Ozonbelastung stört die sexuelle Kommunikation von Insekten

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1186 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die sexuelle Kommunikation von Insekten beruht häufig auf Sexualpheromonen. Die meisten Insektenpheromone enthalten jedoch Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen und werden möglicherweise durch Oxidation abgebaut. Hier zeigen wir, dass häufig berichtete erhöhte Mengen an anthropozänem Ozon alle beschriebenen männlich-spezifischen Pheromone von Drosophila melanogaster oxidieren können, was zu verringerten Mengen an Pheromonen wie cis-Vaccenylacetat und (Z)−7-Tricosen führt. Gleichzeitig ist die Akzeptanz ozonexponierter Männer durch Frauen erheblich verzögert. Interessanterweise zeigen Gruppen ozonexponierter Männchen auch ein deutlich erhöhtes Maß an Männchen-Männchen-Balzverhalten. Bei der Wiederholung ähnlicher Experimente mit neun anderen Drosophilidenarten beobachten wir bei acht von ihnen einen Pheromonabbau und/oder eine gestörte Geschlechtserkennung. Unsere Daten deuten darauf hin, dass anthropozäne Ozonkonzentrationen Doppelbindungen in einer Vielzahl von Insektenpheromonen stark oxidieren können, was zu Abweichungen bei der sexuellen Erkennung führt.

Das Finden und Beurteilen eines geeigneten Partners ist für die Fortpflanzung vieler Tiere von entscheidender Bedeutung. In diesem Zusammenhang verwenden die meisten Insekten Sexualpheromone, um Artgenossen von Allospezifika zu unterscheiden und das Geschlecht und den Paarungsstatus eines potenziellen Partners zu identifizieren1,2,3. Ein besonders gut untersuchtes Pheromon ist cis-Vaccenylacetat (cVA). Diese Verbindung wird vom Männchen Drosophila melanogaster produziert und steuert die Geschlechtserkennung. Es wurde gezeigt, dass die bei einem Männchen vorhandene CVA-Menge mit der Attraktivität des Männchens für ein Weibchen korreliert4,5,6,7. Während der Kopulation überträgt das Männchen jedoch, um seine Vaterschaft sicherzustellen, cVA auf das Weibchen und verringert dadurch die Attraktivität des Weibchens für andere Männchen6,8,9. cVA ist daher für Frauen attraktiv, für Männer jedoch abstoßend. Es ist bekannt, dass viele Fliegenarten der Gattung Drosophila männlich-spezifische Verbindungen produzieren, die ihre Attraktivität für Artgenossen erhöhen, während der Kopulation übertragen werden und daher ähnliche pheromonähnliche Rollen wie cVA in Drosophila melanogaster zu erfüllen scheinen10,11. Obwohl sie chemisch vielfältig sind, haben die meisten dieser potenziellen Pheromone ein gemeinsames spezifisches Merkmal: Sie enthalten Kohlenstoff-Doppelbindungen.

Während des Anthropozäns stehen Insekten, die mit solchen ungesättigten Pheromonen kommunizieren, vor einer potenziellen Herausforderung: der Oxidation von Doppelbindungen durch erhöhte Mengen oxidativer Schadstoffe wie Ozon12. Pheromonsysteme haben sich in vorindustrieller Zeit entwickelt und troposphärische Ozonwerte erreichten nur 10 ppb13. Aufgrund der kontinuierlichen Emission von Stickoxiden (NOx), flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) und dem Klimawandel ist der Ozonwert jedoch bereits auf einen weltweiten Jahresdurchschnitt von 40 ppb14 gestiegen. Lokale extreme Ozonereignisse wurden für Industrie- und Stadtgebiete beispielsweise in Mexiko, Bangladesch, Marokko und China gemeldet15,16,17,18. Ozon erreichte in Mexiko eine Konzentration von bis zu 210 ppb (das dauerte eine Stunde) und der höchste über 10 Stunden gemessene Mittelwert überstieg 170 ppb15. Obwohl die Ozonwerte das ganze Jahr über stark schwanken, ist der jährlich gemessene Durchschnitt z. B. im Nordosten Chinas von 45 ppb im Jahr 2003 auf 62 ppb im Jahr 2015 gestiegen16 und hat ein über 8 Stunden gemitteltes Tagesmaximum (MDA8) von 140 ppb erreicht im März 202019.

Hier zeigen wir, dass selbst eine kurzfristige Exposition gegenüber Ozonwerten von 100 ppb zum Abbau vieler Drosophilidenpheromone führt und beispielsweise die Attraktivität von Männchen für Weibchen bei 7 von 10 getesteten Arten verringert. Interessanterweise steigert die Ozonexposition das Balzverhalten zwischen Männchen dramatisch, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass beim Abbau männlicher Pheromone keine Diskriminierung aufgrund des Geschlechts erfolgt.

