Pharmakologisch gezielter NMDA-Rezeptor-Antagonismus durch NitroMemantine bei zerebrovaskulären Erkrankungen

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 14781 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Ein Korrigendum zu diesem Artikel wurde am 12. Februar 2016 veröffentlicht

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Schlaganfall und vaskuläre Demenz sind die Hauptursachen für Morbidität und Mortalität. Neuroprotektive Therapien wurden vorgeschlagen, aber keine hat sich als klinisch verträglich und wirksam erwiesen. Während angenommen wird, dass eine Überstimulation von Glutamatrezeptoren vom N-Methyl-D-Aspartat-Typ (NMDARs) zu zerebrovaskulären Beeinträchtigungen beiträgt, hat die Bedeutung von NMDARs für die physiologische Funktion zumindest nach Ansicht vieler in „Big Pharma“ dieses Ziel zum Ziel gemacht. „nicht medikamentös“ für diese Indikation. Hier beschreiben wir neuartige NitroMemantine-Medikamente, die eine Adamantan-Einheit umfassen, die an den NMDAR-assoziierten Ionenkanal bindet, der verwendet wird, um eine Nitrogruppe zu redoxvermittelten regulatorischen Stellen am Rezeptor zu lenken. Die NitroMemantine sind sowohl gut verträglich als auch wirksam gegen Hirninfarkte in Nagetiermodellen über einen dualen allosterischen Mechanismus der Blockierung offener Kanäle und der NO/Redox-Modulation des Rezeptors. Die gezielte S-Nitrosylierung von NMDARs durch NitroMemantin wird durch Hypoxie verstärkt und ist dadurch auf ischämische Neuronen gerichtet. Allosterische Ansätze zur Abstimmung der NMDAR-Aktivität könnten ein therapeutisches Potenzial für zerebrovaskuläre Erkrankungen haben.

Fokale zerebrale Ischämie (Schlaganfall) und vaskuläre Demenz (aufgrund mehrerer Schlaganfälle im Mikrogefäßsystem) sind weltweit die Hauptursachen für schwere kognitive Dysfunktionen und Todesfälle1. Während eine übermäßige Stimulation von Glutamatrezeptoren vom N-Methyl-D-Aspartat-Typ (NMDARs) als wichtig für die Ätiologie von zerebrovaskulären Schäden gilt2,3, wurde zuvor festgestellt, dass NMDAR-Antagonisten bei zerebralen ischämischen Beleidigungen beim Menschen entweder unwirksam oder klinisch nicht tolerierbar sind trotz vielversprechender erster Ergebnisse in Tiermodellen4,5,6. Viele in „Big Pharma“ gehen daher stillschweigend davon aus, dass NMDARs nicht „medikamentös“ gegen zerebrovaskuläre Beeinträchtigungen geeignet sind. Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass das Ziel nicht unlösbar ist, sondern dass die verwendeten spezifischen Antagonisten nicht angemessen entwickelt wurden. Die hier präsentierten Daten stützen die Annahme, dass die Argumente für NMDAR-Antagonisten erneut geprüft werden sollten.

Ein wichtiges, relativ neues Konzept betrifft die Population von NMDARs, die während zerebraler Ischämie und vaskulärer Demenz übermäßig aktiviert werden. Aktuelle Erkenntnisse stützen die Annahme, dass pathologische Aktivität unter den meisten Bedingungen überwiegend durch extrasynaptische NMDARs vermittelt wird, wohingegen physiologische synaptische NMDAR-Aktivität neuroprotektive molekulare Signalwege in Neuronen auslöst7,8. Insbesondere ein gut untersuchter NMDAR-Antagonist, Memantin9, stellt ein nicht-kompetitives/schnell wirkendes Medikament („UFO“) dar, das hauptsächlich extrasynaptische/tonisch aktivierte NMDARs gegenüber synaptischen/phasisch aktivierten NMDARs betrifft10,11,12,13. Tatsächlich hat sich Memantin nicht nur in Tierstudien zum Schlaganfall als vielversprechend erwiesen, sondern auch in einer klinischen Phase-2-Studie am Menschen zur Wirksamkeit bei vaskulärer Demenz14,15,16,17. Dennoch wurde das Medikament trotz seiner Zulassung durch die FDA und die EMA für mittelschwere bis schwere Alzheimer-Krankheit aufgrund seiner eher bescheidenen Wirkung nicht in weiteren fortgeschrittenen Studien für ischämische Erkrankungen getestet. Hier entwickeln und charakterisieren wir verbesserte Analoga von Memantin, Aminoadamantannitrate, die in Tiermodellen der zerebralen Ischämie sowohl eine erhöhte Wirksamkeit als auch Sicherheit zeigen. Wichtig ist, dass der detaillierte Nachweis der Zielselektivität, der elektrophysiologischen Eigenschaften und der neurologischen Verhaltenseffekte des Hauptkandidaten mit der Bezeichnung YQW-036/NMI-6979 NitroMemantine18,19 ein vielversprechendes therapeutisches Profil liefert. Frühe pharmakokinetische Studien deuten auch darauf hin, dass dieses Medikament ein geeigneter Kandidat für Erkrankungen im Zusammenhang mit zerebraler Ischämie sein könnte.

Wir zeigen hier, dass NitroMemantine zumindest teilweise einen Vorteil gegenüber Memantin bieten, weil die neuen Medikamente einen doppelten Wirkungsort am NMDAR aufweisen; Dementsprechend ist NitroMemantin bei der Behandlung eines Rattenmodells einer fokalen zerebrovaskulären Erkrankung besser als Memantin. Die Memantin-Einheit, die vorzugsweise übermäßig offene NMDAR-gesteuerte Kanäle in Neuronen blockiert, die einer ischämischen Schädigung ausgesetzt sind, wird verwendet, um eine NO-erzeugende Gruppe auf die Redox-Modulationsstellen dieser NMDARs zu lenken; Diese Redoxstellen durchlaufen dann eine S-Nitrosylierung, um eine Kanaldesensibilisierung zu bewirken, was zu einer doppelten Wirkung der NitroMemantin-Medikamente über eine Kanalblockade gekoppelt mit einer allosterischen Redoxmodulation führt11,18,20. Die Ergebnisse zeigen, dass NitroMemantin deutlich mehr Schutz gegen zerebrale ischämische Angriffe bietet als Memantin und gleichzeitig einen größeren Anteil der synaptischen Übertragung verschont. Am wichtigsten ist vielleicht, dass NitroMemantine ein Beispiel für ein von der FDA zugelassenes Medikament (Memantin) ist, das verwendet wird, um eine zweite Einheit an denselben Rezeptor zu richten, um die Wirksamkeit der Wirkung zu verbessern. Dieses Prinzip könnte als neue Plattform für die Entdeckung klinisch verträglicher Arzneimittel im ZNS dienen.

Wir haben zuvor gezeigt, dass NMDAR durch Memantin über einen offenen Kanalblock10,14 sowie durch Verbindungen auf Stickoxidbasis (NO) über eine oder mehrere allosterische redoxmodulierende Stellen, die einer S-Nitrosylierung unterliegen20,21, antagonisiert werden können ,22. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Memantin bevorzugt mit übermäßig (pathologisch) offenen NMDAR-assoziierten Kanälen interagiert11,13. Darüber hinaus reagieren NO-basierte Verbindungen während einer Hypoxie bevorzugt mit allosterischen Cysteinresten im NMDAR, um übermäßige Aktivität zu begrenzen22. In dem Bemühen, diese Eigenschaften zu kombinieren und ein Medikament mit doppelter Funktion herzustellen, das auf die NO-Gruppe abzielt, um NMDAR-gekoppelte Kanäle pathologisch zu öffnen, haben wir eine NOx-Gruppe (wobei x = 1 oder 2) auf Memantin „huckepack“ getragen. Zu diesem Zweck haben wir zunächst mehrere hundert NitroMemantin-Derivate (und Kontrollgerüste) synthetisiert, um eine detaillierte Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) dieser neuartigen Medikamente durchzuführen19. Von diesen erwies sich eine Reihe von Arzneimitteln als besonders vielversprechend und verfügte über eine Nitrogruppe (−NO2) gegenüber dem Brückenkopfamin (−NH2), das bei physiologischem pH-Wert protoniert (−NH3+) ist (Abb. 1a; Einzelheiten zur chemischen Wirkung siehe „Ergänzende Methoden“) Synthese)18. Wir haben zuvor gezeigt, dass Memantin über dieses Brückenkopfamin an oder in der Nähe der Mg2+-Stelle des NMDAR bindet, insbesondere an der GluN1-Untereinheit (früher als NR1 bezeichnet)23.

Kanalblockierung NMDAR-vermittelter Ströme durch verschiedene Aminoadamantan-Medikamente.

