten.

Zur Herstellung einer EO-basierten Mückenschutzcreme (EO-MRC) wurde die Phaseninversionstemperaturmethode angewendet. Etwa 50 g Sahneprobe wurden vorbereitet, um ausreichend für die Durchführung der verschiedenen qualitativen und quantitativen Tests zu erhalten. Die Ölphase (Phase B) wurde hergestellt, indem die öllöslichen Hilfsstoffe, mit Ausnahme von Phase A (mückenabweisende Wirkstoffe), unter mildem Erhitzen bei 200 U/min in einem heißen Magnetplattenrührer (Magnetrührer IKA RCT Basic) gelöst und auf 65 °C erhitzt wurden . Die wässrige Phase wurde durch Mischen verschiedener wasserlöslicher Bestandteile (Phase C) unter leichtem Erhitzen und Rühren hergestellt. Die Temperatur der wässrigen Phase wurde auf 65 °C erhöht. Phase A wurde vorsichtig bei einer Rührgeschwindigkeit von 200 U/min und 55 ± 2 °C zur Ölphase gegeben. Die Mischung wurde dann durch langsame Zugabe von Phase C emulgiert und 1 Stunde lang bei einer Rührgeschwindigkeit von 800 U/min und 60 ± 2 °C gehalten. Das formulierte EO-MRC wurde dann zur natürlichen Kühlung aufbewahrt.

Die CPT der entwickelten Cremeformulierung (EO-MRC) wurde mittels Arm-in-Cage-Bioassay durchgeführt. 1 ml EO-MRC wurde auf eine etwa 600 cm2 große Fläche der Unterarmhaut zwischen Handgelenk und Ellenbogen aufgetragen und 1 ml der im Handel erhältlichen Creme (DBMC) auf Basis von 12 % N,N-Diethylbenzamid (DEBA) wurde am anderen Arm verglichen . Zwei Mückenkäfige (Größe: 40 × 40 × 40 cm) mit jeweils 200–250 nicht durch Blut gefütterten weiblichen Ae. Es wurden Albopictus verwendet. Ein Käfig ist zum Testen des EO-MRC und der andere für die Positivkontrolle (DBMC) vorgesehen. Während des Tests wurden die Hände durch OP-Handschuhe geschützt, in die die Mücken nicht stechen können, während der Freiwillige Bewegungen des Arms vermeidet. Mit EO-MRC und DBMC behandelte Arme wurden 3 Minuten lang in 30-Minuten-Intervallen exponiert, um die Landungs- und/oder Sondierungsaktivität zu bestimmen. Eine einzelne Landung oder Sondierung einer Mücke innerhalb eines Testintervalls von 3 Minuten schließt den Test ab. CPT wurde als die Zeit (Minuten) berechnet, die für die erste Mückenlandung oder -sondierung nach der Anwendung des Abwehrmittels auf der behandelten Fläche erforderlich ist. Der mittlere CPT und die Konfidenzintervalle wurden anhand der Kaplan-Meier-Überlebensfunktion46 geschätzt.

Die Wirksamkeit korrelierte mit der auf DEBA basierenden vermarkteten Creme (DBMC). Die Einbeziehung des konkreten Handelsprodukts DBMC dient dem Vergleich und stellt keine Empfehlung dar.

Verschiedene chemische Komponenten in vierzehn EOs und der ausgewählten Mischung wurden durch ein GC-MS-System von Agilent Technologies (5301 Stevens Creek Blvd. Santa Clara, CA 95051, USA) identifiziert. Die Testprobenkonzentration von 500 μg/ml wurde in Aceton in GC-Qualität hergestellt. Ein Probenvolumen von 1 μl wurde in den auf 250 °C gehaltenen Injektor gegeben. Die Ofentemperatur von 40–300 °C wurde auf 20 °C/min programmiert. Als Trägergas wurde Helium mit einer Flussrate von 1 ml/min verwendet. Die Injektor- und Detektortemperatur wurden auf 250 °C bzw. 230 °C (Quad) bzw. 150 °C (Kern) eingestellt37. Gesättigte C7–C30-Standardalkane wurden von Sigma Aldrich Chemicals Co., St. Louis, USA, bezogen. Zur Identifizierung der erkannten Komponenten wurden Retentionsindizes (RI) der identifizierten Komponenten bestimmt.