Wir untersuchten zunächst, ob die Menge an cVA von D. melanogaster (CS)-Männchen durch die Ozonexposition beeinflusst wird. Im Vergleich zu Kontrollfliegen, die nur der Umgebungsluft (mit 4,5 ± 0,5 ppb Ozon) ausgesetzt waren, stellten wir tatsächlich geringere Mengen an cVA bei Fliegen fest, die 2 Stunden lang 100 ppb Ozon ausgesetzt waren (Abb. 1, schematische Darstellung des Ozons). Aufbau siehe Abb. S1) und erhöhte Mengen an Heptanal (Abb. S2), einem potenziellen Abbauprodukt der cVA-Oxidation. Interessanterweise wurden viele andere Pheromonverbindungen wie (Z)−7-Tricosen (7-T) und (Z)−7-Pentasen (7-P)20, von denen bekannt ist, dass sie am Fortpflanzungsverhalten beteiligt sind, nach der Ozonexposition verringert. auch (Abb. 1c).

a Schematische Darstellung des TDU GC-MS-Analyseprotokolls. Männliche Fliegen wurden zunächst Ozon oder Umgebungsluft ausgesetzt. Ihr chemisches Profil wurde dann mittels TDU GC-MS analysiert. b Chemische Profile von D. melanogaster-Männchen nach Exposition gegenüber Ozon (rosa) oder Umgebungsluft (grau). Chromatogramme (linkes Feld), chemische Strukturen männlicher Pheromone und kutikulärer Kohlenwasserstoffe, CKW (rechtes Feld). c, Quantitative Analyse männlicher Pheromone und CHCs. (Zweiseitiger ungepaarter t-Test; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes fragten wir, ob diese Veränderungen im chemischen Profil der Männchen ihre Attraktivität für weibliche Fliegen beeinflussen würden. Daher setzten wir männliche Fliegen entweder 30 Minuten lang Ozon im Bereich von 50 bis 200 ppb oder als Kontrolle Umgebungsluft aus und testeten anschließend ihr Balzverhalten und ihren Paarungserfolg mit nicht exponierten Weibchen in einem No-Choice-Paarungstest (Abb. 2a). Ozonexponierte Männchen unterschieden sich nicht von Kontrollmännchen hinsichtlich ihrer Balzlatenz (d. h. der Zeit, bis sie begannen, das Weibchen zu umwerben; Abb. 2a) und des Balzprozentsatzes (d. h. dem Prozentsatz der Männchen, die Weibchen umwarben, Abb. S3). Dies zeigt, dass die Motivation des Mannes zur Paarung offenbar nicht durch eine frühere Ozonexposition beeinflusst wird. Obwohl sich die meisten Männchen schließlich innerhalb der 10-minütigen Beobachtung paarten (Abb. S3), zeigten gleichzeitig ozonexponierte Männchen eine längere Paarungslatenz als Kontrollmännchen (d. h. sie brauchten mehr Zeit, um vom Weibchen akzeptiert zu werden; Abb. 2a). . Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass ozonexponierte Männchen für die umworbenen Weibchen weniger attraktiv waren, was gut mit der oben erwähnten Verringerung der Pheromone bei Ozonexposition übereinstimmt. Wir beobachteten keine Wirkung von Ozon, wenn Fliegen nur 15 Minuten lang exponiert waren, während die Paarungslatenz der Männchen nach zweistündiger Ozonexposition oder nach Exposition gegenüber höheren Ozonwerten (150 ppb und 200 ppb) erneut erhöht war (Abb. S4). Interessanterweise erlangten die Männchen nach 2-stündiger Ozonexposition nach einem Tag nicht ihr ursprüngliches chemisches Profil und ihre Attraktivität für Weibchen zurück, zeigten jedoch nach 5 Tagen normale Pheromonwerte und eine normale Attraktivität (Abb. S5).