(a) Struktur von Aminoadamantan und Aminoadamantannitraten. 1-Aminoadamantanhydrochlorid (Memantin) hat Methylseitenketten („R“-Gruppen) und enthält keine Nitrogruppe am hinteren Ende des Moleküls. Durch die Hinzufügung der Nitrogruppe für die Redoxfunktion wird die Affinität der Aminoadamantan-Einheit für den NMDAR-assoziierten Ionenkanal verringert. Durch die Verlängerung der „R“-Seitenketten wird dies jedoch ausgeglichen. Während Memantin und YQW-035 Methylseitenketten haben, hat YQW-012 nur Protonen, YQW-036 Ethylgruppen und YQW-037 Propylgruppen. Durch die Verlängerung der Seitenketten wird nicht nur die Bindungsaffinität im Kanal erhöht, sondern auch die Lipophilie und damit die Durchdringung der Blut-Hirn-Schranke erhöht, während gleichzeitig die Wasserlöslichkeit verringert wird. (b) Amantadin (10 μM) hemmte den NMDA-Strom im Steady State weniger als äquimolares Memantin. Äquimolares NitroMemantin YQW-035 zeigt eine geringere Kanalblockade als Memantin, aber mehr als Amantadin. Im Gegensatz dazu blockiert NitroMemantine YQW-036 den Steady-State-Kanal in etwa im gleichen Ausmaß wie Memantin. Zwei-Elektroden-Spannungsklemme von Eizellen, die rekombinante GluN1/GluN2A-Rezeptoren exprimieren, bei einem Haltepotential (Vh) –70 mV. Die Werte sind Mittelwert + Standardabweichung (c) Dosis-Wirkungs-Verhältnis von NitroMemantine YQW-035 bei Vh = −70 mV. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung (d) Dosis-Wirkungs-Verhältnis von NitroMemantine YQW-036 bei Vh = −70 mV. Bei den Werten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichung (e). In primären kortikalen Neuronen der Ratte ergaben Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen, dass 5 μM Memantin oder NitroMemantin YQW-036 bei –75 mV einen ungefähr gleichwertigen Blockadegrad und bei +30 mV eine geringere Blockade erzeugten. Dies zeigt die Spannungsabhängigkeit des Blocks durch die Memantin-Einheit an. Im Histogramm gibt es für jeden Datenpunkt n ≥ 5 Aufzeichnungen pro getestetem Medikament; Linker Balken in jedem Paar für Reaktionen bei −75 mV und rechter Balken für +30 mV-Reaktionen. Die Werte sind Mittelwert + Sem

Wir haben eine Reihe dieser NitroMemantin-Verbindungen im Detail untersucht, die die hochaffine Memantin-Bindungsstelle auf NMDARs nutzen, um die NOx-Gruppe für die Interaktion mit der S-Nitrosylierungs-/Redoxstelle außerhalb der Memantin-Bindungsstelle anzusprechen. Insbesondere fanden wir heraus, dass wir durch das Hinzufügen der funktionellen Gruppe –ONO2 von Nitroglycerin zu Memantin (dargestellt durch die Verbindung YQW-035) die Wirksamkeit der Steady-State-Kanalblockade während elektrophysiologischer Aufzeichnungen von Froschoozyten, die rekombinante NMDARs exprimieren, verringerten (Abb. 1b). . Wir fanden heraus, dass wir durch die Verlängerung der Seitenketten von Memantin den Verlust der Arzneimittelaffinität im Kanal kompensieren konnten, der mit der Hinzufügung der –ONO2-Gruppe einherging. YQW-036 (mit Ethylgruppen) stellt die bevorzugte Seitenkettenlänge dar, da YQW-037 (mit Propylgruppen) nicht in wässrigen Lösungen gelöst werden kann. Der IC50-Wert zur Hemmung des NMDA-induzierten Stroms für kurzfristige Zugaben von YQW-35 (das Memantin ähnliche Methylseitengruppen aufweist) und YQW-36 (bei dem die Seitengruppen zu Ethyl verlängert wurden) beträgt 6,3 bzw. 2,4 μM , wenn unter stationären Bedingungen nach kurzfristiger Arzneimittelzugabe während Spannungsklemmenaufzeichnungen bei einem Haltepotential von –70 mV gemessen (Abb. 1c, d). Diese Werte können mit dem IC50 von Memantin (0,5–1 μM) und Amantadin (~35 μM)10,24 verglichen werden. Somit zeigt das NitroMemantin-Medikament mit der Bezeichnung YQW-036 eine Affinität zum NMDAR-gesteuerten Ionenkanal, die der von Memantin nahe kommt. Während diese Werte in nomineller Abwesenheit von extrazellulärem Mg2+ erhalten wurden, haben wir gezeigt, dass YQW-036 auch durch NMDA hervorgerufene Ströme in Gegenwart normaler Mg2+-Konzentrationen blockiert (ergänzende Abbildung 1).

Darüber hinaus zeigen diese neuen Verbindungen, wie Memantin, eine spannungsabhängige Hemmung der durch NMDA hervorgerufenen Ströme in Aufzeichnungen von zerebrokortikalen Neuronen der Ratte, wie es für einen positiv geladenen Blocker offener Kanäle zu erwarten ist (Abb. 1e). Diese Eigenschaft könnte jedoch teilweise für die relativ schwache klinische Wirksamkeit von Memantin verantwortlich sein. Wenn Neuronen aufgrund des Einstroms positiv geladener Na+- und Ca2+-Ionen25,26 energetisch beeinträchtigt werden und folglich depolarisieren, wird Memantin vom Ionenkanal abgestoßen. Dadurch werden die „kranksten“ Neuronen, die am meisten Neuroprotektion benötigen, anfällig.

Um diesen Mangel zu beheben, zeigen die NitroMemantin-Addukte eine zweite, redoxbasierte Hemmung des NMDA-induzierten Stroms. Dieser zusätzliche allosterische Wirkungsort führt zu einer relativ lang anhaltenden Hemmung von NMDARs, die aus der durch die Nitrogruppe vermittelten S-Nitrosylierung resultiert, wie in spannungsgeklemmten Oozytenaufzeichnungen gezeigt (Abb. 2a)20,27,28. Im Gegensatz zur Kanalblockierung durch die Memantin-Einheit erfordert dieser zweite allosterische Effekt mehrere Minuten Medikamentenzugabe, damit die Wirkung einsetzt (und ist daher in den kurzfristigen Zugaben in Abb. 1 nicht erkennbar) und überlebt das Auswaschen um viele Minuten20,27,28. Um sicherzustellen, dass NitroMemantin während der Auswaschphase nicht in den Kanal gelangt ist, im Gegensatz zu der bei einem Blocker mit offenem Kanal erwarteten anschließenden Agonistenzugabe, haben wir die Anstiegszeiten der einzelnen durch NMDA hervorgerufenen Reaktionen vor und nach der Zugabe von YQW-036 analysiert; Wir fanden heraus, dass die Anstiegszeiten ähnlich waren (Einschub in Abb. 2c), wie erwartet, wenn sich der Antagonist nicht bereits vor der Zugabe des Agonisten im Kanal befand, d. h. gefangen war10,29. Wir können den Redoxeffekt der Nitrogruppe außerdem auf zwei weitere Arten von der Kanalblockade des Aminoadamantankerns unterscheiden. Erstens wird die Wirkung der S-Nitrosylierung durch die systematische Mutation von fünf Cysteinresten aufgehoben (Abb. 2b). Wichtig ist, dass frühere Arbeiten gezeigt haben, dass die Mutation derselben Cysteinreste keine Auswirkungen auf andere Eigenschaften des NMDAR hat, einschließlich der Hemmung an der Mg2+/Memantin-Bindungsstelle im Kanal20,30. Beachten Sie auch, dass unter den hier getesteten Umgebungsluftbedingungen der Großteil der Wirkung durch Cys399 auf die GluN2A-Untereinheit (früher als NR2A bezeichnet) vermittelt wird. Allerdings ist, wie bereits gezeigt22, die Hemmung durch die Nitrogruppe unter hypoxischen Bedingungen, die für Schlaganfall und vaskuläre Demenz relevant sind, deutlich erhöht; Unter diesen Bedingungen tragen vier weitere Cysteinreste in GluN1 und GluN2 zum S-Nitrosylierungseffekt bei. Zweitens kann die S-Nitrosylierung im Gegensatz zur Kanalblockierung durch vorherige Inkubation mit einem kleinen Molekül, einem Sulfhydryl-reaktiven Mittel wie Methanthiosulfonatethylammonium (MTSEA), verhindert werden, das mit denselben Cysteinresten reagiert und so die Wirkung der Nitrogruppe blockiert (Abb . 2c–e).

Durch S-Nitrosylierung vermittelte Redoxeffekte von NitroMemantine YQW-036.

(a) Repräsentative Aufzeichnungen unter Zwei-Elektroden-Spannungsklemme in Eizellen, die Wildtyp- (WT) oder nicht nitrosylierbare Cysteinmutanten-NMDAR-Untereinheiten exprimieren. (b) Quantifizierung des Beitrags von Cysteinresten in verschiedenen NMDAR-Untereinheiten zur Hemmwirkung der S-Nitrosylierung (Daten sind Mittelwert + Standardabweichung für n ≥ 5 Aufzeichnungen pro Datenpunkt, **P < 0,01). (c) In Oozytenaufzeichnungen von durch NMDA hervorgerufenen Strömen unter Spannungsklemme wurde durch die Hemmung durch NitroMemantin (10 μM) jede zusätzliche Wirkung der anschließenden Anwendung des sulfhydrylreaktiven Reagenzes MTSEA (0,5 mM) weitgehend ausgeblendet, wie bei gleichen Cysteinresten zu erwarten war beteiligt. Einschub: Erweiterte Zeitskala, um die Anstiegszeit des durch NMDA hervorgerufenen Stroms vor und nach der NitroMemantin-Zugabe anzuzeigen. (d) Die Hemmung der durch NMDA hervorgerufenen Ströme durch MTSEA verdeckt die redoxvermittelte Hemmwirkung der anschließenden Zugabe von NitroMemantin. (e) Quantifizierung der in c und d dargestellten Effekte. Die Daten sind Mittelwert + Standardabweichung für n ≥ 6 Eizellenaufzeichnungen pro Datenpunkt (*P < 0,005). (f) NitroMemantin hemmt die NMDAR-Aktivität durch S-Nitrosylierung. Die Zugabe von 100 μM NitroMemantin YQW-036, jedoch nicht seines Metaboliten Memantin-OH, hemmte den durch NMDA hervorgerufenen Strom in Oozyten, die GluN1/GluN2A exprimieren. NMDARs wurden unter Spannungsklemmenbedingungen aufgezeichnet, die zur Beobachtung der S-Nitrosylierung verwendet wurden (Vh = –60 mV; Daten repräsentativ für n ≥ 4 Eizellenaufzeichnungen). (g) Eine Mutation der Memantin-Bindungsstelle in der GluN1-Untereinheit des NMDAR verhindert den Redoxeffekt von NitroMemantin. Die Störung der Memantin-Bindungsstelle durch die Mutation GluN1(N616R) hob die redoxvermittelte Aktivität von NitroMemantin (100 μM) auf. Daten repräsentativ für n ≥ 3 Eizellenaufzeichnungen.