Kalibrierungsproben von Eugenol und Citronellol wurden durch Auflösen einer geeigneten Menge in Aceton in GC-Qualität hergestellt, um Konzentrationen von 62,5 μg/ml, 125 μg/ml, 250 μg/ml und 500 μg/ml zu erhalten. Testproben von EO-MRC, Nelkenöl und Citronellaöl wurden durch Auflösen einer erforderlichen Menge in Aceton hergestellt, um die EO-Komponenten in der endgültigen Formulierung zu quantifizieren. Ein Probenvolumen von 1 μl wurde in den Injektor eingeführt, wie im Abschnitt „Qualitative Studie“ beschrieben.

Die physikalischen Parameter der EO-MRC- und Placebo-Formulierungen wurden bestimmt, um die ästhetische Konformität und die Verbraucherakzeptanz festzustellen. Zur Bestimmung der Viskosität wurde ein programmierbares Viskosimeter verwendet (Modell: DV2T, Ametek Brookfield, Middleboro, MA, USA); kombiniert mit Software Rheo3000, Version 1.2.2019.1 [R]. Das Probenvolumen wurde auf 30 g festgelegt und die Viskositäten wurden 40 s lang bei 10 U/min bei Raumtemperatur unter Verwendung einer T-Bar-Spindel (B-92) (Helipath-Spindelset, Brookfield Engineering Labs. Inc.) bestimmt. Die Dichte wurde mit einem Pyknometer bestimmt. Der pH-Wert von EO-MRC wurde mit einem digitalen pH-Meter (Labman Scientific Instruments, Tamil Nadu, Indien) überprüft.

Die Ausbreitungsfähigkeit von EO-MRC wurde anhand der zuvor von Sabale65 beschriebenen Methode bestimmt. Kurz gesagt wurde 1 g EO-MRC auf eine vormarkierte kreisförmige Fläche von 1 cm2 auf dem Objektträger (7,5 cm × 2,5 cm) gegeben. EO-MRC wurde mit einem weiteren Glasobjektträger komprimiert, der vom Rand bis zur Mitte des Primärobjektträgers platziert wurde. 200 g handelsübliches Gewicht wurden auf den Aufbau gelegt und das Gel 1 Minute lang verteilt. Der Ausbreitungsdurchmesser wurde mit Hilfe von Millimeterpapier berechnet und die Ausbreitungsfähigkeit wurde anhand der in Gleichung ausgedrückten Formel bewertet. (3):

wobei m das kommerzielle Gewicht ist, das auf dem Aufbau lastet; l ist die Länge des Cremeaufstrichs; und t ist die Zeit.

Die Reduktion von Tetrazoliumsalzen gilt heute weithin als zuverlässige Methode zur Untersuchung der Zellproliferation. Das gelbe Tetrazolium MTT (3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) wird von metabolisch aktiven Zellen teilweise durch die Wirkung von Dehydrogenase-Enzymen reduziert, um reduzierende Äquivalente wie NADH und NADPH zu erzeugen. Mit Hilfe spektrophotometrischer Mittel kann das resultierende intrazelluläre violette Formazan quantifiziert werden. Der Assay misst die Zellproliferationsrate und umgekehrt, wenn Stoffwechselereignisse Apoptose oder Nekrose verursachen, die Verringerung der Zelllebensfähigkeit66.