a Balzlatenz zwischen Männchen und Weibchen und Paarungslatenz nach männlicher Exposition gegenüber unterschiedlichen Ozonwerten (Stichprobengröße in Klammern angegeben, Dunnett-Test für mehrere Vergleiche mit der Umgebungsluftkontrolle; Gruppen, die sich deutlich von der Kontrolle unterscheiden: *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). b Balzverhalten zwischen Männchen und Männchen, nachdem beide Männchen Ozon ausgesetzt waren. Werbelatenz, Dunnett-Test für mehrere Vergleiche; Balzprozentsatz (Prozentsatz der Experimente, die zur Balz von Männern führten), exakter Fisher-Test mit Holm-Bonferroni-Korrektur für mehrfachen Vergleich mit der Kontrollgruppe; erhebliche Unterschiede zur oben dargestellten Kontrolle. c SSR-Dosis-Wirkungs-Kurve des Or67d-Neurons (at1 sensillum) aus männlichem D. melanogaster. Oberes Panel, schematisches SSR-Verfahren; Daten dargestellt als Mittelwert ± SE, N = 10 für entweder Luft- oder Ozonexposition (t-Test für jede Konzentration; NS zeigt keinen signifikanten Unterschied an). Als Lösungsmittelkontrolle diente Mineralöl (MO). d Balzverhalten eines intakten D. melanogaster-Männchens gegenüber einem enthaupteten Männchen. Entweder die unversehrten, die enthaupteten oder beide Männchen wurden vor dem Balztest Ozon ausgesetzt. Balzprozentsatz (siehe oben), exakter Fisher-Test mit Holm-Bonferroni-Korrektur für Mehrfachvergleich; Balzindex (Zeitdauer, die das intakte Männchen während des Experiments umwarb), Tukey-Test für mehrere Vergleiche. e Die Vorliebe einer männlichen Fliege für ein enthauptetes Männchen oder Weibchen. Entweder das enthauptete Männchen, das Weibchen oder beide enthaupteten Fliegen wurden vor dem Balztest Ozon ausgesetzt. Erste Wahl wird in Kreisdiagrammen dargestellt (exakter Test nach Fisher); Präferenzindex (Zeit für die Werbung bei einer Frau – Zeit bei der Werbung für einen Mann) / Gesamtzeit für die Werbung, ungepaarter T-Test für die Präferenz für die Werbung. Alle Tests sind zweiseitig. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wie bereits erwähnt, wirken männerspezifische Pheromone häufig nicht nur als Aphrodisiaka für Frauen, sondern helfen Männern auch bei der Geschlechtsunterscheidung6,7. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die Ozonexposition männlicher Fliegen mit der anschließenden Reduzierung ihrer männlich-spezifischen Pheromone die Diskriminierung aufgrund des Geschlechts behindern würde. Als wir Gruppen von Männern 100 ppb Ozon aussetzten, übertrafen die Ergebnisse jedoch unsere Erwartungen. Nach einer kurzen Zeitspanne (17,72 ± 1,83 Minuten, N = 10) der Exposition begannen die Männchen, einander intensiv zu umwerben und ein Verkettungsverhalten an den Tag zu legen (siehe Film S1 und S2), d. h. sie bildeten eine lange Kette umwerbender Männchen, die an erster Stelle stand beschrieben für Männchen, die eine fruchtlose Mutation tragen, d. h. eine Mutation im fruchtlosen Gen, die die Paarungspräferenzen der Männchen verändert21. Bei der Quantifizierung dieses Männchen-Männchen-Balzverhaltens von Paaren ozonexponierter Männchen (d. h. 30 Minuten bei 100 ppb) in einem No-Choice-Assay (Abb. 2b) fanden wir tatsächlich eine höhere Anzahl von Versuchen, die zu Männchen-Balzverhalten führten im Vergleich zu luftexponierten Kontrollmännchen. Auch hier könnte die Wirkung von Ozon entweder durch eine Verlängerung der Expositionszeit oder durch eine Erhöhung des Ozonspiegels verstärkt werden (Abb. S6). Da beide Männchen in diesen Experimenten Ozon ausgesetzt waren, fragten wir uns, ob die beobachtete verstärkte Balz zwischen Männchen nur auf die abgebauten Männchen-spezifischen Pheromone zurückzuführen war oder zusätzlich durch eine mögliche Fehlfunktion sensorischer Neuronen beeinflusst wurde, die für deren Erkennung verantwortlich sind , aufgrund von oxidativem Stress. Einzelne Sensillum-Aufzeichnungen (SSR) der Antennen-Trichoid-Sensille at1, von der bekannt ist, dass sie ein olfaktorisches sensorisches Neuron beherbergt, das cVA7 erkennt, zeigten ähnliche Dosis-Wirkungs-Kurven bei Ozon-exponierten Fliegen wie bei Kontrollfliegen (Abb. 2c). Darüber hinaus konfrontierten wir einen intakten Mann mit einem enthaupteten Mann und setzten jeden von ihnen vor der Begegnung entweder Ozon oder Umgebungsluft aus. Wir fanden heraus, dass die Frage, ob das intakte Männchen Balzverhalten zeigen würde oder nicht, nicht durch seine eigene Ozonexposition beeinflusst wurde, sondern nur durch die Exposition des enthaupteten Männchens (Abb. 2d). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ozonbelastung nicht die Funktion pheromonempfindlicher Neuronen oder anderer Ebenen der Signalverarbeitung beeinträchtigt, sondern durch den Abbau von Pheromonen die Paarung von Männchen induziert. Als nächstes fragten wir, ob die Ozonexposition die Diskriminierung aufgrund des Geschlechts vollständig behindert, und analysierten in einem Auswahltest die Werbepräferenz nicht ozonexponierter Männer gegenüber einem enthaupteten Mann und einer enthaupteten Frau. Vor dem Test wurden die enthaupteten Fliegen entweder Ozon oder Kontrollluft ausgesetzt. Während die Männchen im Kontrollexperiment bevorzugt die Weibchen umwarben, führte die Ozonexposition der enthaupteten Fliegen dazu, dass weibliche und männliche Fliegen gleichermaßen umworben wurden (Abb. 2e). Interessanterweise wurde, als nur der enthauptete Mann vor dem Experiment Ozon ausgesetzt wurde, die enthauptete Frau im Auswahltest immer noch bevorzugt umworben (Abb. 2e), was darauf hindeutet, dass frauenspezifische Chemikalien zur Geschlechtsdiskriminierung ausreichen. Da die Ozonexposition beider Geschlechter die Geschlechtsdiskriminierung erschwerte, scheinen auch die weiblichen Reizstoffe empfindlich auf den Abbau durch Ozon zu reagieren. Tatsächlich fanden wir bei der Analyse ozonexponierter Frauen (d. h. 2 Stunden bei 100 ppb) verringerte Mengen der beschriebenen frauenspezifischen Verbindungen 7,11-Heptacosadien (7,11-HD) und 7,11-Nonacosadien (7, 11-ND)22,23 (Abb. S7).