Die Memantinbindung im NMDAR-assoziierten Kanal wird durch Mutation an oder in der Nähe der Mg2+-Stelle weitgehend aufgehoben, z. B. in NMDARs mit der Zusammensetzung der GluN1(N616R)/GluN2-Untereinheit23,31. Wir haben die Fähigkeit der Aminoadamantan-Kernstruktur getestet, NOx auf die S-Nitrosylierungs-/Redoxstellen außerhalb der Memantin-Bindungsstelle im Kanal zu lenken, indem wir die Memantin-Bindungsstelle mutiert haben. Da die Mutation des Kanals geringere Ströme verursachte als die von Wildtyp-NMDARs (WT), war es in diesen Experimenten notwendig, relativ hohe Konzentrationen (z. B. 100 μM) NitroMemantin zu verwenden, um das Ausmaß des Effekts zu erhöhen. Wir verglichen unser führendes NitroMemantin-Medikament YQW-036 mit dem 1-Amino-3′,5′-diethyl-7-hydroxy-adamantin-Gerüst ohne Nitrogruppe (hier als Memantin-OH bezeichnet)18,19. Wir fanden heraus, dass eine Mutation der Memantin-Bindungsstelle die Aktivität von NitroMemantinen weitgehend aufhob (Abb. 2f, g und ergänzende Abb. 2), wohingegen eine hohe Konzentration des NO-Donors S-Nitrosocystein (SNOC) sowohl den WT als auch mutierte NMDARs inhibierte ( Ergänzende Abbildung 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aminoadamantan-Kerneinheit die Nitrogruppe zum Rezeptor leiten kann; Eine Mutation der Aminoadamantan-Bindungsstelle verhinderte dieses Targeting.

Um dieses Targeting weiter zu bestätigen, führten wir Biotin-Switch-Assays durch, um S-nitrosylierte Proteine nach systemischer Verabreichung von NitroMemantine YQW-036 bei Ratten zu messen, die einen Schlaganfall erlitten hatten. NitroMemantin, aber nicht Memantin, führte zu einem signifikanten Anstieg der S-Nitrosylierung der GluN1-Untereinheit des NMDAR (Bildung von SNO-GluN1) im kortikalen Parenchym ipsilateral, aber nicht kontralateral zum Schlaganfall (Abb. 3). Im Gegensatz dazu wurde die S-Nitrosylierung anderer Proteine, von denen wir gezeigt haben, dass sie während der Neurodegeneration abweichend nitrosyliert werden, z. B. Dynamin-verwandtes Protein 1 (Drp1), durch NitroMemantin nicht signifikant beeinflusst. Dieses Experiment zeigt die pharmakodynamische Ausrichtung der Nitrogruppe durch NitroMemantine auf NMDARs am Ort der pathophysiologischen Beeinträchtigung.

Die S-Nitrosylierung wird durch NitroMemantine auf das NMDAR ausgerichtet.

(a) Spontan hypertensiven Ratten (SHR) wurde 2 Stunden nach dem Verschluss eine Beladungsdosis Kochsalzlösung, Vehikel, Memantin (Mem) oder NitroMemantin (NitroMem) injiziert und 90 Minuten danach getötet. Es wurden Gehirnlysate hergestellt und Biotin-Switch-Assays durchgeführt, um SNO-GluN1 und SNO-Drp1 sowohl aus der ipsilateralen (Schlaganfall) als auch der kontralateralen (kein Schlaganfall) Hemisphäre nachzuweisen. (b) Die SNO-Proteinspiegel werden als Verhältnis von ipsilateralen zu kontralateralen Ergebnissen über dem Basiskontrollwert dargestellt (Mittelwert + Standardabweichung; n ≥ 4 für jeden Wert, *P < 0,03 im Vergleich zur Kontrolle durch t-Test).

Die meisten NMDAR-Antagonisten verursachen neurologische Verhaltensstörungen, indem sie die normale Neurotransmission blockieren. Memantin weist diese Nebenwirkungen jedoch nicht auf9,11,12,32,33. Zuvor hatten wir Memantin- und NitroMemantin-Medikamente an der Hippocampus-Autapse-Präparation der Ratte und an aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC) abgeleiteten kortikalen Neuronen getestet und gezeigt, dass sie extrasynaptische NMDAR-vermittelte Reaktionen bevorzugt blockierten, was zur Neurodegeneration beitrug7,13,18. Wir berichteten, dass die langfristige Zugabe von NitroMemantin in dieser Hinsicht wirksamer war als die äquimolare Zugabe von Memantin18. Hier zeigen wir, dass NitroMemantine YQW-036 (10 μM) die physiologische synaptische Aktivität stärker verschonte als Memantin (Abb. 4a – c). Darüber hinaus verschonte NitroMemantine die Langzeitpotenzierung (LTP) (Abb. 4d, e), was eine Steigerung der synaptischen Ströme als Reaktion auf wiederholte synaptische Eingaben darstellt, was vermutlich ein elektrisches Korrelat von Lernen und Gedächtnis ist. Ähnlich wie bei Memantin34 wurde auch das Morris-Wasserlabyrinth, ein neurologischer Verhaltenstest für räumliches Lernen und Gedächtnis, durch neuroprotektive Dosen von NitroMemantin nicht beeinträchtigt (Abb. 4f)18,19,35.

Fehlende Wirkung von NitroMemantin auf EPSCs, LTP und Morris-Wasserlabyrinth.

(a) Ganzzellaufzeichnungen evozierter EPSCs aus Hippocampus-Autapsen. Die NMDAR-vermittelte Komponente des EPSC wurde durch 10 μM NitroMemantine YQW-036 in geringerem Maße blockiert als durch 10 μM Memantin. Die AMPA-Komponente des EPSC wurde mit 20 μM CNQX blockiert. Als Kontrolle blockierte 50 μM (2R)-Amino-5-phosphonopentanoat (d-AP5), ein kompetitiver Antagonist der Glutamatbindungsstelle, die NMDAR-Komponente des EPSC vollständig. (b) Der Grad der Blockade des EPSC erhöhte sich bei wiederholter elektrischer Stimulation (Pulse 1–10) in Gegenwart von NitroMemantine YQW-036 nicht signifikant. (c) Die hemmende Wirkung von Memantin war anwendungsabhängig, wobei der 10. ausgelöste EPSC stärker blockiert wurde als der 1.. Daher blockiert äquimolares Memantin die Neurotransmission stärker als NitroMemantin. Für jedes Panel sind die Daten repräsentativ für n ≥ 4 Patch-Clamp-Aufzeichnungen. (d) Die neuroprotektive Dosis von NitroMemantin (NitroMem, 10 μM) hemmte nicht die LTP im CA1 des Hippocampus, die durch einen Hochfrequenzstoß in Hippocampusschnitten der Ratte induziert wurde. (e) Als Kontrolle in den LTP-Experimenten hemmte MK-801 (äquimolar, 10 μM) die LTP-Induktion vollständig (n ≥ 4 Scheiben für Panel d und e). (f) Fehlende Wirkung von NitroMemantine auf die Leistung des Morris-Wasserlabyrinths. Wasserlabyrinth-Test an erwachsenen männlichen spontan hypertensiven Ratten (SHR), die mit NitroMemantin oder Vehikel behandelt wurden. Die Ratten wurden am ersten Tag an das Wasserlabyrinth gewöhnt und dann an den folgenden 4 Tagen getestet, mit 6 Versuchen pro Tag, also insgesamt 24 Versuchen. Die Plattformposition wurde jeden Tag geändert und die Auslösepunkte für jeden Versuch variierten pseudozufällig. Alle Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung; n = 5 für jede Gruppe. Die Spitzen bei den Versuchen 7 und 13 stellen das Ergebnis des ersten Versuchs an den Testtagen 2 und 3 dar und weisen darauf hin, dass die Tiere über Nacht ein gewisses Maß an „Vergesslichkeit“ gegenüber der Aufgabe zeigten und neu lernen mussten. Am vierten Tag (Versuch 19) erlernten die Tiere die neue Position der Plattform schneller.

Ein weiteres bekanntes Problem im Zusammenhang mit NMDAR-Antagonisten ist ihre Neigung, in bestimmten Regionen des Gehirns histologische Schäden zu verursachen. Beispielsweise verursachen hochaffine NMDAR-Antagonisten wie MK-801 neuronale Apoptose, insbesondere im sich entwickelnden Gehirn von Nagetieren36,37. Wir fanden jedoch heraus, dass weder Memantin noch NitroMemantin bei klinisch relevanter Dosierung neuronale Apoptose im sich entwickelnden Großhirn induzierten (ergänzende Abbildung 3).