In T-25-Kolben kultivierte Zellen wurden trypsinisiert und in ein 5-ml-Zentrifugenröhrchen abgesaugt. Das Zellpellet wurde durch Zentrifugation bei 3000 U/min erhalten. Die Zellzahl wurde unter Verwendung von DMEM HG-Medium so angepasst, dass 200 μl Suspension etwa 10.000 Zellen enthielten. In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen wurden 200 μl der Zellsuspension gegeben und die Platte wurde 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre inkubiert. Nach 24 Stunden wurde das verbrauchte Medium abgesaugt. 200 μL verschiedener Testkonzentrationen, nämlich 62 µg/ml, 125 µg/ml, 250 µg/ml, 500 µg/ml und 1000 µg/ml EO-MRC wurden in die jeweiligen Vertiefungen gegeben. Anschließend wurde die Platte 24 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre inkubiert. Die Platte wurde aus dem Inkubator entfernt und das wirkstoffhaltige Medium abgesaugt. Anschließend wurden 200 μl Medium mit 10 % MTT-Reagenz in jede Vertiefung gegeben, um eine Endkonzentration von 0,5 mg/ml zu erhalten, und die Platte wurde 3 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre inkubiert. Ohne die in den Vertiefungen gebildeten Kristalle zu stören, wurde das Kulturmedium vollständig entfernt. 100 μl Solubilisierungslösung (DMSO) wurden in jede Vertiefung gegeben und die Platte wurde dann vorsichtig in einem Schüttler (ROCKYMAX™, Tarsons, Kolkata, Indien) geschüttelt, um das gebildete Formazan zu solubilisieren. Die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 570 nm und auch bei 630 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Die prozentuale Wachstumshemmung wurde berechnet und die Konzentration an EO-MRC, die erforderlich ist, um das Zellwachstum um 50 % zu hemmen (IC50), wurde aus der Dosis-Wirkungs-Kurve für die Zelllinie ermittelt.

Alle Versuchsprotokolle mit Tieren wurden gemäß den „Grundsätzen der Labortierpflege“ (NIH-Veröffentlichung 85–23, überarbeitet 1985) durchgeführt und vom Institutional Animal Ethical Committee (IAEC) des Defence Research Laboratory (DRL), Tezpur, Assam, genehmigt. Indien (Zulassungsnr. CPCSEA/DRL/Protokoll Nr. 3, 20.06.2018). Alle Studien mit Tieren werden gemäß den ARRIVE-Richtlinien für die Berichterstattung über Experimente mit Tieren67 gemeldet. Während des Untersuchungszeitraums wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der verwendeten Tiere zu reduzieren.

5–8 Wochen alte, etwa 210–250 g männliche, gesunde erwachsene Wistar-Ratten (Rattus norvegicus) und junge und gesunde Neuseeland-Albinokaninchen (Oryctolagus cuniculus) wurden aus der Tierhaltungseinrichtung entnommen und durften sich vorher 7 Tage lang akklimatisieren die Studie. Standardnahrung und gereinigtes Wasser nach Belieben wurden in sauberem und hygienischem Zustand bei 22–25 °C, 40–70 % relativer Luftfeuchtigkeit und 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklen bereitgestellt.

Eine Studie zur akuten Hautreizung wurde an gesunden neuseeländischen Albinokaninchen gemäß den OECD-Testrichtlinien 40468 durchgeführt. Ungefähr 24 Stunden vor dem Test wurde das Fell aus dem Rückenbereich des Rumpfes entfernt. 0,5 g EO-MRC wurden direkt auf die Haut aufgetragen und nach 4 Stunden Einwirkzeit wurde restliches EO-MRC mit Wasser entfernt, ohne die Integrität der Epidermis zu beeinträchtigen, und nach 60 Minuten auf Anzeichen von Erythem und Ödem untersucht 24 h, 48 h und 72 h nach der EO-MRC-Entfernung. Hautreaktionen werden gemäß den Noten in Tabelle 8 bewertet und aufgezeichnet. Gemäß der von Banerjee et al.69 beschriebenen Methode; Der primäre Reizindex (PII) wurde berechnet. Darüber hinaus haben wir die Draize-Klassifizierungsmethode für die PII-Bewertung als nicht reizend (wenn PII < 0,5), leicht reizend (wenn PII < 2), mäßig reizend (wenn PII ≤ 2–5) und stark reizend (wenn PII) befolgt > 5)70 und dann wurde der mittlere Reizwert pro Zeitpunkt berechnet. Die Durchschnittswerte an Tag 1, Tag 2 und Tag 3 wurden dann summiert und der Gleichung gefolgt, um den PII zu erhalten.

wobei Xa der mittlere Wert der Erythembildung ist; Xb ist der mittlere Wert der Ödembildung; \(t\_1\) ist der Tag 1; \(t\_2\) ist der Tag 2; \(t\_3\) ist der Tag 3.