Nachdem wir gezeigt haben, dass die Ozonexposition nicht nur die Attraktivität eines D. melanogaster (CS)-Männchens gegenüber Weibchen verringert, sondern auch die Diskriminierung aufgrund des Geschlechts stark beeinträchtigt, fragten wir, ob dieser Effekt spezifisch für D. melanogaster (CS) ist oder bei anderen Arten auftritt Also. Basierend auf unserer vorherigen Studie zu männlich-spezifischen Verbindungen in 99 Drosophila-Arten11 haben wir 8 weitere Drosophila-Arten ausgewählt, von denen bekannt ist, dass sie männlich-spezifische Verbindungen tragen. Wir setzten ihre Männchen zwei Stunden lang 100 ppb Ozon aus und verglichen ihre chemischen Profile und Verhaltensleistungen mit denen der Kontrollmännchen. Sieben dieser Arten, mit Ausnahme von D. buskii, wiesen nach Ozonexposition verringerte Mengen männlicher spezifischer Verbindungen auf (Abb. 3). Gleichzeitig zeigten alle einen verminderten Paarungserfolg und/oder Veränderungen in der Männchen-Männchen-Interaktion (Abb. 3). Die von D. busckii beschriebenen männlich-spezifischen Verbindungen enthalten keine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen und sind daher weniger empfindlich gegenüber einem Abbau durch Ozon (Abb. 3). Obwohl auch eine abbauende Wirkung von Ozon auf kutikuläre Kohlenwasserstoffe von Fliegen ohne Kohlenstoffdoppelbindungen gezeigt wurde, wurden diese Experimente mit Ozonkonzentrationen durchgeführt, die mit 45.000 ppm etwa 106 höher waren als die in unseren Experimenten verwendeten24. Die Tatsache, dass D. buskii-Männchen beim Balzverhalten um Weibchen immer noch weniger erfolgreich waren, könnte auf zusätzliche, nicht identifizierte, aber ozonempfindliche Verbindungen zurückzuführen sein, die das Balzverhalten dieser Art steuern. Interessanterweise zeigten beide getesteten D. mojavensis-Unterarten im Gegensatz zu den anderen Arten nach der Ozonexposition eine verminderte Männchen-Männchen-Balz. Auch hier könnten zusätzliche Verbindungen zu den für diese Unterarten10,11 beschriebenen Verbindungen diese Ergebnisse erklären. Schließlich haben wir D. suzukii getestet, eine Art, die keine geschlechtsspezifischen Verbindungen aufweist und deren Verhalten eher visuell bestimmt sein soll11,25. Wie erwartet wurden weder der Paarungserfolg noch die Männchen-Balz durch die Ozonbehandlung beeinträchtigt (Abb. 3).