Als nächstes testeten wir die Fähigkeit des führenden NitroMemantin-Arzneimittels YQW-036 im Vergleich zu Memantin, Neuroprotektion zu bieten, indem wir ein Rattenmodell für fokale zerebrale Ischämie, bestehend aus vorübergehendem Verschluss/Reperfusion der mittleren Hirnarterie (tMCAO/R), verwendeten, ein Modell, das wir und andere detailliert beschrieben haben vorher34,38,39,40. Beachten Sie, dass wir absichtlich ein sehr schweres Modell einer zerebrovaskulären Erkrankung gewählt haben, sodass diese Tiere ohne Behandlung in weniger als zwei Tagen starben. Um einen Vergleich zu ermöglichen, wurden daher behandelte und unbehandelte Tiere einen Tag nach dem Schlaganfall sowohl verhaltensmäßig als auch histologisch untersucht. Zunächst testeten wir eine vollständige Dosis-Wirkungs-Beziehung der Medikamentenkonzentration und der Verabreichungszeit nach einem Schlaganfall, um ein therapeutisches Fenster nach einem Schlaganfall zu erhalten. Um eine signifikante Neuroprotektion zu erreichen, fanden wir heraus, dass wir die Behandlung mit den maximal möglichen Dosen (MFDs) um bis zu zwei (aber nicht drei) Stunden nach dem Verschluss verzögern konnten. Daher verwendeten wir für die vorliegenden Experimente die zuvor bestimmte MFD für Memantin als Beladungsdosis (90,3 μmol/kg oder 20 mg/kg)14,34, die zum Zeitpunkt der Reperfusion intraperitoneal (ip) verabreicht wurde (d. h. 2-30 mg/kg). h nach Okklusion). Für NitroMemantin wurden aufgrund der begrenzten Löslichkeit des Arzneimittels nur etwa 70 % dieser Anfangsdosis injiziert (65,8 μmol/kg). Danach wurde die Standard-Erhaltungsdosis von 4,63 μmol/kg (1 mg/kg) Memantin alle 12 Stunden verabreicht14,34, während die NitroMemantin-Dosis bei 70 % (3,29 μmol/kg) der Memantin-Erhaltungsdosis gehalten wurde. Beide Medikamente boten einen signifikanten histologischen Schutz nach fokaler Ischämie (Abb. 5a). Wichtig ist jedoch, dass nur NitroMemantine zu einer Verbesserung bei funktionellen neurologischen Verhaltenstests führte, die sich auf die motorische Leistung auswirkten, auch wenn der NitroMemantine-MFD niedriger war als der Memantin-MFD (Abb. 5b). (Hinweis: Physiologische Parameter, einschließlich Schädel- und Rektaltemperaturen, Blutdruck und Stoffwechsel, wurden durch die Aufsättigungsdosis von Memantin oder NitroMemantin nicht signifikant beeinflusst (Ergänzungstabelle 1)).

NitroMemantin-Schutz und Wirkmechanismus.

(a) NitroMemantin und Memantin bieten histologischen Schutz im Ratten-tMCAO/R-Modell. Beladungsdosen des Arzneimittels (oder Kochsalzlösungskontrolle) wurden 2 Stunden nach dem Verschluss verabreicht, Erhaltungsdosen 12 Stunden später und die Tiere wurden nach 24 Stunden getötet. Links: Eine niedrigere Dosis von YQW-036 (siehe Text) schützt stärker als Memantin, wie durch 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung beurteilt (*P < 0,05 durch ANOVA mit posthoc Scheffé). ). Rechts: Repräsentative TTC-gefärbte koronale Hirnschnitte gemäß jedem Behandlungsprotokoll. (b) NitroMemantin, aber nicht Memantin, zeigte eine schützende Wirkung bei objektiven neurologischen/Verhaltenstests (siehe experimentelle Verfahren, *P < 0,05 durch ANOVA mit Post-hoc-Scheffé). Anzahl der in Panel a und b getesteten spontan hypertensiven Ratten (SHR): n = 9 für die Kochsalzgruppe; n = 4 für die mit Memantin behandelte Gruppe; n = 5 für die mit NitroMemantin behandelte Gruppe. (c) Die Behandlung mit NitroMemantin reduzierte die Größe des Infarkts im Vergleich zu Memantin, Memantin-OH und Vehikelkontrollen (**P < 0,01 durch ANOVA mit Post-hoc-Scheffé). Anzahl der getesteten SHR: n = 13 für die Kochsalzlösungsgruppe; n = 10 für die mit Memantin behandelte Gruppe; n = 8 für die mit NitroMemantin behandelte Gruppe; n = 7 für die mit Memantin-OH behandelte Gruppe. Die Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung für jedes Panel. (d) Schematische Darstellung der NitroMemantin-Wirkung. Die Adamantan-Einheit sorgt für die gezielte Abgabe einer NOx-Gruppe (wobei x = 1 oder 2) an das NMDAR und stellt so zwei antagonistische Wirkungsorte bereit. Zunächst dringt ein Adamantan wie Memantin ein und bindet bevorzugt an übermäßig offene NMDAR-gekoppelte Kanäle. Zweitens reagiert eine NOx-Gruppe mit der/den Redoxstelle(n), die aus reaktiven Thiolgruppen(n) besteht, außerhalb des Spannungsfelds des Kanals (modifiziert aus Lit. 12).

Um einen direkten Vergleich zu ermöglichen, haben wir als Nächstes äquimolare Konzentrationen von Memantin, NitroMemantin und seinem Abbauprodukt, Memantin-OH, unter Verwendung des MFD von NitroMemantin getestet. Wir beobachteten, dass Memantin und Memantin-OH bei dieser Dosierung keinen signifikanten Schutz boten, wohingegen NitroMemantin bei der histologischen Analyse einen signifikanten Vorteil bot (Abb. 5c). Zusammengenommen stimmen diese Ergebnisse mit der Annahme überein, dass NitroMemantin bei fokalen zerebrovaskulären Beeinträchtigungen bessere Ergebnisse als Memantin bietet und dass dieser zusätzliche Nutzen möglicherweise auf die gezielte Abgabe der Nitrogruppe zurückzuführen ist, was zu einer verbesserten allosterischen Regulierung des NMDAR führt.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir den Wirkungsmechanismus von NitroMemantin, das einen durch Hypoxie regulierten Dual-Site-Antagonismus am NMDAR bewirkt (Abb. 5d). Die Merkmale von NitroMemantine, die ischämischen Neuronen Vorteile bringen können, sind vielfältig: 1. Spannungsabhängige Blockade übermäßig offener, überwiegend extrasynaptischer NMDAR-Kanäle; 2. Gezielte Abgabe der Nitrogruppe an NMDARs durch das Memantin-Gerüst; und 3. Allosterische Regulierung der Kanal-S-Nitrosylierung durch Hypoxie. Das Targeting der Nitrogruppe erfolgt wahrscheinlich, weil Offenkanalblocker einen größeren Teil ihrer Zeit in der Nähe der Kanalmündung verbringen, wodurch die statistische Wahrscheinlichkeit erhöht wird, dass die Nitrogruppe mit vicinalen Cysteinresten reagiert. NitroMemantin moduliert somit den biophysikalischen Parameter der „Gewinnung“ der Kanalaktivität, indem es zwei allosterische „Volumenkontrollen“ auf dem NMDAR41 bereitstellt, dargestellt durch die Wirkung von Memantin im Kanal und S-Nitrosylierung außerhalb davon. Auf diese Weise kann eine übermäßige extrasynaptische NMDAR-Aktivität durch NitroMemantin wirksamer herunterreguliert werden als durch Memantin allein11,18,20,23,32.

Wie genau die S-Nitrosylierung des Kanals erfolgt, ist unklar. Alkylnitrate wie NitroMemantine nitrosieren nicht direkt und setzen auch nicht spontan NO frei. Allerdings bilden sie bei Reaktion mit Thiolen Thionitrate, die sich zu nitrosierenden Sulfenylnitriten umlagern können. Darüber hinaus kann das Cysteinnetzwerk im Rezeptor die erforderliche reduktive Chemie erleichtern21,27,42. Da der Wirkungsort der Nitrogruppe letztendlich außerhalb des Spannungsfelds des Kanals liegt, nimmt der Redoxbeitrag zum NMDAR-Antagonismus nicht ab, wenn das Neuron depolarisiert20,22,28. Somit kann NitroMemantin die übermäßige NMDAR-Aktivität zu einem Zeitpunkt herunterregulieren, an dem Memantin allein an Wirksamkeit verlieren würde.

Es könnte erwartet werden, dass die Nitrogruppe nur während der Zeiträume der Blockierung des offenen Kanals durch die Aminoadamantan-Einheit, d. h. in Gegenwart eines Agonisten, auf das NMDAR gezielt wird. Interessanterweise beobachteten wir jedoch eine redoxvermittelte Wirkung von NitroMemantines, selbst wenn das Arzneimittel über einen längeren Zeitraum zwischen den Anwendungen des NMDA-Agonisten hinzugefügt wurde. Diese Ergebnisse sind auf der Grundlage der bekannten physikalischen Chemie von Aminoadamantanen verständlich, die einen sehr hohen Lipid-Wasser-Verteilungskoeffizienten aufweisen (siehe ergänzende Informationen in Lit. 35 und Zitate darin). Unsere beobachtete Abnahme der Wasserlöslichkeit von NitroMemantine gegenüber Memantine zeigt, dass die Lipophilie noch weiter zunimmt, wenn die Nitrogruppe hinzugefügt wird. Daher scheinen Aminoadamantannitrate wie ein Reservoir in der Lipidmembran zu verbleiben und bereit zu sein, in den Kanal einzudringen, sobald dieser sich öffnet, und dann auch den Redoxeffekt auszulösen35. Wir können sehen, dass YQW-036 vor der NMDA-Anwendung nicht in den Kanal eingetreten ist, da die Anstiegszeit der durch Agonisten induzierten Ströme vor und nach der Anwendung des Antagonisten ähnlich ist (Abb. 2c, Einschub). Wenn sich das Aminoadamantannitrat bereits vor der NMDA-Anwendung im Kanal befunden hätte (d. h. im geschlossenen Kanal gefangen wäre), wäre es unmittelbar nach der Agonistenanwendung langsam herausgekommen, was zu einer langsameren Anstiegszeit des durch NMDA hervorgerufenen Stroms geführt hätte10,29. Bemerkenswert ist außerdem, dass bei Verwendung einer hohen Konzentration von YQW-036 (100 μM statt 1 bis 10 μM) die lipophile Wirkung des Arzneimittels weiter verstärkt wurde, was sich in der langsamen Auswaschung einer Komponente der Hemmwirkung bei wiederholter Agonistaufnahme zeigt Anwendungen (Abb. 2f). Dennoch weist die Tatsache, dass die verlängerte Wirkung von YQW-036 durch die vorherige Zugabe von MTSEA oder die Mutation redoxaktiver Cysteine im NMDAR weitgehend aufgehoben wurde, darauf hin, dass diese Komponente der Hemmwirkung des Arzneimittels nicht allein auf eine erhöhte Lipophilie zurückzuführen ist. Vielmehr lässt sich die Hauptkomponente der verlängerten Hemmwirkung von YQW-036 am besten durch die Interaktion an der/den Redoxstelle(n) des NMDAR erklären, da sie sowohl durch chemische als auch molekulare Eingriffe an den Cysteinresten verhindert wurde, die der Redoxmodulation des Rezeptors zugrunde liegen20 . Darüber hinaus stimmt die Feststellung, dass die Mutation der Hauptbindungsstelle der Aminoadamantan-Einheit im Kanal (GluN1(N616R)) die verlängerte Hemmwirkung von YQW-036 (Abb. 2g) weitgehend aufhob, mit der Annahme überein, dass die Memantin-ähnliche Wirkung vorliegt des Arzneimittels dient dazu, die Nitrogruppe an den Rezeptor zu lenken. Wir können die zusätzliche Möglichkeit nicht ausschließen, dass die S-Nitrosylierung durch NitroMemantin auch die Anfälligkeit des Rezeptors für eine Kanalblockierung über die Adamantan-Einheit erhöht. Darüber hinaus sollten die lipophilen Eigenschaften der Aminoadamantannitrate klinisch vorteilhaft sein, da sie die Konzentration des Arzneimittels erhöhen, das die Blut-Hirn-Schranke durchdringt; Tatsächlich wurde berichtet, dass Aminoadamantane aufgrund ihrer Lipophilie im Gehirn mindestens 20-fach konzentrierter sind als im Plasma (siehe Zitate in Lit. 35).

