Integrierte Metabolomics-Studie der Milch der Hitze

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 24208 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Hitzestress (HS) schadet der weltweiten Milchindustrie, indem er Milchertrag und -qualität verringert, die Gesundheit schädigt und die Fortpflanzung von Milchkühen beeinträchtigt, was jedes Jahr zu enormen wirtschaftlichen Verlusten führt. Ein Verständnis des physiologischen Mechanismus HS-milchgebender Milchkühe bleibt jedoch unklar. Hier wurde eine Metabolomics-Studie mittels LC-MS und 1H-NMR-Spektroskopie durchgeführt, um die metabolomischen Unterschiede in der Milch zwischen HS-freien und HS-Milchkühen zu analysieren und diagnostische Biomarker und Veränderungen im Stoffwechselweg zu entdecken. Insgesamt 53 diskriminierende Metaboliten wurden in der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe signifikant hoch- oder runterreguliert (P < 0,05). Diese Biomarker waren an Stoffwechselwegen des Kohlenhydrat-, Aminosäure-, Lipid- und Darmmikrobiom-Stoffwechsels beteiligt. Beim Vergleich dieser potenziellen Biomarker mit zuvor identifizierten HS-Kandidaten-Biomarkern im Plasma ergaben sich signifikante Korrelationen zwischen den Spiegeln von Laktat, Pyruvat, Kreatin, Aceton, β-Hydroxybutyrat, Trimethylamin, Ölsäure, Linolsäure, Lysophosphatidylcholin 16:0 und Phosphatidylcholin 42:2 Milch und Plasma wurden gefunden, was darauf hindeutet, dass die Blut-Milch-Schranke undicht geworden ist und die Konzentrationen dieser 10 Biomarker in der Milch HS-induzierte metabolische Veränderungen im Blut widerspiegeln können. Diese neuen Erkenntnisse können eine tiefergehende Forschung zur Aufklärung der milchbasierten Veränderungen der Stoffwechselwege bei HS-laktierenden Milchkühen unterstützen.

Laktierende Milchkühe unter Hitzestress (HS) haben eine begrenzte Energieaufnahme, da sie den Bedarf ihres Körpers zur Milchproduktion und Erhaltung der Gesundheit nicht decken können, was zu einer verminderten Milchleistung und -qualität führt und die Milchkühe anfällig für Krankheiten macht1,2. Infolgedessen kommt es in der Milchindustrie in vielen Ländern zu großen wirtschaftlichen Verlusten, beispielsweise in China3,4, den USA5 und Deutschland6. HS-induzierte Stoffwechselstörungen sind direkt für diese Verluste verantwortlich1,7. Dies ist besonders wichtig angesichts der Tendenzen einer gesteigerten Milchproduktivität durch den Einsatz moderner molekulargenetischer Technologien, begleitet von einem Temperaturanstieg aufgrund des globalen Klimawandels8.

Eine genaue Bestimmung, wann Kühe mit HS in Berührung kommen, ist schwierig, da die Reaktionen auf HS nicht nur die Energiebilanz, sondern auch den Wasser-, Natrium-, Kalium- und Chlorstoffwechsel beeinflussen9. Obwohl der Temperatur- und Feuchtigkeitsindex (THI) nach wie vor der häufigste Indikator für HS ist, erlaubt die Verwendung eines THI-Werts von 72 als Schwelle für das Auftreten von HS10 nur Beurteilungen auf der Grundlage der Lufttemperatur und -feuchtigkeit und ist kein genaues Maß für den Stoffwechsel Veränderungen bei Milchkühen unter HS und berücksichtigen nicht kuhspezifische Effekte (Alter und Rasse) und andere Umweltfaktoren. Tatsächlich sind die HS-induzierten physiologischen Veränderungen bei Milchkühen multifaktoriell7. Robuste Metaboliten-Biomarker werden benötigt, um die Schwelle des HS-Ausbruchs zu diagnostizieren, sein Fortschreiten zu überwachen und Einblicke in seine physiologischen Mechanismen zu liefern, um so die Umsetzung rechtzeitiger Interventionen zum Schutz von Milchkühen vor Krankheiten wie Ketose zu ermöglichen.