a Die Daten zeigen normalisierte Peakflächen von Pheromonen bei Ozon-exponierten Fliegen und Kontrollfliegen (Zweischwänziger ungepaarter t-Test; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001). b, c Auswirkung auf den Paarungserfolg (d. h. Prozentsatz der Experimente, die zur Paarung führten) und Auswirkung auf das Balzverhalten zwischen Männchen und Männchen (d. h. Prozentsatz der Experimente, die zur Paarung zwischen Männchen führten). Exakter zweiseitiger Fisher-Test, *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Es hat sich gezeigt, dass Schadstoffe wie Ozon und Stickoxide flüchtige Blütenbestandteile abbauen und somit die chemische Kommunikation zwischen Pflanzen und ihren bestäubenden Insekten beeinträchtigen26,27,28,29,30,31,32. Hier zeigen wir, dass Ozon Insekten auch in einem anderen Zusammenhang schädigen kann. Die Exposition von Fliegen gegenüber eher milden Ozonwerten, die bereits für verschmutzte Gebiete gemeldet wurden, baut ihre ungesättigten Pheromone ab und beeinträchtigt dadurch die sexuelle Kommunikation bei 9 von 10 getesteten Drosophila-Arten. Kohlenstoffdoppelbindungen sind jedoch nicht spezifisch für Drosophila-Pheromone, sondern ein Hauptmerkmal der meisten identifizierten Insektenpheromone33. Da beispielsweise viele weibliche Schmetterlinge Pheromone verwenden, um Männchen über große Entfernungen anzulocken, haben die oxidierenden Schadstoffe ausreichend Zeit, das Signal möglicherweise zu schwächen, bevor es den Empfänger erreicht. Während heutzutage die schädliche Wirkung von Pestiziden auf Insektenpopulationen weltweit gut belegt ist34,35, stehen Insekten offensichtlich vor einem zweiten Problem: der Verschlechterung ihrer chemischen Informationskanäle durch erhöhte Konzentrationen oxidierender Schadstoffe.

In dieser Studie verwendete Wildtypfliegen wurden vom Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; https://bdsc.indiana.edu/index.html) und dem National Drosophila Species Stock Center (NDSSC; http://blogs.cornell) bezogen. edu/drosophila/) und Kyoto Stock Center (Kyoto DGGR; https://kyotofly.kit.jp/cgi-bin/stocks/index.cgi). Die Bestandsnummern lauten wie folgt: D. putrida (15081–1401.00 / 15100–1711.01), D. repletoides (E-17001), D. funebris (15120–1911.05), D. pallidipennis (15210–2331.02), D. saltans (14028–0571.00 / 15250–2451.01), D. moj. wrigleyi (15081–1352.22), D. moj. mojavensis (15081–1352.47), D. busckii (1300–0081.00), D. suzukii (14029–0011.01 / 14011–0131.04). Für Experimente mit D. melanogaster verwendeten wir den Wildtyp-Stamm Canton-S (CS). Alle Fliegen wurden bei 25 °C, 12 Stunden Licht, 12 Stunden Dunkelheit und 70 % relativer Luftfeuchtigkeit aufgezogen. Mit Ausnahme von D. melanogaster (CS) wurden alle anderen Fliegenarten mit Standardfutter gemischt mit Bananen gezüchtet. Die Jungfrauen wurden unter CO2-Anästhesie gesammelt. 10 Tage alte Jungfliegen wurden in der Balzarena getestet. Die Pflege und Behandlung aller Fliegen entsprach allen relevanten ethischen Vorschriften.

Wir haben Fliegenverbindungen synthetisiert, darunter (Z)−10-Heptadecen-2-on (Z10-17:2Kt), (Z)−11-Hexadecen-1-ylacetat (Z11-16:Ac) und rac−2-Tridecylacetat (13:2Ac), rac-2-Pentadecylacetat (15:2Ac), (Z)-11-Eicosen-1-ylacetat (Z11-20:Ac), (Z)-10-Heptadecen-2-ylacetat (Z10-17:2Ac) wie beschrieben11. Andere Chemikalien, einschließlich cis-Vanccenylacetat (cVA), (Z)−7-Tricosen (7-T), (Z)−9-Tricosen (9-T), (Z)−7-Pentacosen (7-P) und (Z)−9-Pentacosen (9-P) wurde in hoher Reinheit von Sigma-Aldrich und Cayman Chemical bezogen.

(Z)−11-Pentacosen (11-P) wurde über eine Wittig-Reaktion aus Bromtetradecan (Sigma-Adrich, Deutschland) und Undecanal (Sigma-Aldrich, Deutschland) synthetisiert. Bromtetradecan (1 g, 3,6 mmol) und Triphenylphosphin (946 mg, 3,6 mmol) wurden in 20 ml Toluol gelöst und 20 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Toluolphase vorsichtig mit einer Pipette entfernt. Der Rückstand wurde 5 min mit frischem Toluol (je 10 ml) gerührt, bevor das Toluol wieder abpipettiert wurde. Dieser Vorgang wurde dreimal mit Toluol und einmal mit Diethylether (10 ml) wiederholt. Der hochviskose Rückstand wurde über Nacht im Hochvakuum getrocknet, um das Wittig-Salz als amorphen, cremefarbenen Feststoff zu erhalten.