Wir hatten zuvor Beweise dafür veröffentlicht, dass sich Memantin zumindest teilweise aufgrund seiner relativ schnellen Off-Rate nicht in synaptischen NMDAR-assoziierten Kanälen anreichert; Daher hat Memantin keinen negativen Einfluss auf die NMDAR-vermittelte Komponente erregender postsynaptischer Ströme (EPSCs), die NMDAR-abhängige Induktion von LTP oder Verhaltenstests wie das Morris-Wasserlabyrinth10,23,32. Es wird angenommen, dass die Tatsache, dass Memantin die synaptische/phasische Aktivität weitgehend verschont, während es extrasynaptische/tonisch aktive NMDARs blockiert, seiner klinischen Verträglichkeit und angemessenen klinischen Wirksamkeit in klinischen Studien am Menschen zugrunde liegt11,12,13. Daher könnte unsere Feststellung, dass NitroMemantin noch mehr synaptische Aktivität verschont und gleichzeitig die extrasynaptische Aktivität noch stärker antagonisiert als Memantin, für die erhöhte Wirksamkeit des neuen Arzneimittels verantwortlich sein und ein gutes Zeichen für seine klinische Verträglichkeit in Tests am Menschen sein18. Darüber hinaus ist die hypoxische Potenzierung der Rezeptorhemmung, wie sie bei NO-basierten Verbindungen beobachtet wird22, ein besonders wünschenswertes Merkmal bei Ischämie. Daher könnten hypoxieregulierte, allosterisch zielgerichtete NMDAR-Antagonisten trotz geringer Affinität vielversprechend für zerebrovaskuläre und andere neurodegenerative Erkrankungen sein18,19.

Alle Protokolle für die Verwendung von Wirbeltieren wurden vom Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute (IACUC) genehmigt und alle Experimente folgten den ARAC-Richtlinien. Weitere Methoden und alle zugehörigen Referenzen finden Sie in der Online-Version des Artikels.

Wir haben Adamantannitrate mithilfe veröffentlichter Reaktionen synthetisiert. Syntheseschemata und -verfahren werden in den ergänzenden Methoden beschrieben.

Zwei-Elektroden-Spannungsklemmenaufzeichnungen bei –60 oder –70 mV wurden an Eizellen in Frosch-Ringer-Lösung zwei bis sieben Tage nach der Injektion von NMDAR-Untereinheiten durchgeführt. Die Aufzeichnungen wurden mit einem Oozytenklemmen-OC-725b-Verstärker (Warner Instrument Corporation, Hamden, CT) unter Verwendung der MacLab-Software Version 3.5 (AD Instruments, Milford, MA) bei Raumtemperatur durchgeführt. Stromeinspeisende Elektroden hatten einen Widerstand von 0,5–1 MΩ und spannungsempfindliche Elektroden hatten einen Widerstand von 1–4 MΩ. Beide Elektroden waren mit 3 M KCl gefüllt. Zur kontinuierlichen Superfusion der Eizellen wurde eine Lösung mit 90 mM NaCl, 1 mM KCl, 10 mM HEPES, 1,5 mM BaCl2 und 10–100 μM Glycin, pH 7,5, verwendet. Als zweiwertiges Kation wurde Barium anstelle von Calcium verwendet, um die sekundäre Aktivierung des Ca2+-aktivierten Cl−-Stroms zu minimieren43. In einigen Experimenten wurde der Badlösung 1,2 mM MgCl2 zugesetzt. Die Arzneimittel wurden in Frog-Ringer-Lösung gelöst und durch Superfusion mit einer Flussrate von 2 ml/min aufgetragen. Um einen relativ schnellen Lösungsaustausch zu erreichen, verwendeten wir in einigen Fällen eine Reihe von Pipetten, ähnlich dem „Abwasserrohr“-System, das bei der Patch-Clamp-Aufzeichnung verwendet wird44. Perfusionsartefakte wurden digital aus den Spuren entfernt.

Zur Herstellung primärer zerebrokortikaler Rattenkulturen und autaptischer Hippocampuskulturen wurden etablierte Methoden verwendet45,46,47. Kurz gesagt, für kortikale Kulturen von Ratten wurden Großhirnrinden von Sprague-Dawley-Ratten im Embryonaltag 16–17 (E16–17) präpariert. Nach der Dissoziation wurden die Zellen auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Schalen in DMEM plus Ham's F12 und 10 % hitzeinaktiviertem, mit Eisen angereichertem Kälberserum ausplattiert. Die Kulturen wurden vor der Verwendung mindestens drei Wochen lang bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre aus 5 % CO2/95 % Luft inkubiert, um sicherzustellen, dass ihr gesamtes NMDAR-Repertoire exprimiert wurde. Für autaptische Kulturen wurden am postnatalen Tag 0 (P0) primäre Hippocampuszellen der Ratte geerntet und eine Einzelzellsuspension hergestellt und auf punktförmigen primären Astrozyten-Mikroinseln der Ratte ausplattiert. Die Mikroinseln wurden durch Ausplattieren einer Einzelzellsuspension von Astrozyten auf Mikropunkten aus Kollagen (62,5 μg/ml)/Poly-D-Lysin (50 μg/ml) auf mit Agarose beschichteten Glasdeckgläsern hergestellt. Bei kortikalen Kulturen wurden im Allgemeinen Ganzzellaufzeichnungen an Neuronen nach Superfusion mit 1 μM Tetrodotoxin (TTX) durchgeführt, um spontane Aktivität in den Kulturen zu eliminieren. Für autaptische Kulturen wurden Ganzzellaufzeichnungen von einzelnen Neuronen erhalten, die auf Mikroinseln aus einem oder mehreren Astrozyten wachsen. Die Aufzeichnungen wurden bei Raumtemperatur an Kulturen 14–26 Tage in vitro (DIV) mit einem Patch-Clamp-Verstärker (Axopatch 200B oder MultiClamp 700A Molecular Devices, Union City, CA) durchgeführt. Kultivierte Neuronen wurden mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min mit HEPES-gepufferter externer Lösung (in mM) superfundiert: NaCl, 146; KCl, 2,5; CaCl2, 2; HEPES, 10; D-Glucose, 20; pH 7,4 (NaOH angepasst), 300–310 mOsm. Borosilikatglaskapillaren (GC150F-10, Warner Instruments) wurden verwendet, um Patchpipetten mit einem Mikropipettenzieher (P87, Sutter Instruments, Novato, CA) zu ziehen; Die Widerstände an der offenen Spitze betrugen 2–7 MΩ mit interner Lösung (in mM): CsCl, 140; NaCl, 4; CaCl2, 0,5; HEPES, 10; Na-GTP, 0,5; Mg-ATP, 2; EGTA, 5; pH 7,33 (CsOH eingestellt); 315 mOsm. Einige Experimente verwendeten eine intrazelluläre Lösung auf Cs-Gluconat-Basis (in mM): Cs-Gluconat, 117; NaCl, 9; HEPES, 10; und MgCl2, 2; EGTA, 10; pH 7,2 (NaOH eingestellt). NMDAR-vermittelte Ströme wurden in Abwesenheit von extrazellulärem Magnesium und mit 10–20 μM Glycin aufgezeichnet. Die Medikamente wurden über ein schnelles, ventilgesteuertes Perfusionssystem (Lee Company, Essex, CT) verabreicht. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Antagonisten von Tocris Bioscience (Ellisville, MO) gekauft. Die Daten wurden als gefilterte und digitalisierte elektrische Signale mit der Software PClamp v.10 (Axon Instruments, Union City, CA) erfasst und analysiert. Die Daten wurden mit dem Statistiksoftwarepaket Origin 7 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) angezeigt und analysiert.

Mutierte NMDAR-Untereinheiten wurden unter Verwendung des doppelsträngigen ortsgerichteten Mutagenese-Kits ChameleonTM (Stratagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Zur Verifizierung der Mutation wurde die gesamte kodierende Region sequenziert.