Gemäß der OECD-Richtlinie 41071 wurde die dermale Toxizität des EO-MRC bei wiederholter Gabe über einen Zeitraum von 21 Tagen untersucht. Gesunde Wistar-Ratten wurden in zwei verschiedenen Gruppen gehalten (Kontrolle und mit EO-MRC behandelt), und jede Gruppe enthielt 06 Tiere nach anfänglicher Akklimatisierung für mindestens 5 Tage vor der Studie. Kurz gesagt, das Rückenfell wurde mit einer sterilen chirurgischen Haarentfernungsklinge (49–20 mm) entfernt und ein 4,0 × 4,0 mm großer Rückenbereich wurde mit Placebo und Testsubstanzen für mindestens 6 Stunden/Tag an 5 Tagen/Woche über 21 Tage hinweg behandelt . Eine Beobachtung hinsichtlich Körpergewicht und Futterverbrauch wurde täglich überwacht72.

Für dieses Experiment, OECD TG 405, wurde ein Testverfahren zur Prüfung akuter Augenreizungen an jungen und gesunden Kaninchen durchgeführt50. 50 mg EO-MRC wurden 5 Sekunden lang durch sanftes Ziehen am unteren Lid des rechten Augapfels in den Bindehautsack eingebracht; wobei das linke Auge als Kontrolle diente. Als Negativkontrolle wurde Capsaicin, ein Augenreizstoff, verwendet. Das Auge des Tieres wurde in den nächsten 24 Stunden nach der Gabe von Capsaicin nicht gewaschen. Die Beobachtungen etwaiger Augenläsionen in bestimmten Abständen von 1 Stunde, 24 Stunden und 48 Stunden wurden unter Verwendung eines Spaltlampenmikroskops (Haagstreit Typ AIA-11, Appaswamy) ausgewertet73.

Der akute Toxizitätstest an Danio rerio (D. rerio) wurde gemäß den Richtlinien der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (Test Nr. 203, Akuter Immobilisierungstest)74 durchgeführt. In jedem Testgefäß wurden sieben neugeborene D. rerio exponiert und drei Replikate getestet, also insgesamt 21 D. rerio pro Behandlungsgruppe. D. rerio-Individuen wurden in Behälter mit 250 ml reinem Wasser gegeben, und EO-MRC wurde mit Aceton verdünnt und in Dosierungen, die den Konzentrationen 200, 100 und 50 mg/L entsprachen, in das Wasser gemischt. Das Experiment wurde in drei Gruppen aufgeteilt. Die ersten beiden Gruppen wurden aus D. rerio-Individuen gebildet, die über einen Zeitraum von 24 Stunden und 75 Minuten der Wirkung von EO-MRC und der Negativkontrolle Deltamethrin (DLM) ausgesetzt waren. Als Kontrolle dienten D. rerio-Individuen in der dritten Gruppe.

Die physikalischen und chemischen Bedingungen der akuten Toxizitätstests waren wie folgt: pH-Wert im Bereich von 7,2 bis 7,6; konstante Temperatur von 25 ± 1 °C; elektrische Leitfähigkeit etwa 160 μS/cm; gelöster Sauerstoff über 3 mg/L. Die Anzahl toter D. rerio in den drei Replikaten wurde gezählt und zur Bestimmung des LC50-Werts für eine 24-stündige Exposition verwendet.

In dieser Studie wurden Transfluthrin-1,6 % (TNSF) und EO-MRC 21 Tage lang verschiedenen Rattengruppen (n = 6) ausgesetzt. Kontrolltiere erhielten keine Exposition. Nach Ablauf von 24 Stunden nach der letzten Exposition wurden alle Tiere auf humane Weise durch Zervixluxation getötet. Hirngewebeproben wurden gesammelt und unter Verwendung von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, homogenisiert, gefolgt von einer 5-minütigen Zentrifugation bei 14.000 U/min. Geklärte Überstände wurden für den Test gemäß dem im technischen Bulletin des Acetylcholinesterase-Aktivitätstestkits (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 USA; Katalognummer: MAK119) beschriebenen Verfahren verwendet.