Frühere Untersuchungen zur Leistung von Milchkühen konzentrierten sich auf die HS-induzierten Veränderungen ihrer Atemfrequenz, Herzfrequenz, Milchleistung, somatischen Zellzahl sowie Protein, Fett, Laktose, basale nicht veresterte Fettsäuren (FA), Insulin und Schilddrüse , Noradrenalin, Glukose und Plasma-Harnstoff-Stickstoffspiegel in der Milch7,11. Allerdings haben sich nur wenige Studien mit den globalen Veränderungen der Stoffwechselwege befasst, und die diesen Veränderungen zugrunde liegenden Mechanismen sind noch unbekannt.

Die Metabolomik stellt eine leistungsstarke Plattform zur Erfassung von Informationen aus Hunderttausenden niedermolekularen Metaboliten in Pflanzen, Tieren und Menschen dar und kann verwendet werden, um ein globales Verständnis der durch Umweltveränderungen hervorgerufenen pathophysiologischen Veränderungen zu ermöglichen12,13,14,15 . Bei Milchkühen lässt sich die Milch sehr einfach sammeln, gibt Aufschluss über die Veränderungen im Laktationsmechanismus von Milchkühen und kann direkt analysiert werden, um deren Ernährungsqualität zu bestimmen. Daher gilt Milch als ideale biologische Probe zur Überwachung physiologischer Veränderungen. Im Vergleich zur Blutentnahme ist die Milchentnahme nicht-invasiv und erfolgt täglich, sodass der Stoffwechselzustand der Milchkühe in Echtzeit beobachtet werden kann. Dadurch können Kühe überwacht und ihr HS-Zustand bestimmt werden, und es können umgehend Managementstrategien umgesetzt werden, um die Auswirkungen von HS zu reduzieren. Daher nutzte die vorliegende Studie LC-MS- und 1H-NMR-Spektroskopie, um Stoffwechselunterschiede in der Milch von Kühen in der mittleren Laktation mit und ohne HS zu identifizieren, um HS-Biomarker zu identifizieren und die Veränderungen in den Stoffwechselwegen laktierender Milchkühe in verschiedenen HS-Zuständen zu untersuchen. LC-MS im MRM-Modus (Multiple Reaction Monitoring) wurde auch verwendet, um die Zuverlässigkeit der unterscheidenden Metaboliten zu überprüfen. Partielle Pearson-Korrelationsanalysen der in Milch gefundenen Biomarkerkandidaten mit denen im Blut16 wurden durchgeführt, um die Ursachen der gestörten Metaboliten in der Milch zu ermitteln. Die Konzentrationen von Zytokinen, C-reaktivem Protein und Cytochrom C wurden mithilfe von ELISAs (Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) nachgewiesen, um Einblicke in HS-induzierte Entzündungen und Apoptose zu erhalten. Insgesamt verbessern die Ergebnisse dieser Studie unser Verständnis der Stoffwechselveränderungen bei HS-exponierten Milchkühen. Eine Übersicht über das Studiendesign ist in Abb. 1 dargestellt.

HS, Hitzestress; MTBE, Methyl-tert-butylether; NMR, Kernspinresonanz; MVDA, multivariate statistische Datenanalyse; PCA, Hauptkomponentenanalyse; PLS-DA, partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate; OPLS-DA, orthogonale partielle Kleinste-Quadrate-Diskriminierungsanalyse.