Erwachsene männliche spontan hypertensive Ratten (SHR) wurden entweder mit PBS oder NitroMemantin (65,8 μmol/kg Aufsättigungsdosis, ip, gefolgt von einer Erhaltungsdosis von 3,29 μmol/kg alle 12 Stunden) behandelt. Jede Gruppe bestand aus fünf Ratten (n = 5). Die Behandlung begann für beide Gruppen 48 Stunden vor dem ersten Testtag. Sowohl die Behandlung als auch der Wasserlabyrinth-Test wurden blind durchgeführt. Das Wasserlabyrinth bestand aus einem kreisförmigen Becken mit einem Durchmesser von 150 cm und einer Tiefe von 85 cm. Das Becken wurde so weit gefüllt, dass eine bewegliche, schwarze Plattform mit 1 cm Wasser bedeckt war. Das Wasser wurde durch Zugabe von schwarzer Farbe undurchsichtig gemacht und für die Dauer der fünf Testtage bei Raumtemperatur (20–23 °C) gehalten. Ein weißes Becken mit schwarzem Wasser ermöglichte es der Videokamera, die weißen Ratten mit maximalem Kontrast erfolgreich zu verfolgen. Am ersten Tag wurden die Ratten zur Akklimatisierung 60 Sekunden lang ohne Plattform in den Pool gesetzt. Die Tage 2 bis 5 wurden zum Testen genutzt. Beginnend am zweiten Tag und bis zum fünften Tag wurden die Ratten für insgesamt 24 Versuche (sechs Versuche/Tag) trainiert, um die untergetauchte Plattform zu lokalisieren und zu erreichen. Die Plattform wurde für alle Versuche in jeder Sitzung (jedem Tag) am selben Ort belassen, wechselte jedoch von Sitzung zu Sitzung in einer vorher festgelegten Reihenfolge, sodass sich insgesamt vier einzigartige Standorte ergaben. Darüber hinaus gab es vier mögliche Freisetzungsorte (die vier Himmelsrichtungen am Beckenrand). Die sechs Versuche pro Sitzung/Tag für jedes Tier wurden paarweise an verschiedenen Orten durchgeführt und alle Tiere wurden getestet, bevor mit einem weiteren Versuchspaar fortgefahren wurde. Darüber hinaus war die Reihenfolge der Abwurforte für alle Ratten konstant, wies jedoch wie bei der Plattform eine pseudozufällige Reihenfolge auf, die sich von Sitzung zu Sitzung änderte. Jede Wasserlabyrinth-Testsitzung wurde kontinuierlich durchgeführt, ohne größere Zeitlücken zwischen einzelnen Versuchen oder Versuchsrunden von Paaren. Die maximal zulässige Zeit für das erfolgreiche Erreichen der Plattform durch die Ratte betrug 120 s. Wenn das Tier die Plattform in dieser Zeit nicht erreichte, wurde es manuell geführt und erhielt eine Zeit von 120 Sekunden. Zwischen den beiden Versuchen blieb die Ratte mindestens 5 Sekunden auf der Plattform (dieser Zeitraum wurde bei der Bestimmung der Testdauer nicht berücksichtigt).

Erwachsene Ratten (275–300 g) wurden durch Enthauptung getötet. Die Gehirne wurden schnell aus dem Schädel entnommen und in kalte künstliche Liquor cerebrospinalis (ACSF) gelegt, in mM: NaCl 116; KCl 5,37; NaHPO4 1,02; NaHCO3 26,19; CaCl2 3,2; MgSO4 0,8; D-Glucose 10, pH 7,4, gesättigt mit 95 % O2/5 % CO2, bei 6 °C. Hippocampi wurden mit einem manuellen Gewebezerkleinerer (Stoelting) in 40 μm dicke Scheiben geschnitten. Die verwendeten Schnitte stammten aus dem mittleren Drittel des Hippocampus und waren in einer Ebene senkrecht zur septotemporalen Achse ausgerichtet. Die Scheiben wurden in kaltem ACSF in eine Durchflussschnittstellenkammer überführt und bei 33,5 °C superfusioniert. ACSF und die Luftschnittstelle waren mit 95 % O2/5 % CO2-Blasengas gesättigt. Nach einer 30-minütigen Inkubation wurde die Flüssigkeit gegen frisches ACSF mit oder ohne MK-801, Memantin oder NitroMemantin ausgetauscht und vor der elektrophysiologischen Aufzeichnung weitere 60 Minuten inkubiert.

Exzitatorische postsynaptische Potentiale (EPSPs) im extrazellulären Feld wurden im Stratum radiatum der CA1-Region des Hippocampus nach Stimulation der CA3-Schaffer-Kollateralen gemäß unseren zuvor veröffentlichten Protokollen aufgezeichnet34. Die Aufzeichnungen wurden mit mit ASCF gefüllten Glasmikroelektroden (Widerstand 1–2 MΩ) durchgeführt; Zur Stimulation wurden bipolare Wolframelektroden (Fred Haer) verwendet. Die Reaktionen wurden mit einem Wechselstromverstärker (AM Systems) überwacht. Aufzeichnungselektroden wurden im Stratum radiatum in einer Tiefe von etwa 100 μm unter der Oberfläche und 1000 μm von der Stimulationselektrode entfernt platziert. Feld-EPSPs wurden hervorgerufen und eine Eingabe-/Ausgabekurve erstellt, um die Reizintensität zu bestimmen, die erforderlich ist, um eine halbmaximale Reaktion auszulösen. Nachfolgende Reize wurden in dieser Intensität abgegeben. Gepaarte Impulsreize wurden in Interstimulusintervallen von 6 bis 200 ms abgegeben und für jedes Intervall wurde der Grad der Hemmung oder Erleichterung durch gepaarte Impulse berechnet. Steigungswerte von EPSPs wurden im Paired-Pulse-Testparadigma verwendet. Pro Schicht wurde nur eine Elektrodenplatzierung vorgenommen, um eine Verletzung der Schicht zu verhindern. 10–20 Minuten lang wurden alle 30 Sekunden Basisreaktionen aufgezeichnet. Nach einer Zeitspanne, in der eine stabile Grundlinie beobachtet wurde, wurde eine tetanische Stimulation auf die Scheibe angewendet (100-Hz-Burst für 1 s) und zwar alle 30 s für 60–90 Minuten. Die prozentuale Änderung der EPSP-Steigung nach Tetanus wurde mit dem Ausgangswert vor Tetanus verglichen. Eine ANOVA mit wiederholten Messungen wurde verwendet, um die Steigungen der verschiedenen Gruppen zu vergleichen.

Die Analyse der S-Nitrosylierung von NMDA-Rezeptoren im Rattenhirn wurde mit dem Biotin-Switch-Assay durchgeführt, wie zuvor beschrieben48,49. Freie Thiole in Gewebelysaten wurden mit Methylmethanthiosulfonat blockiert. Anschließend wurden die Proteine mit Aceton ausgefällt und in HEN-Puffer (250 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,1 mM Neocuproin) plus 1 % Natriumdodecylsulfat resuspendiert. Ascorbat wurde zur selektiven Reduktion von Nitrosothiolen verwendet, um freie Thiolgruppen neu zu bilden, die anschließend mit 1 mM Biotin-HPDP (Pierce, Rockford, IL) biotinyliert wurden. Parallelreaktionen wurden ohne Ascorbat als Kontrolle durchgeführt, um die Spezifität der biotinylierten Banden sicherzustellen. Biotinylierte Proteine wurden auf Streptavidin-Agarose-Kügelchen eingefangen und durch Immunblotting analysiert.

Sieben Tage alten Ratten wurde ip Vehikel, MK-801, Memantin oder NitroMemantin injiziert und die Gehirne 24 Stunden später mit TUNEL (terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte dUTP-Nick-End-Markierung) untersucht, um apoptotische Zellen nachzuweisen. Die Quantifizierung wurde mit der optischen Dissektor- und Fraktionatormethode durchgeführt (Cruz-Orive und Weibel, 1990). Kurz gesagt wurden ein Objektiv mit hoher Apertur und ein Zählrahmen (0,05 mm x 0,05 mm, Dissektorhöhe 0,07 mm) verwendet, um Neuronen sichtbar zu machen und zu zählen. Unvoreingenommene Stichproben wurden durch zufällige Auswahl von 8 bis 10 Betrachtungsfeldern innerhalb des Zählrahmens auf verschiedenen Fokusebenen mithilfe der optischen Dissektormethode durchgeführt. Die Dichte normaler Neuronen wurde durch Zählen der Neuronen in 70 μm dicken Schnitten bestimmt, die mit einer Nissl-Färbung (Methylenblau, Azur II) gefärbt waren. Die Zählung erfolgte blind.