Unter Argon wurde das Wittig-Salz (600 mg, 1,11 mmol) in wasserfreiem THF (20 ml) gelöst/suspendiert und auf –30 °C abgekühlt. Eine Lösung von Natriumbis(trimethylsilyl)amid (1,2 ml, 1 M in THF) wurde tropfenweise zugegeben und die Mischung auf –10 °C erwärmen gelassen. Nach 30-minütigem Rühren wurde die nun tieforangefarbene Suspension erneut auf –30 °C abgekühlt, bevor Undecanal (0,23 ml, 1,11 mmol) über eine Spritze zugegeben wurde. Die Mischung wurde über Nacht bei 20 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit n-Hexan (20 ml) verdünnt, bevor Wasser (40 ml) zugegeben wurde. Die organische Phase wurde entfernt und die wässrige Phase mit n-Hexan (2 × 40 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser und Kochsalzlösung (jeweils 40 ml) gewaschen und über Mg2SO4 getrocknet. Nach der Filtration wurde das Lösungsmittel per Rotationsverdampfer entfernt, der Rückstand an Kieselgel adsorbiert und mit n-Hexan/EtOAc (50:1) als Elutionsmittel chromatographiert, um (Z)−11-Pentacosen (130 mg, 34 % Ausbeute basierend auf Undecanal) zu erhalten. als farbloses Öl.

Ozon-Expositionssystem siehe Abb. S1. Komprimierte Umgebungsluft (mit 4,5 ± 0,5 ppb Ozon) wurde verwendet, um Kontrollluft (d. h. auf 70 % relative Luftfeuchtigkeit befeuchtete Umgebungsluft) und saubere Luft (d. h. Luft, die über einen Palladium-Ozonwäscher von sämtlichem natürlich vorkommenden Ozon gereinigt wurde) zu erzeugen. und mit Ozon angereicherte Luft (d. h. Umgebungsluft, die durch einen Ozongenerator (Aqua Medic, Deutschland) geleitet wurde, der bis zu 100 mg Ozon/h erzeugen konnte). Durch die Befeuchtung und Mischung sauberer mit Ozon angereicherter Luft in der Mischbox konnten unterschiedliche Grade ozonisierter Versuchsluft erzeugt werden. Die Ozonkonzentration konnte erhöht (verringert) werden, indem die Durchflussrate durch den Massendurchflussregler vor dem Ozonwäscher verringert (erhöht) wurde (z. B. 5 l/min), während die Durchflussrate durch den Ozongenerator konstant bei 0,7 l/min gehalten wurde . Da sich die Ozonkonzentrationen ändern, wenn die Luft befeuchtet wird, wurde ozonisierte Versuchsluft dynamisch in einer Mischbox (einem 100-l-Plexiglasbehälter) gespeichert, aus der die Luft kontinuierlich für den Ozonmonitor (BMT 932, BMT Messtechnik GmbH, Deutschland) untersucht wurde Gleichzeitig wurden jeweils 0,2 l/min in die vier 70-ml-Kunststofffläschchen mit den Fliegen geleitet und überschüssige Luft über einen zusätzlichen Palladium-Ozonwäscher von Ozon gereinigt, bevor sie an die Kammerluft abgegeben wurde. Ein zweiter Satz von vier 70-ml-Fläschchen wurde an den Luftstrom der Umgebungsluft angeschlossen, um „Kontrollfliegen“ für das Experiment zu produzieren. Das gesamte System wurde zweimal gebaut, wobei ein Ventil die mit Ozon angereicherte Luft zwischen den beiden Aufbauten umschaltete, sodass parallel ein weiterer Satz Versuchs- und Kontrollfliegen vorbereitet werden konnte. Indem das Ventil beispielsweise 5 s nach links und 10 s nach rechts geöffnet wird, können Experimente mit unterschiedlichen Ozonkonzentrationen parallel durchgeführt werden.

Um die chemischen Profile von Fliegen in den TDU-GC-MS-Experimenten zu analysieren, wurden 10 Tage alte Fliegen zunächst für eine bestimmte Zeit Ozon oder Kontrollluft ausgesetzt und anschließend sofort 30 Minuten lang bei –20 °C eingefroren. Um die Wiederherstellung der chemischen Profile nach der Ozonexposition zu untersuchen, wurden die Männchen 2 Stunden lang 100 ppb Ozon ausgesetzt und dann für 1 oder 5 Tage in Röhrchen mit Standardfutter verbracht. Anschließend wurden sie wie bereits erwähnt eingefroren. Für TDU-GC-MS-Messungen wurden einzelne Fliegen in Mikrofläschchen von Thermodesorptionsröhrchen (GERSTEL, Deutschland) gegeben und 0,5 µl C10-Br oder C16-Br (10−3 Verdünnung in Hexan) als interner Standard zu den Mikrofläschchen gegeben.