Kopfteil der weiblichen Ae. Albopictus (n = 100 in jeder Gruppe), der zuvor EO-MRV (Mückenschutzverdampfer auf Basis ätherischer Öle), EO-MRC, TNSF und Kontrolle (unbehandelt) ausgesetzt war, wurde isoliert und frisch in RIPA-Puffer homogenisiert und bei 12.000 U/min zentrifugiert für 15 Min. Die gesammelten Überstände wurden zur weiteren Verwendung bei –80 °C aufbewahrt. Gemäß den Anweisungen im Biorad DC Protein-Assay-Protokoll (Bio-Rad, Hercules, CA) wurden die Proteinkonzentrationen in den Gewebeproben bestimmt. Zur Erstellung der Proteinstandardkurve wurden Arbeitsreagenzien und Proteinstandardverdünnungen vorbereitet. 5 μl Standards und Gewebeproben wurden in die entsprechenden Vertiefungen gegeben, gefolgt von 25 μl bzw. 200 μl Arbeitsreagenzien A und B. Die Absorption wurde nach 15 Minuten bei 750 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (Spinco Biotech Pvt. Ltd., Indien) abgelesen. Aus den Ergebnissen dieses Tests wurde die Proteinmenge in jeder Testprobe berechnet, die 50 μg Standardprotein für die weitere Beladung im Blotting-Prozess entspricht.

Die erforderliche Menge an Testproben wurde mit einer gleichen Menge des Laemmli-Puffers gemischt und zum Blotten verwendet. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gele (SDS-PAGE) wurden aus dem 10 %igen Acrylamid-Auflösungsgel (TGX Stain-FreeTM FastCastTM Acrylamide Kit, Bio-Rad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Standard-Proteinmarker (Precision Plus, Kaleidoskop, Biorad) und zuvor vorbereitete Gewebeproben wurden in verschiedene Vertiefungen der gegossenen SDS-PAGE-Gele eingebracht. Die Elektrophorese wurde in einem Mini-PROTEAN® Tetra-System und einem PowerPacTM HC-Elektrophorese-Stromversorgungssystem (Bio-Rad, CA, USA) durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das in Proteine ​​eingebettete Gel bei 15 mV (15 Minuten) auf eine Nitrozellulosemembran im Trans Blot Turbo-Gerät übertragen. Die in Proteinbänder eingebettete Membran wurde dann auf eine frische Petrischale übertragen und auf einem Schüttelschüttler (Rockymax, Tarsons, Kolkata, Indien) 1 Stunde lang in einer Blockierungslösung bestehend aus Tris-Puffersalzlösung (TBS) mit 0,1 % Tween 20 und 5 inkubiert % Rinderserumalbumin (BSA). Nach 1 Stunde wurde die Blockierungslösung verworfen und die Membran dreimal (3 Minuten/Waschgang) mit TBST-Lösung gewaschen. Die TBST-Lösung wurde vollständig auspipettiert und ohne Trocknung der Membranen wurden spezifisch verdünnte Primärantikörper auf die Membranen gegeben. Die Membranen wurden separat mit Anti-OBP2A- und TRPV1- und β-Actin-Primärantikörpern (verdünnt in 5 % BSA in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4) sondiert und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Membran dreimal in TBST gewaschen (5 Min./Waschgang), gefolgt von einer einstündigen Inkubation mit Meerrettichperoxidase (HRP) verknüpften Sekundärantikörpern (verdünnt in 5 % BSA in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, (Details). (siehe Ergänzungstabelle S5) auf einem Schüttelschüttler bei 4 °C. Nach der Inkubation wurde frisch zubereitetes ECL-Substrat zu den Membranen gegeben und sofort im G: Box Chemi-XRQ Gel-Doc-System (Syngene, Vereinigtes Königreich) visualisiert und interpretiert. Die Intensität Die Anzahl der Banden wurde mit SynGene GeneTools (SynGene Laboratories, Cambridge, Vereinigtes Königreich) berechnet. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Alle Quantifizierungsschritte der WB-Bande wurden mit benutzerdefiniertem ImageJ (National Institutes of Health; http://rsb.info) durchgeführt. nih.gov/ij/)-Skript.