Die Darstellungen der orthogonalen partiellen Kleinste-Quadrate-Diskriminierungsanalyse (OPLS-DA) der metabolomischen Daten zeigten eine klare Trennung zwischen der HS-freien und der HS-Gruppe ohne Überlappung (Abb. 2A, B), was darauf hindeutet, dass das Stoffwechselprofil signifikant verändert war die HS-Milchproben. Die 1H-NMR-Daten des Milchserums und -fetts (Abb. 2A) und LC-MS-Daten des Milchmetaboloms (Abb. 2B) für die HS-freien und HS-Gruppen identifizierten eine Vorhersagekomponente und zwei orthogonale Komponenten mit zufriedenstellender Modellierung und Vorhersage Fähigkeiten von 81,36 % < R2 (Y) <88,2 % und 63,9 % < Q2 (kumuliert) <86,1 %. Um eine Überanpassung des Modells zu vermeiden, wurde eine Kreuzvalidierung über drei Komponenten mit 999 zufälligen Permutationstests durchgeführt und ergab für alle Daten Schnittpunkte von 0,015 < R2 < 0,239 und −0,275 < Q2 < −0,190 (Abb. 2C, D), was darauf hinweist Das Modell war gültig16,17,18.

(A) OPLS-DA-Diagramme der 1H-NMR-Daten von Milchserum und Fett. (B) OPLS-DA-Diagramme der LC-MS-Daten für das Milchmetabolom. (C,D) Validierungsdiagramme der Modelle der partiellen Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (PLS-DA), die durch 999 Permutationstests für die 1H-NMR-Daten von Milchserum und -fett bzw. die LC-MS-Daten des Milchmetaboloms erfasst wurden.

Durch die Analyse der 1H-NMR-Daten identifizierten wir insgesamt 25 Stoffwechselkandidaten, die in Tabelle 1 aufgeführt sind. Bei diesen Metaboliten handelte es sich um Kohlenhydrate, Aminosäuren, Lipide und aus dem Darmmikrobiom stammende Metaboliten, was darauf hindeutet, dass diese Stoffwechselwege im HS verändert waren Gruppe. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel der 1H-NMR-Spektren der aus Milchfett identifizierten Metaboliten.

(A) FA, Fettsäuren. (B) TC, Gesamtcholesterin. (C) UFA, ungesättigte Fettsäuren; TAG, Triacylglyceride. (D) PUFA, mehrfach ungesättigte Fettsäuren.

Die Analyse der LC-MS-Daten ergab, dass sich 119 Metaboliten zwischen der HS-freien und der HS-Gruppe unterschieden, wobei 33 dieser Metaboliten nach der Eliminierung redundanter Variablen unter Verwendung einer Kombination aus extrahierten Ionenchromatogrammen und der R-Paket-Algorithmensammlung für Metabolitenprofile übrig blieben Anmerkung (KAMERA)16,19. Um diese 33 Metaboliten zu verifizieren, wurde ein bestätigender Nachweis mittels LC-MS im MRM-Modus durchgeführt. Letztendlich wurden 28 Kandidaten überprüft und identifiziert (Tabelle 2). Mit Ausnahme von Harnstoff waren die anderen 27 Verbindungen Lipidmetaboliten, was darauf hindeutet, dass der Lipidstoffwechsel in der HS-Gruppe gestört war.

Die 1H-NMR-identifizierten Metaboliten, die sich zwischen der HS- und der HS-freien Gruppe unterschieden, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Basierend auf den Veränderungen dieser potenziellen Kandidaten wurde eine Heatmap erstellt (Abb. 4A). HS-induzierte Veränderungen in kohlenhydratbezogenen Metaboliten wurden für Laktat, Pyruvat, Galactose-1-phosphat und Citrat beobachtet, deren Konzentrationen in der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe um das 1,27- bis 1,79-fache erhöht waren ( P < 0,002), mit Ausnahme von Fumarat, verringerte sich in der HS im Vergleich zur HS-freien Gruppe um das 0,78-fache (P < 0,001). Die Konzentrationen von Isoleucin, Prolin, Orotat, Glycin und Phosphokreatin, bei denen es sich um mit Proteinen oder Aminosäuren verwandte Metaboliten handelt, waren in der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe um das 0,69- bis 0,88-fache verändert (P < 0,001). Kreatin war in der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe um das 1,59-fache erhöht (P < 0,001). Die Konzentrationen von Butyrat, Aceton, β-Hydroxybutyrat (BHBA), FA, PUFA und UFA, lipidbezogenen Metaboliten, waren in der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe um das 1,08- bis 1,38-fache erhöht (P < 0,02). ). Die Konzentrationen von N-Acetylzucker A, N-Acetylzucker B, N-Acetylzucker C, N-Acetylzucker D und TC waren in der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe um das 0,68- bis 0,91-fache verändert (P < 0,01). ). HS-induzierte Störungen des vom Darmmikrobiom abgeleiteten Stoffwechsels wurden ebenfalls identifiziert, wobei sich die Konzentrationen von Trimethylamin (TMA) in der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe um das 0,52-fache veränderten (P < 0,001).