Desorptionsröhrchen wurden mit einem GERSTEL MPS 2 XL-Mehrzweckprobenehmer in eine GERSTEL-Thermodesorptionseinheit (GERSTEL, Deutschland) überführt. Die Proben wurden 8 Minuten lang bei 250 °C desorbiert und dann bei –50 °C in der Auskleidung eines GERSTEL CIS 4 Cooled Injection System eingeschlossen, wobei flüssiger Stickstoff zur Kühlung verwendet wurde. Die Komponenten wurden auf die GC-Säule übertragen, indem der Verdampferinjektor mit programmierbarer Temperatur mit 12 °C/s auf 270 °C erhitzt und die Temperatur dann 5 Minuten lang gehalten wurde. Das GC-MS (Agilent GC 7890A, ausgestattet mit einer MS 5975 C inert XL MSD-Einheit; Agilent Technologies, USA) war mit einer HP5-Säule (Agilent Technologies, USA) ausgestattet. Die Temperatur des Gaschromatographenofens wurde 3 Minuten lang bei 50 °C gehalten und dann um 15 °C/Minute auf 230 °C und dann um 20 °C/Minute auf 280 °C erhöht und 20 Minuten lang gehalten. Massenspektren wurden im EI-Modus (bei 70 eV) im Bereich von 33 m/z bis 500 m/z aufgenommen.

Von allen getesteten Drosophiliden wurden jungfräuliche Männchen und Weibchen nach der Eklosion gesammelt und einzeln bzw. in Gruppen (20 Individuen/Fläschchen) aufgezogen. Für Tests zur Balz zwischen Männchen und Weibchen wurden 15 Männchen in einem Fläschchen Ozon oder Umgebungsluft ausgesetzt. Ein mit Ozon behandeltes einzelnes Männchen wurde dann mit einem unbehandelten Weibchen in eine Balzkammer gebracht und ihr Verhalten wurde eine Stunde lang beobachtet und quantifiziert. Jede Balzarena enthielt 4 Kammern (1 cm Durchmesser × 0,5 cm Tiefe), die mit einer Plastikrutsche abgedeckt waren. Vier Kammern wurden gleichzeitig aufgenommen. Jeder Arena wurde von unten ein Luftstrom von 0,2 ml/min zugeführt. Zur Aufzeichnung des Balzverhaltens wurde eine GoPro-Kamera 4 oder eine Logitech C615 verwendet. Jedes Video wurde manuell auf die Balzlatenz (d. h. die Zeit, bis das Männchen mit dem Balzverhalten begann), den Balzprozentsatz (d. h. den Prozentsatz der Männchen, die Balzverhalten zeigten) und den Balzindex (d. h. die Zeit, die jedes Männchen während des Balzverhaltens ausführte) analysiert 10 Minuten Versuchszeit), Paarungslatenz (d. h. die Zeit bis zum Beginn einer erfolgreichen Paarung) und Paarungserfolg (d. h. der Prozentsatz der Männchen, die kopulierten). Alle Verhaltensexperimente wurden bei 25 °C und 70 % Luftfeuchtigkeit durchgeführt.

Für Männchen-Männchen-Balztests wurden 25 Männchen in einem Fliegenrohr Ozon oder Umgebungsluft ausgesetzt. Anschließend wurden zwei Männchen in eine Kammer gebracht und ihr Verhalten 30 Minuten lang beobachtet und quantifiziert. Für D. melanogaster (CS) wurden mehrere Ozon-Expositionskombinationen (dh 15 Minuten, 30 Minuten und 2 Stunden mit 50, 100, 150 bzw. 200 ppb) getestet. Männchen anderer Drosophiliden wurden 2 Stunden lang 100 ppb ausgesetzt. Bei No-Choice-Tests mit enthaupteten Männchen wurden die Männchen Ozon ausgesetzt und dann enthauptet. Ein intaktes Männchen und ein enthauptetes Männchen wurden in eine Kammer gebracht und das Balzverhalten des intakten Männchens 30 Minuten lang beobachtet und quantifiziert. Bei den Two-Choice-Tests mit enthaupteten Fliegen wurden Männchen und/oder Weibchen Ozon ausgesetzt und anschließend enthauptet. Ein intakter Mann und ein enthaupteter Mann und eine enthauptete Frau wurden in eine Kammer gebracht. Der Präferenzindex des umwerbenden intakten Mannes wurde berechnet als (Zeit, die ein intakter Mann braucht, um eine enthauptete Frau zu umwerben – die Zeit, die ein intakter Mann braucht, um um einen enthaupteten Mann zu werben)/30 Minuten.