Eine molekulare Docking-Studie wurde durchgeführt, um die Komponente(n) der EOs zu finden, die dazu neigen, sich an das/die Ziel(e) zu binden, die mit der abweisenden Aktivität verbunden sind. Die in der Formulierung verwendeten EO-Komponenten wurden anhand der GC-MS-Analyse identifiziert. Anschließend wurde die SMILE-ID der Verbindungen aus der PubChem-Datenbank (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) abgerufen und in die Molekularmodellierungssoftware Discovery Studio 2020 (DS 2020) (Dassault BIOVIA, San Diego, USA) geladen )76. Die 3D-Strukturen der Verbindungen wurden generiert und die Energieminimierung der Verbindungen wurde gemäß dem Standardprotokoll von DS 2020 unter Verwendung der Smart-Minimizer-Methode77 durchgeführt. Die Zielproteine ​​Odorant Binding Protein (OBP) für Aedes-Arten (PDB: 3K1E) und für Anopheles-Arten (PDB: 3QME) sowie TRPV1 für Ratten (PDB: 5IS0) wurden aus der Proteindatenbank (www.rcsb.org) heruntergeladen78 . Die Zielproteine ​​wurden gereinigt, vorbereitet und dann mithilfe der „Smart Minimizer“-Methode für 2000 Schritte mit einem Energie-RMSD-Gradienten von 0,01 kcal/mol77 energieminimiert. Anschließend wurden die Bindungsstellen für die Docking-Studie anhand der in der Proteindatenbank angegebenen Informationen für aktive Stellen der ausgewählten Ziele ausgewählt. Die aktiven Stellen für OBP von Aedes-Arten waren X: 13,63, Y: 40,63, Z: 24,92 und Radius 9,8 Å; für OBP von Anopheles-Arten betrugen X: 20,17, Y: 31,50, Z: 32,09 und der Radius 7,7 Å; für TRPV1 von Ratten betrug X: 107,77, Y: 92,80, Z: 103,16 und der Radius 9,3 Å (Ergänzende Abbildung S4). Anschließend wurde eine Docking-Studie mit dem simulationsbasierten Docking-Protokoll CDocker von DS 2020 durchgeführt, das vergleichsweise genauere Informationen über die Bindung einer Verbindung im aktiven Zentrum liefert79. Die besten erzeugten Andockpositionen wurden auch analysiert, um die unterschiedlichen nichtbindenden Wechselwirkungen zwischen den Zielproteinen und -verbindungen zu beobachten.

Die auf MM-PBSA basierende freie Bindungsenergie liefert genaue Informationen über die thermodynamische Stabilität des Protein-Ligand-Komplexes unter realen physiologischen Bedingungen80,81. Daher wurden die besten Posen der beim Andocken ausgewählten Verbindungen weiter analysiert, um die freien Bindungsenergien (ΔG) mithilfe der MM-PBSA-Methode zu berechnen.

Die vorliegende Studie untersucht die abstoßende Wirkung einer ungiftigen EO-MRC-Formulierung gegen Mücken gemäß den internationalen Standards. Das hier getestete EO-MRC hat die Wirksamkeitsstudie gegen Ae erfolgreich bestanden. Albopictus und präklinische Toxizität an verschiedenen Labortieren gemäß OECD-Testrichtlinien. Das entwickelte Produkt bietet bis zu 228 Minuten wirksamen Schutz gegen Ae. albopictus, ohne dass in präklinischen Einrichtungen Gesundheitsrisiken entstehen. Somit untermauert die Gesamtstudie die Entwicklung einer EO-basierten, länger anhaltenden, ungiftigen topischen Cremeformulierung, um Mückenstiche strategisch zu minimieren und die Zahl der durch Mücken übertragenen Krankheiten zu verringern. Diese Studie ist jedoch nicht schlüssig, es sollten weitere Untersuchungen zu Abwehrtests mit verschiedenen Mückenstämmen und verschiedenen Bioassay-Verfahren wie Tunnel-Bioassay, Y-Röhren-Olfaktometer usw. durchgeführt werden. Für aussagekräftigere Ergebnisse sind Non-Target-Toxizitätstests, Stabilitätstests oder die Selbstbewertung des EO-MRC unerlässlich. In Zukunft könnten mehrere Emulsionen und/oder liposomale Cremeformulierungen für die kontrollierte Freisetzung von Anti-Mücken-Formulierungen in exponierter Haut entwickelt werden, um eine maximale Schutzdauer zu erreichen. Dies würde die Dosierungshäufigkeit unter Außenbedingungen verringern. Untersuchungen zur Expression eines stärker auf Gerüche reagierenden Proteins im Kopfteil der Mücke könnten dazu beitragen, dass die wissenschaftliche Gemeinschaft einen detaillierteren Mechanismus abweisender Chemikalien versteht. Der vorliegende Bericht kommt Forschungsstudenten, Formulierungswissenschaftlern und Pharmaunternehmen zugute, um wirksame, sichere und länger anhaltende pflanzliche Mückenschutzmittel zu entwickeln, die für Reisende, das Militär bei Einsätzen im Dschungel oder die breite Öffentlichkeit in endemischen Mückengebieten zum Schutz vor Mücken eingesetzt werden könnten.