Heatmap-Darstellung der unbeaufsichtigten hierarchischen Clusterbildung der (A) 1H-NMR-Daten und (B) LC-MS-Daten der HS- und HS-freien Proben. Die Rot- und Grüntöne stellen Erhöhungen bzw. Verringerungen der Metabolitenkonzentration im Verhältnis zu ihrem Niveau in der HS-freien Gruppe dar. Zeilen: Metaboliten; Spalten: Proben.

Die durch HS veränderten LC-MS-identifizierten Metaboliten sind in Tabelle 2 aufgeführt. Basierend auf den Veränderungen dieser potenziellen Kandidaten zwischen der HS-freien und der HS-Gruppe wurde eine Heatmap erstellt (Abb. 4B). Die meisten dieser Metaboliten sind Lipide, wobei die Konzentrationen von Ölsäure, Linolsäure und Lysophosphatidylcholin (LysoPC) 16:0 in der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe um das 1,28- bis 1,41-fache verändert waren (P < 0,005). und Phosphatidylcholin (PC), Sphingomyelin (SM), Monoacylglycerin (MG), Diacylglycerin (DG) und Triradylglycerin (TG) veränderten sich in der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe um das 0,48- bis 0,83-fache (P < 0,02). Die Konzentration von Harnstoff, der mit Aminosäuren zusammenhängt, war in der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe um das 1,32-fache erhöht (P < 0,01).

Tabelle 3 listet die Korrelationskoeffizienten der Kandidatenmetaboliten in Plasma und Milch mit Korrekturen für die Behandlungsgruppen (HS und HS-frei) auf. Es wurden signifikante Korrelationen zwischen den Laktat-, Pyruvat-, Kreatin-, Aceton-, BHBA- und TMA-Spiegeln im Plasma und in der Milch beobachtet (P < 0,001). Die Signifikanz der Korrelationen für Ölsäure, Linolsäure, LysoPC 16:0 und PC 42:2 betrug weniger als 0,01. Darüber hinaus wurden auch signifikante Korrelationen zwischen den Laktat- und Pyruvatwerten sowie den Aceton- und BHBA-Werten in Milch und Plasma festgestellt (P < 0,01).

In der Ergänzungstabelle S6 sind Änderungen der Konzentrationen von TNF-α, IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, c-reaktivem Protein, p53, Bax, Bcl-2, Cytochrom c, Caspase-3 und Caspase aufgeführt -8 und Caspase-9 in Plasma und Milch aus den HS- und HS-freien Gruppen. Die Konzentrationen aller dieser Proteine waren in der HS-Gruppe signifikant höher als in der HS-freien Gruppe (P < 0,05), mit Ausnahme von Bcl-2 und IL-12, die in der HS-Gruppe signifikant niedriger waren als in der HS-Gruppe. freie Gruppe (P < 0,05).

In den Ergänzungstabellen S7–S8 sind die Korrelationskoeffizienten zwischen der Rektaltemperatur und den Konzentrationen der Kandidatenmetaboliten im Plasma bzw. in der Milch aufgeführt. Es wurden signifikante Korrelationen zwischen den Laktat-, Pyruvat-, Kreatin-, Prolin-, Lysin-, Glycin-, Threonin-, Isoleucin-, Leucin-, Ornithin-, Citrullin- und Argininspiegeln im Plasma und der Rektaltemperatur (P < 0,01) sowie zwischen Laktat, Pyruvat-, Kreatin- und Citratspiegel in der Milch und die Rektaltemperatur (P < 0,01). Die Ergänzungstabelle S9 zeigt die Korrelationskoeffizienten für die Zytokin- und Kandidatenmetabolitenspiegel in Plasma und Milch. Signifikante Korrelationen wurden zwischen p53, Bax, Bcl-2 und Cytochrom c sowie Aceton und BHBA sowohl im Plasma als auch in der Milch festgestellt (P < 0,01). In der Ergänzungstabelle S10 sind die signifikanten Korrelationen zwischen den Cytochrom C- und C-reaktiven Proteinspiegeln in Plasma und Milch aufgeführt (P <0, 01).