Aufgrund ihrer bekannten Schlaganfallneigung, ähnlich wie bei menschlichen Patienten mit Bluthochdruck, verwendeten wir spontan hypertensive Ratten (SHR, Harlan), um tMCAO/R mit der intraluminalen Nahtmethode zu induzieren34,38,39,40. Männliche 200–300 g SHR wurden mit 3 % Isofluran in 30 % Sauerstoff/70 % Lachgas unter Verwendung eines Anästhesiemittelverdampfers und eines Durchflussmessers anästhesiert. Die Körpertemperatur wurde mit einem homöothermischen Temperatursystem auf 37 °C gehalten. Zur Überwachung des relativen zerebralen Blutflusses (rCBF) während des chirurgischen Eingriffs und der Genesung wurde ein Laser-Doppler-Monitor verwendet. rCBF-Messungen wurden unmittelbar nach der Anästhesie, nach dem Verschluss der MCA, unmittelbar vor und unmittelbar nach dem Zurückziehen des Nahtmaterials zur Einleitung der Reperfusion durchgeführt. Um einen Schlaganfall einzuleiten, wurde ein Schnitt in der Mittellinie vorgenommen, um die rechte Arteria carotis communis, die A. carotis externa und die A. carotis interna freizulegen. Die Äste der Arteria occipitalis der A. carotis externa wurden isoliert und zusammen mit den terminalen A. lingualis- und maxillaris-Ästen mit einem Elektrokauterisationsgerät koaguliert. Die A. carotis interna wurde isoliert und sorgfältig vom angrenzenden Vagusnerv getrennt. Die Arteria pterygopalatinum wurde in der Nähe ihres Ursprungs abgebunden, zwei lose Nähte wurden um den Stumpf der A. carotis externa gelegt und ein Mikroaneurysma-Clip an der A. carotis externa in der Nähe ihrer Gabelung mit der A. carotis interna angebracht. In der äußeren Halsschlagader wurde eine kleine Punktionsöffnung angelegt, ein Monofilament (intraluminale Naht) durch die Öffnung eingeführt und die Nähte um das Lumen, das das Filament enthielt, festgezogen. Der Mikroaneurysma-Clip wurde von der A. carotis externa entfernt und das Monofilament vorsichtig aus dem Lumen der A. carotis externa über eine Strecke von etwa 19 bis 20 mm über die Gabelung der A. carotis communis in die A. carotis interna vorgeschoben, bis der Blutfluss nachließ (≥80 % Reduzierung durch rCBF-Messung). Die Naht um den Stumpf der äußeren Halsschlagader wurde festgezogen, um eine Blutung zu verhindern. Nach 2 Stunden wurden die Nähte entfernt, das Filament herausgezogen und die Inzisionsnaht entfernt, wobei sich rCBF bei Reperfusion um mindestens 75 % erholte. Unmittelbar vor der Reperfusion wurde den Ratten Memantin, NitroMemantin oder Memantin-OH per ip-Injektion in Kochsalzlösung oder einem äquivalenten Volumen an Vehikel allein verabreicht. In ersten Experimenten betrug die Beladungsdosis für jedes Arzneimittel 20 mg/kg, was 90,3 μmol/kg für Memantin und 65,8 μmol/kg für NitroMemantin YQW-036 entspricht (die etwa 30 % niedrigere Dosis von NitroMemantin war aufgrund seiner geringeren Löslichkeit erforderlich). in wässriger Lösung). Erhaltungsdosen (4,63 μmol/kg Memantin und 3,29 μmol/kg NitroMemantin, entsprechend 1 mg/kg oder jeweils) wurden 12 Stunden nach der Aufsättigungsdosis verabreicht. Wie bereits gezeigt, erzeugt diese Memantin-Dosis eine biologisch wirksame, neuroprotektive Konzentration von 5–10 μM an der Mündung des NMDAR-assoziierten Ionenkanals35. In nachfolgenden Experimenten wurde äquimolares Memantin, NitroMemantin YQW-036 oder Memantin-OH unter Verwendung der oben beschriebenen niedrigeren NitroMemantin-Dosis verwendet. Die Nagetiere wurden 24 Stunden nach dem Verschluss getötet und die Größe des Hirninfarkts wurde histologisch durch 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC)-Färbung50 bewertet.

Jedes erwachsene Tier wurde unmittelbar nach der Filamententfernung und erneut einen Tag nach der Reperfusion (vor der Tötung) einer neurologischen Untersuchung51 unterzogen. Jedem Tier wurde eine objektive Verhaltensbewertung von 0–4 zugewiesen: 0 bedeutet kein erkennbares neurologisches Defizit; 1 Fehler beim Ausstrecken der linken Vorderpfote; 2 kreist nach links; 3 fällt nach links; 4 kann nicht spontan gehen. Die 24 Stunden nach dem Schlaganfall erhaltenen Ergebnisse wurden für jeden Zeitpunkt jeder Behandlungsgruppe gemittelt und als neurologische Bewertung dargestellt.

Die Werte für die elektrophysiologischen und histologischen Experimente werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Um statistische Unterschiede zwischen den Gruppen zu testen, verwendeten wir einen Student-t-Test (zweiseitig) für zweiseitige Vergleiche und eine ANOVA mit Post-hoc-Tests für mehrere Vergleiche. Bei Verhaltenstests wurde mit nichtparametrischen Tests (Mann-Whitney-U-Test) die Signifikanz der Unterschiede unter den verschiedenen Bedingungen beurteilt. Ein Wert von P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Zitierweise für diesen Artikel: Takahashi, H. et al. Pharmakologisch gezielter NMDA-Rezeptor-Antagonismus durch NitroMemantine bei zerebrovaskulären Erkrankungen. Wissenschaft. Rep. 5, 14781; doi: 10.1038/srep14781 (2015).

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Lo, EH 2013 Thomas Willis Award Vortrag: Ursache und Zusammenarbeit für die Schlaganfallforschung. Schlaganfall 45, 305–308 (2014).

Artikel Google Scholar

Simon, RP, Swan, JH, Griffiths, T. & Meldrum, BS Die Blockade von N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren kann vor ischämischen Schäden im Gehirn schützen. Science 226, 850–852 (1984).

Artikel CAS ADS Google Scholar

Chen, H. et al. Oxidativer Stress bei ischämischer Hirnschädigung: Mechanismen des Zelltods und potenzielle molekulare Ziele für die Neuroprotektion. Antioxid. Redox. Signal. 14, 1505–1517 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Dirnagl, U., Iadecola, C. & Moskowitz, MA Pathobiologie des ischämischen Schlaganfalls: eine integrierte Sicht. Trends Neurosci. 22, 391–397 (1999).

Artikel CAS Google Scholar

Kemp, JA & McKernan, RM NMDA-Rezeptorwege als Wirkstoffziele. Nat. Neurosci. 5 Suppl, 1039–1042 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Tymianski, M. Neue Mechanismen gestörter zellulärer Signalübertragung bei Gehirnischämie. Nat. Neurosci. 14, 1369–1373 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Hardingham, GE & Bading, H. Synaptische versus extrasynaptische NMDA-Rezeptor-Signalisierung: Auswirkungen auf neurodegenerative Erkrankungen. Nat. Rev. Neurosci. 11, 682–696 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Parsons, MP & Raymond, LA Extrasynaptische NMDA-Rezeptorbeteiligung bei Störungen des Zentralnervensystems. Neuron 82, 279–293 (2014).

Artikel CAS Google Scholar

Rogawski, MA & Wenk, GL Die neuropharmakologische Grundlage für den Einsatz von Memantin bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit. CNS Drug Rev. 9, 275–308 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Chen, HS & Lipton, SA Mechanismus der Memantinblockade NMDA-aktivierter Kanäle in retinalen Ganglienzellen der Ratte: nichtkompetitiver Antagonismus. J. Physiol. 499 (Teil 1), 27–46 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Lipton, SA Paradigmenwechsel in der Neuroprotektion durch NMDA-Rezeptorblockade: Memantin und darüber hinaus. Nat. Rev. Drug Discov. 5, 160–170 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Lipton, SA Pathologisch aktivierte Therapeutika zur Neuroprotektion. Nat. Rev. Neurosci. 8, 803–808 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Xia, P., Chen, HS, Zhang, D. & Lipton, SA Memantin blockiert bevorzugt extrasynaptische gegenüber synaptischen NMDA-Rezeptorströmen in Hippocampus-Autapsen. J. Neurosci. 30, 11246–11250 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Chen, HS et al. Offene Kanalblockierung von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Reaktionen durch Memantin: therapeutischer Vorteil gegenüber NMDA-Rezeptor-vermittelter Neurotoxizität. J. Neurosci. 12, 4427–4436 (1992).

Artikel CAS Google Scholar

Erkinjuntti, T., Roman, G., Gauthier, S., Feldman, H. & Rockwood, K. Neue Therapien für vaskuläre Demenz und vaskuläre kognitive Beeinträchtigung. Schlaganfall 35, 1010–1017 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Orgogozo, JM, Rigaud, AS, Stoffler, A., Mobius, HJ & Forette, F. Wirksamkeit und Sicherheit von Memantin bei Patienten mit leichter bis mittelschwerer vaskulärer Demenz: eine randomisierte, placebokontrollierte Studie (MMM 300). Schlaganfall 33, 1834–1839 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Shih, AY et al. Der kleinste Schlaganfall: Der Verschluss eines eindringenden Gefäßes führt zu einem Infarkt und einem kognitiven Defizit. Nat. Neurosci. 16, 55–63 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Talantova, M. et al. Abeta induziert die Freisetzung von astrozytischem Glutamat, die Aktivierung des extrasynaptischen NMDA-Rezeptors und den synaptischen Verlust. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 110, E2518–2527 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Wang, Y. et al. Die Pharmakologie von Aminoadamantannitraten. Curr. Alzheimer Res. 3, 201–204 (2006).

Artikel ADS Google Scholar

Choi, YB et al. Molekulare Grundlagen der NMDA-Rezeptor-gekoppelten Ionenkanalmodulation durch S-Nitrosylierung. Nat. Neurosci. 3, 15–21 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Lipton, SA & Stamler, JS Wirkungen redoxbezogener Kongenere von Stickoxid am NMDA-Rezeptor. Neuropharmacology 33, 1229–1233 (1994).

Artikel CAS Google Scholar

Takahashi, H. et al. Hypoxie verstärkt die durch S-Nitrosylierung vermittelte Hemmung des NMDA-Rezeptors über ein Thiol-Sauerstoffsensormotiv. Neuron 53, 53–64 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Chen, HS & Lipton, SA Pharmakologische Auswirkungen zweier unterschiedlicher Mechanismen der Wechselwirkung von Memantin mit N-Methyl-D-Aspartat-gesteuerten Kanälen. J. Pharmacol. Exp. Dort. 314, 961–971 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Blanpied, TA, Clarke, RJ & Johnson, JW Amantadin hemmt NMDA-Rezeptoren, indem es den Kanalverschluss während der Kanalblockade beschleunigt. J. Neurosci. 25, 3312–3322 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Silver, IA & Erecinska, M. Intrazelluläre und extrazelluläre Veränderungen von [Ca2+] bei Hypoxie und Ischämie im Rattenhirn in vivo. J. Gen. Physiol. 95, 837–866 (1990).

Artikel CAS Google Scholar

Wollmuth, LP, Kuner, T., Seeburg, PH & Sakmann, B. Differenzieller Beitrag der NR1- und NR2A-Untereinheiten zum Selektivitätsfilter rekombinanter NMDA-Rezeptorkanäle. J. Physiol. 491 (Teil 3), 779–797 (1996).

Artikel CAS Google Scholar

Lipton, SA et al. Ein redoxbasierter Mechanismus für die neuroprotektiven und neurodestruktiven Wirkungen von Stickoxid und verwandten Nitrosoverbindungen. Nature 364, 626–632 (1993).