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Hemanga Hazarika dankt der Organisation für Verteidigungsforschung und -entwicklung (DRDO), dem Verteidigungsministerium und der Regierung. of India, für die Bereitstellung eines Forschungsstipendiums (DRL/1206/TC/JRF/04). Die Autoren danken insbesondere dem Defence Research Laboratory (DRL), Tezpur, Assam, Indien, und der Verwaltung der Dibrugarh University (DU), Dibrugarh, Assam, Indien, für die Bereitstellung aller notwendigen Unterstützung, die für die Doktorarbeit erforderlich ist. Der Autor dankt außerdem Dr. Rishi Hazarika, MD, Senior Director, Pfizer, London, Vereinigtes Königreich, für die Überarbeitung dieses Manuskripts und die Vorschläge zu seiner Verbesserung. Herzlicher Dank geht an Dr. Sourav Chakraborty, Assistenzprofessor, Abteilung für Lebensmitteltechnik und -technologie, Tezpur University, Assam, Indien, für die pünktliche Bereitstellung der TGA-Berichte; Sumit Kishor, Senior Technical Assistant, DRL, Tezpur, Assam, Indien für die Bereitstellung von GC-MS-Daten; und Polopalli Subramanyam Raju, JRF, DRL, Tezpur, für die Unterstützung bei AEI-Studien. Allen anonymen Gutachtern danken wir ebenfalls für ihre spezifischen Kommentare, die sehr zur Verbesserung dieses Manuskripts beitragen.

Abteilung für Pharmazeutische Technologie, Verteidigungsforschungslabor, Tezpur, Assam, 784001, Indien

Hemanga Hazarika, Harshita Krishnatreyya, Danswrang Goyary und Pronobesh Chattopadhyay

Girijananda Chowdhury Institute of Pharmaceutical Science, Dekargaon, Tezpur, Assam, 784501, Indien

Hemanga Hazarika und Harshita Krishnatreyya

Eurofins Agroscience Services Pvt. Ltd., Tirupur, Tamil Nadu, 641603, Indien

Varun Tyagi

Coromandel Int. Ltd., Shameerpet, Telangana, 500101, Indien

Johirul-Islam

Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften, Dibrugarh University, Dibrugarh, Assam, 786004, Indien

Hemanga Hazarika, Neelutpal Gogoi und Kamaruz Zaman

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HH und HK trugen zur Konzeptualisierung, Methodik, Analyse, Untersuchung und zum Schreiben bei – Originalentwurf. VT und JI trugen zum Mücken-Bioassay bei und überprüften das Manuskript. NG führte molekulares In-Silico-Docking durch. DG überwachte die Experimente zum Western Blot. PC und KZ konzipierten und überwachten die gesamten Experimente.

Korrespondenz mit Hemanga Hazarika oder Pronobesh Chattopadhyay.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Hazarika, H., Krishnatreyya, H., Tyagi, V. et al. Die Herstellung und Bewertung von Mückenschutzcremes zum Schutz im Freien. Sci Rep 12, 2180 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-06185-9

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Eingegangen: 19. Juli 2021

Angenommen: 25. Januar 2022

Veröffentlicht: 09. Februar 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-06185-9

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Zeitschrift für Nanobiotechnologie (2022)

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