In der vorliegenden Studie wurden 53 potenzielle Metaboliten-Biomarker identifiziert, die zur Diagnose der HS-Zustände laktierender Milchkühe verwendet werden könnten. Diese potenziellen Biomarker waren an Stoffwechselwegen für Kohlenhydrate, Aminosäuren, Lipide und im Darmmikrobiom beteiligt, was darauf hindeutet, dass diese Stoffwechselwege durch HS beeinflusst wurden.

HS regulierte in der vorliegenden Metabolomik-Studie die Pyruvat- und Laktatspiegel in der Milch von HS-Milchkühen hoch, wie in unserer vorherigen Metabolomik-Studie des Plasmas von HS-Milchkühen beobachtet16. Korrelationsanalysen (Tabelle 3) der Pyruvat- oder Laktatspiegel im Plasma und in der Milch von HS- und HS-freien Kühen ergaben, dass die Pyruvat- und Laktatkonzentrationen im Plasma signifikant mit ihren jeweiligen Konzentrationen in der Milch korrelierten, was darauf hindeutet, dass diese beiden Metaboliten direkt aus der Milch ausgeschieden werden das Blut gelangt über die Milchdrüse in die Milch20.

Die Milchcitratkonzentration war in der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe erhöht. Diese Art wurde als Biomarker für die Energiebilanz bei Milchkühen verwendet und korreliert mit dem Vorhandensein von Ketonkörpern in der Milch und der De-novo-FA-Synthese21. Da das Brustepithel für Citrat in beide Richtungen undurchlässig ist, spiegeln die Milchcitratspiegel eher eine HS-induzierte Störung der Brustfunktion als eine Störung des allgemeinen Stoffwechsels wider. Die in unserer vorherigen Studie16 festgestellten unbedeutenden Unterschiede in den Plasmacitratspiegeln zwischen der HS- und der HS-freien Gruppe bestätigen weiter die Hypothese, dass die Milchcitratspiegel eher eine HS-induzierte Störung der Brustfunktion als Veränderungen im Blutcitratstoffwechsel widerspiegeln. Die verringerte Fumaratkonzentration in den HS-Milchproben könnte auf einen gestörten Energiestoffwechsel und eine beeinträchtigte Funktion des Tricarbonsäurezyklus zurückzuführen sein22.

Laktose ist der vorherrschende Zucker in der Milch der meisten Arten. Die Rolle des Glukosestoffwechsels bei der Milchproduktion besteht darin, Glukose aus dem Blut zur Laktosesynthese in die Brustdrüse zu transportieren, und hat eine wichtige Funktion bei der Milchleistung im Zusammenhang mit der Osmoregulation der Milch23,24. Obwohl in der vorliegenden Studie keine signifikanten Unterschiede in den Milchlaktosekonzentrationen zwischen der HS- und der HS-freien Gruppe festgestellt wurden, waren die Milcherträge der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe (P <0, 01) stark verringert (Ergänzungstabelle S4). . Dadurch verringerte sich die Laktoseausbeute, was darauf hindeutet, dass den Brustdrüsen weniger Blutzucker zur Verfügung stand oder die Laktosesynthese gestört war.