Männliche D. melanogaster (CS)-Fliegen wurden entweder Ozon oder Umgebungsluft ausgesetzt und dann in einer Pipettenspitze immobilisiert. Eine Referenzelektrode wurde in das Auge eingeführt; Eine weitere Wolframelektrode wurde in das Zielsensillum eingeführt. Die at1 wurden anhand ihres Standorts und ihrer spontanen Aktivitäten identifiziert. Die Signale wurden mit der Syntech Universal AC/DC Probe (Syntech, Deutschland) verstärkt, abgetastet (96.000,0 Samples/s) und über eine USB-IDAC-Verbindung (Syntech, Deutschland) gefiltert (500–5000 Hz mit 50/60 Hz-Unterdrückung). ein Computer. Aktionspotentiale wurden mit der AutoSpike-Software (Syntech, Deutschland) extrahiert. Synthetische Verbindungen wurden in Mineralöl (MO) verdünnt (Sigma-Aldrich, Deutschland). Vor dem Test wurden 10 μl des verdünnten Duftstoffs frisch auf ein kleines Stück Filterpapier (1 cm2) geladen und in eine Pasteurpipette aus Glas gegeben. Die getesteten Geruchsdosierungen lagen im Bereich von 10−5−10−1 Verdünnung (v/v). Der Duftstoff wurde abgegeben, indem die Pipettenspitze in einen konstanten, befeuchteten Luftstrom eingeführt wurde, der mit 600 ml/min durch ein Edelstahlrohr (Durchmesser 8 mm) strömte, das in einem Abstand von 1 cm von der Antenne endete. Die neuronale Aktivität wurde 10 s lang aufgezeichnet, beginnend 3 s vor der Stimulationsperiode von 0,5 s. Die Reaktionen einzelner Neuronen wurden als Anstieg (oder Abfall) der Aktionspotentialfrequenz (Spitzen/s) im Verhältnis zur Frequenz vor dem Reiz berechnet. Die Spuren wurden durch Sortieren der Spitzenamplituden in AutoSpike, Analyse in Excel und Illustration in Adobe Illustrator CS (Adobe Systems, USA) verarbeitet.

Statistische Analysen (siehe die entsprechenden Legenden zu jeder Abbildung) und vorläufige Zahlen wurden mit GraphPad Prism v. 8 (GraphPad Software, USA) durchgeführt. Die Abbildungen wurden anschließend mit Adobe Illustrator CS5 bearbeitet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle in dieser Studie generierten Daten werden in der Quelldatendatei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken I. Alali und S. Trautheim für ihre Hilfe bei der Fliegenzucht. Diese Forschung wurde durch Mittel der Max-Planck-Gesellschaft und insbesondere durch Mittel des Max-Planck-Zentrums „Next Generation Insect Chemical Ecology“ unterstützt.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Bill S. Hansson, Markus Knaden.

Abteilung für Evolutionäre Neuroethologie, Max-Planck-Institut für chemische Ökologie, Hans-Knöll-Straße 8, D-07745, Jena, Deutschland

Nan-Ji Jiang, Hetan Chang, Kerstin Weniger, Bill S. Hansson und Markus Knaden

Next Generation Insect Chemical Ecology, Max-Planck-Zentrum, Max-Planck-Institut für chemische Ökologie, Hans-Knöll-Straße 8, D-07745, Jena, Deutschland

Nan-Ji Jiang, Bill S. Hansson und Markus Knaden

Forschungsgruppe Massenspektrometrie/Proteomik, Max-Planck-Institut für chemische Ökologie, Hans-Knöll-Straße 8, D-07745, Jena, Deutschland

Jerrit Weißflog

Max-Planck-Institut für chemische Ökologie, Hans-Knöll Straße 8, D-07745, Jena, Deutschland

Franziska Eberl & Daniel Veit

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NJ.J., BSH und MK entwarfen den Forschungsplan und NJ.J. führte die meisten Experimente durch. HC führte SSR-Experimente durch. FE und DV konstruierten das Ozon-Expositionsgerät. NJ.J und KW analysierten und quantifizierten Pheromonverbindungen. JW synthetisierte synthetische Verbindungen. NJ.J. analysierte experimentelle Daten. NJ.J., BSH und MK haben den Artikel geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript bearbeitet.

Korrespondenz mit Markus Knaden.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Sylvia Anton und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Jiang, NJ., Chang, H., Weißflog, J. et al. Ozonbelastung stört die sexuelle Kommunikation von Insekten. Nat Commun 14, 1186 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36534-9

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Eingegangen: 28. Oktober 2022

Angenommen: 06. Februar 2023

Veröffentlicht: 14. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36534-9

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