Artikel CAS ADS Google Scholar

Lipton, SA et al. Cystein-Regulierung der Proteinfunktion – am Beispiel der NMDA-Rezeptor-Modulation. Trends Neurosci. 25, 474–480 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Blanpied, TA, Boeckman, FA, Aizenman, E. & Johnson, JW Trapping-Kanalblockierung von NMDA-aktivierten Reaktionen durch Amantadin und Memantin. J. Neurophysiol. 77, 309–323 (1997).

Artikel CAS Google Scholar

Choi, Y., Chen, HV & Lipton, SA Drei Paare von Cysteinresten vermitteln sowohl die Redox- als auch die Zn2+-Modulation des nmda-Rezeptors. J. Neurosci. 21, 392–400 (2001).

Artikel CAS Google Scholar

Kotermanski, SE, Wood, JT & Johnson, JW Die Bindung von Memantin an eine oberflächliche Stelle der NMDA-Rezeptoren trägt zum teilweisen Einfangen bei. J. Physiol. 587, 4589–4604 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Chen, HS & Lipton, SA Die chemische Biologie klinisch verträglicher NMDA-Rezeptorantagonisten. J. Neurochem. 97, 1611–1626 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Parsons, CG, Stoffler, A. & Danysz, W. Memantin: ein NMDA-Rezeptorantagonist, der das Gedächtnis durch Wiederherstellung der Homöostase im glutamatergen System verbessert – zu wenig Aktivierung ist schlecht, zu viel ist noch schlimmer. Neuropharmacology 53, 699–723 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Chen, HS et al. Neuroprotektive Konzentrationen des N-Methyl-D-Aspartat-Offenkanalblockers Memantin sind nach postischämischer Verabreichung ohne zytoplasmatische Vakuolisierung wirksam und blockieren weder das Labyrinthlernen noch die Langzeitpotenzierung. Neuroscience 86, 1121–1132 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Okamoto, S. et al. Das Gleichgewicht zwischen synaptischer und extrasynaptischer NMDA-Rezeptoraktivität beeinflusst Einschlüsse und Neurotoxizität von mutiertem Huntingtin. Nat. Med. 15, 1407–1413 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Ikonomidou, C. et al. Blockade von NMDA-Rezeptoren und apoptotische Neurodegeneration im sich entwickelnden Gehirn. Science 283, 70–74 (1999).

Artikel CAS ADS Google Scholar

Olney, JW et al. Medikamenteninduzierte apoptotische Neurodegeneration im sich entwickelnden Gehirn. Gehirnpathol. 12, 488–498 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Gu, Z. et al. Ein hochspezifischer Inhibitor der Matrix-Metalloproteinase-9 schützt Laminin vor der Proteolyse und Neuronen vor der Apoptose bei vorübergehender fokaler zerebraler Ischämie. J. Neurosci. 25, 6401–6408 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Gu, Z. et al. S-Nitrosylierung von Matrix-Metalloproteinasen: Signalweg zum neuronalen Zelltod. Wissenschaft 297, 1186–1190 (2002).

Artikel CAS ADS Google Scholar

Wang, YF et al. Gewebeplasminogenaktivator (tPA) erhöht die neuronale Schädigung nach fokaler zerebraler Ischämie bei Wildtyp- und tPA-defizienten Mäusen. Nat. Med. 4, 228–231 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Lipton, SA Ablehnen, aber nicht ausschalten. Natur 428, 473 (2004).

Artikel CAS ADS Google Scholar

Ischiropoulos, H. et al. Peroxynitrit-vermittelte Tyrosinnitrierung, katalysiert durch Superoxiddismutase. Bogen. Biochem. Biophys. 298, 431–437 (1992).

Artikel CAS Google Scholar

Leonard, JP & Kelso, SR Die offensichtliche Desensibilisierung von NMDA-Reaktionen in Xenopus-Oozyten beinhaltet einen kalziumabhängigen Chloridstrom. Neuron 4, 53–60 (1990).

Artikel CAS Google Scholar

Vyklicky, L., Jr., Benveniste, M. & Mayer, ML Modulation der N-Methyl-D-Asparaginsäure-Rezeptor-Desensibilisierung durch Glycin in Maus-kultivierten Hippocampus-Neuronen. J. Physiol. 428, 313–331 (1990).

Artikel CAS Google Scholar

Bekkers, JM & Stevens, CF Erregende und hemmende autaptische Ströme in isolierten Hippocampus-Neuronen, die in Zellkultur gehalten werden. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 88, 7834–7838 (1991).

Artikel CAS ADS Google Scholar

Segal, MM Epileptiforme Aktivität in Mikrokulturen, die ein erregendes Hippocampus-Neuron enthalten. J. Neurophysiol. 65, 761–770 (1991).

Artikel CAS Google Scholar

Segal, MM & Furshpan, EJ Epileptiforme Aktivität in Mikrokulturen, die eine kleine Anzahl von Hippocampus-Neuronen enthalten. J. Neurophysiol. 64, 1390–1399 (1990).

Artikel CAS Google Scholar

Jaffrey, SR & Snyder, SH Die Biotin-Switch-Methode zum Nachweis von S-nitrosylierten Proteinen. Wissenschaft. STKE 2001, S. 1 (2001).

CAS PubMed Google Scholar

Uehara, T. et al. S-nitrosylierte Protein-Disulfid-Isomerase bringt Proteinfehlfaltung mit Neurodegeneration in Verbindung. Natur 441, 513–517 (2006).

Artikel CAS ADS Google Scholar

Bederson, JB et al. Bewertung von 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid als Farbstoff zur Erkennung und Quantifizierung experimenteller Hirninfarkte bei Ratten. Schlaganfall 17, 1304–1308 (1986).

Artikel CAS Google Scholar

Mackensen, GB et al. Neuroprotektion durch verzögerte postischämische Verabreichung eines katalytischen Metalloporphyrin-Antioxidans. J. Neurosci. 21, 4582–4592 (2001).

Artikel CAS Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken Mark Washburn für die Durchführung vorläufiger Experimente zu frühen Derivaten der NitroMemantin-Arzneistoffreihe, Jonathan Stamler für seinen originellen Beitrag zur Idee der therapeutischen allosterischen Regulation, dem Design dieser Verbindungsklasse und seiner Hilfe beim Verfassen des Manuskripts, Greg Went für seine Hilfe bei der Arzneimittelentwicklung und Traci Fang Newmeyer und Ravi Agarwal für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH-Zuschüsse P01 HD29587, R01 EY05477, R21 NS080799 und P30 NS076411, durch den Zuschuss W81XWH-13-0053 des Verteidigungsministeriums (Armee) (an SAL) und durch ein Postdoctoral Fellowship 09POST2120061 der American Heart Association (an PX) unterstützt ) und durch eine von Unternehmen gesponserte Forschungsvereinbarung von Adamas Pharmaceuticals, Inc.

Maria Talantova, Emily A. Holland, Nobuki Nakanishi, Scott R. McKercher, Tomohiro Nakamura und Stuart A. Lipton

Aktuelle Adresse: Neurodegenerative Disease Center, Scintillon Institute, San Diego, CA, 92121

Gary Tong

Derzeitige Adresse: Lundbeck, Inc., Deerfield, IL, 60015

Takahashi Hiroto, Xia Peng und Cui Jiankun haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Forschungszentrum für Neurowissenschaften und Alterung, Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute, La Jolla, 92307, Kalifornien, USA

Hiroto Takahashi, Peng Lipton

Panorama Research, Inc., Sunnyvale, 94089, Kalifornien, USA

James W. Larrick

Institut für neue Arzneimittelforschung, Jinan University College of Pharmacy, Guangzhou, 510632, China

Yuqiang Wang

Abteilung für Neurowissenschaften, University of California San Diego School of Medicine, La Jolla, 92039, Kalifornien, USA

Stuart A. Lipton

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SAL konzipierte und überwachte alle Experimente und erstellte das Manuskript. YW und JWL führten eine chemische Synthese von Aminoadamantannitraten, eine Analyse der Struktur-Aktivitäts-Beziehung und eine Hit-to-Lead-Optimierung durch. HT, PX, MT, TT, JP-C., KB und DZ führten elektrophysiologische Experimente durch oder analysierten sie. JC und SS führten die Operation am Tiermodell der zerebralen Ischämie mit Unterstützung von WLTN durch, führten mit Unterstützung von EHSRM den pharmakodynamischen Test durch, der die S-Nitrosylierung des NMDA-Rezeptors zeigte, und NN halfen bei der Datenanalyse, führten statistische Analysen durch, bereiteten Zahlen vor und halfen bei Experimenten. SAL und SRM haben das Manuskript geschrieben und alle Co-Autoren waren an der Bearbeitung des Manuskripts beteiligt.

Die Autoren erklären, dass SAL der Erfinder weltweiter Patente für die Verwendung von Memantin und NitroMemantin bei neurodegenerativen Erkrankungen ist; YW und JWL sind außerdem als Erfinder von Patenten für NitroMemantine benannt. Gemäß den Richtlinien der Harvard University beteiligt sich SAL an einer Vereinbarung zur Aufteilung der Lizenzgebühren mit seiner ehemaligen Einrichtung Boston Children's Hospital/Harvard Medical School, die das Medikament Memantin (Namenda®) an Forest Laboratories/Actavis lizenziert hat. Darüber hinaus sind SAL und JWL wissenschaftliche Gründer von Adamas Pharmaceuticals, Inc., das mit Forest/Actavis Memantinformulierungen der zweiten Generation entwickelt hat.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Takahashi, H., Xia, P., Cui, J. et al. Pharmakologisch gezielter NMDA-Rezeptor-Antagonismus durch NitroMemantine bei zerebrovaskulären Erkrankungen. Sci Rep 5, 14781 (2015). https://doi.org/10.1038/srep14781

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Eingegangen: 11. März 2015

Angenommen: 09. September 2015

Veröffentlicht: 19. Oktober 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep14781

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