Die erhöhte Galactose-1-phosphat-Konzentration in der Milch war wahrscheinlich auf das Austreten dieser Komponente aus den Brustepithelzellen in die Milch zurückzuführen, möglicherweise durch Zellapoptose, und scheint stark von den Energiebilanzzuständen abzuhängen25. Eine negative Energiebilanz (NEB) kann den apoptotischen Index in der Brustdrüse stark erhöhen25. HS-Milchkühe befinden sich in einem NEB-Zustand, was in der vorliegenden Studie möglicherweise zu den erhöhten Galactose-1-Phosphat-Werten in der Milch geführt hat. Die verringerten N-Acetylzucker-A-, N-Acetylzucker-B-, N-Acetylzucker-C- und N-Acetylzucker-D-Spiegel in der HS-Gruppe deuteten darauf hin, dass HS ihre Synthese veränderte, indem es die Spiegel ihrer Vorläufer reduzierte oder die zugehörigen Enzyme beeinflusste.

In den Milchproben der HS-Gruppe wurden im Vergleich zu denen der HS-freien Gruppe verringerte Konzentrationen von Isoleucin, Prolin, Orotat, Glycin und Phosphokreatin festgestellt. Allerdings waren die Konzentrationen dieser Metaboliten im Plasma der HS-Milchkühe in unserer vorherigen Metabolomics-Studie16 hochreguliert. Diese Aminosäuren können die Hauptvorläufer für die Glukoseproduktion durch Gluconeogenese oder die Energieproduktion durch Desaminierung und Oxidation sein26, wodurch möglicherweise ihre Verteilung in die Milch über die Milchdrüse verringert wird. Innerhalb der Zelle sind Aminosäuren an Stoffwechselreaktionen beteiligt, bei denen unter anderem CO2, Harnstoff, Polyamine und nichtessentielle Aminosäuren (NEAAs) entstehen. Die erhöhte Harnstoffkonzentration in den Plasmaproben von HS-Milchkühen weist darauf hin, dass in den Milchdrüsenzellen mehr Aminosäuren zu Harnstoff als zu Milchproteinen verstoffwechselt wurden. Die Rektaltemperatur korrelierte signifikant mit den Prolin-, Lysin-, Kreatinin-, Threonin-, Isoleucin-, Leucin-, Ornithin-, Citrullin-, Arginin- und Kreatinspiegeln im Plasma (Ergänzungstabelle S7), was darauf hindeutet, dass HS den Katabolismus des Skelettmuskelproteins in Amino erhöhte Säuren im Plasma27. Es wurden signifikante Korrelationen zwischen der Rektaltemperatur und den Laktat- und Pyruvatspiegeln sowohl im Plasma als auch in der Milch beobachtet (Ergänzungstabelle S8), was auf eine verstärkte anaerobe Glykolyse hinweist.

Bei laktierenden Kühen ist NEB mit der Mobilisierung der Energiereserven des Körpers verbunden, was zu einer verlängerten Lipolyse des Fettgewebes und der Verteilung von nicht veresterten FA in den Blutkreislauf führt25. Diese Aufteilung beeinflusst das FA-Profil im Milchserum, beispielsweise durch Erhöhung der Konzentrationen an ungesättigten FA (UFA), hauptsächlich C18:1 (Ölsäure) und C18:2 (Linolsäure). Der gleiche Trend war auch in unseren Ergebnissen für die Milchfettzusammensetzung zu beobachten, die eine höhere Konzentration an UFA und mehrfach ungesättigten FA (PUFA) in der Milch der Kühe der HS-Gruppe zeigten. Bei Kühen wurde das Vorhandensein von UFA mit entzündlichen Erkrankungen wie Mastitis und Metritis in Verbindung gebracht. Cholesterin wird über Lipoproteinpartikel durch den Körper transportiert. Eine frühere Studie am Plasma laktierender Milchkühe unter HS zeigte, dass HS die Konzentrationen von Lipoprotein hoher Dichte (HDL) und Lipoprotein sehr niedriger Dichte/Lipoprotein niedriger Dichte (VLDL/LDL) reduzierte und so deren Versorgung der Brustdrüse verringerte Zellen16. Die Cholesterinkonzentration im Milchfett war in der HS-Gruppe niedriger als in der HS-freien Gruppe, was darauf hindeutet, dass die Synthese und der Transport von Cholesterin in die Milch unter HS begrenzt sind.

Die BHBA- und Acetonkonzentrationen waren in der HS-Gruppe im Vergleich zur HS-freien Gruppe signifikant erhöht. Diese Änderungen stimmten mit unserer vorherigen Plasma-Metabolomik-Studie an HS-Milchkühen überein16. Die partielle Korrelationsanalyse ergab, dass die BHBA- und Acetonkonzentrationen in der Milch laktierender Milchkühe im HS- und HS-freien Zustand signifikant mit ihren in einer früheren Studie berichteten Plasmakonzentrationen korrelierten (P < 0,01)16, was darauf hinweist, dass die BHBA- und Aceton im Blut gelangte unverändert über die Milchzellen in die Milch. Daher können erhöhte Konzentrationen von BHBA und Aceton in der Milch auf erhöhte BHBA- und Acetonspiegel im Blut hinweisen, die bekannte Marker für den Energiestatus bei Milchkühen sind und eine übermäßige Proteinmobilisierung und eine unzureichende Glukoseversorgung widerspiegeln21.

Erhöhtes P53-Protein, Bax, Cytochrom C, Caspase-3, Caspase-8, Caspase-9 und verringertes Bcl-2, allesamt Apoptose-verwandte Moleküle28, wurden sowohl im Plasma als auch in der Milch der HS-Gruppe nachgewiesen. Erhöhtes P53-Protein kann die Biosynthese von Routing-Proteinen für die Apoptose erleichtern. Das Gleichgewicht des Bcl-2- und Bax-Verhältnisses fungiert als wichtiger Regulator der mitochondrialen Reaktion auf apoptotische Signale, und sein Ungleichgewicht kann zur Freisetzung von Cytochrom C führen und so die Zellapoptose vorhersagen. Die Scheraktivierung von Caspase-8 kann eine Caspase-Kaskadenreaktion auslösen. Caspase-3 und Caspase-9 gelten als Apoptose-Henker bzw. -Initiator. Die BHBA- und Acetonkonzentrationen korrelierten signifikant mit P53-Protein, Bax, Bcl-2 und Cytochrom c sowohl im Plasma als auch in der Milch (Ergänzungstabelle S9), was darauf hindeutet, dass NEB die Apoptose erhöhte29.

Die Konzentrationen von PC, einschließlich PC 40:1, PC 40:0, PC 42:2, PC 44:3 und PC 44:1, waren in der HS-Gruppe niedriger als in der HS-freien Gruppe, wohingegen die Konzentrationen von lysoPC 16:0 war in der HS-Gruppe höher als in der HS-freien Gruppe. LysoPCs sind Metaboliten des PC-Katabolismus, der durch die Phospholipasen A1, A2 und D30,31 reguliert wird. Die beobachteten Veränderungen der PC- und LysoPC-Konzentrationen stimmten mit unserer früheren Plasma-Metabolomics-Studie an HS-Milchkühen überein16. Andere lipidbezogene Metaboliten in der Milch, wie SM, MG, DG und TG, wurden in der HS-Gruppe ebenfalls herunterreguliert. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse deutlich, dass HS allgemeine Veränderungen im Lipidstoffwechsel sowohl im Blut als auch in der Milch laktierender Milchkühe hervorruft.

Es gab eine starke Korrelation zwischen den TMA-Spiegeln in Milch und Plasma, was darauf hindeutet, dass Veränderungen der Plasma-TMA-Spiegel16 die Konzentration in Milch beeinflussten (Tabelle 3). Wir fanden heraus, dass HS bei HS-Kühen im Vergleich zu HS-freien Kühen zu einer deutlichen Verringerung des TMA-Spiegels in der Milch führte (Tabelle 1). Dies lässt uns vermuten, dass HS Schwankungen in der Anzahl und/oder Aktivität von Darmmikroben verursacht.

Die Immunfunktion von Kühen kann durch HS32 beeinträchtigt werden. Erhöhtes c-reaktives Protein, TNF-α, IL-2, IL-10, IL-15 und verringertes IL-12 sowohl im Plasma als auch in der Milch der HS-Gruppe werden als Reaktion auf HS-induzierte Entzündungen angesehen29,33,34 , was die Beeinträchtigung des Immunsystems in der HS-Gruppe bestätigt. Die Plasmaspiegel von Cytochrom C und c-reaktivem Protein korrelierten signifikant mit ihren jeweiligen Konzentrationen in der Milch (Ergänzungstabelle S10), was darauf hindeutet, dass HS eine Entzündungsreaktion im gesamten Körper von Milchkühen auslöste33. Während einer Brustimmunreaktion wird die Blut-Milch-Schranke beeinträchtigt35. Daher wurde die von uns zuvor berichtete Hoch- oder Herunterregulierung der Laktat-, Pyruvat-, Kreatin-, Aceton-, BHBA-, TMA-, Ölsäure-, Linolsäure-, LysoPC 16:0- und PC 42:2-Spiegel im Plasma16 auch in Milch beobachtet in der vorliegenden Studie (Tabelle 3). Obwohl die Konzentrationen dieser 10 Kandidaten-Biomarker in der Milch signifikant mit ihren jeweiligen Konzentrationen im Blut korrelierten, zeigten die verbleibenden 43 potenziellen Biomarker (Tabellen 1 und 2) in der Milch keine ähnlichen Korrelationen, was darauf hindeutet, dass die ersten 10 Biomarker HS-induziert widerspiegeln können Störungen der Blutmetaboliten, während die restlichen 43 eher auf eine gestörte Brustfunktion als auf allgemeine Stoffwechselstörungen zurückzuführen sind.

Da die Konzentrationen der Kandidaten-Biomarker Laktat, Pyruvat, Kreatin, Aceton, BHBA, TMA, Ölsäure, Linolsäure, LysoPC 16:0 und PC 42:2 in der Milch starke Korrelationen mit ihren jeweiligen Konzentrationen im Blut von HS- Bei freilaufenden und HS-Milchkühen kann der Nachweis dieser Milchmetaboliten HS-Zustände und HS-induzierte Störungen im allgemeinen Stoffwechsel diagnostizieren. Andere potenzielle Biomarker können HS-induzierte Veränderungen in der Milchfunktion von HS-Milchkühen widerspiegeln. Die Ergebnisse identifizieren potenzielle Biomarker, die zur genauen Überwachung der HS-Zustände laktierender Milchkühe verwendet werden könnten, und verdienen weitere Untersuchungen, um die physiologischen Mechanismen aufzuklären, die den HS-induzierten Veränderungen in den Stoffwechselwegen zugrunde liegen. Dies könnte zu besseren Managementpraktiken für HS-exponierte Milchkühe führen.

Alle Tierversuche wurden nach den Grundsätzen des Ausschusses für Tierpflege und -nutzung der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften (Peking, China) durchgeführt, der die Studienprotokolle genehmigte.

Deuteriumoxid und deuteriertes Chloroform wurden von Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Tewksbury, MA, USA) in den USA bezogen; und 3-(Trimethylsilyl)propionsäure-2,2,3,3,d4-propionsäure-Natriumsalz wurde von Merck Canada Inc. (Kirkland, QC, Kanada) gekauft. Methanol in HPLC-Qualität, Methyl-tert-butylether, Wasser, Ameisensäure und Ammoniumformiat wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen.

Gemäß NRC (1971) wurde THI mit der Formel berechnet: THI = (1,8 × Tdb + 32) −[(0,55−0,0055 × RH) × (1,8 × Tdb −26,8)], wobei Tdb die Trockenkugeltemperatur ist (°C) und RH ist die relative Luftfeuchtigkeit (%). In diesem Versuch wurden 44 Holsteinkühe in der zweiten Parität in der Mitte der Laktation verwendet, denen das gleiche Futter verabreicht wurde. Die HS-freie Gruppe bestand aus 22 Kühen, deren Milchproben in der Frühjahrssaison einen Monat lang bei einem THI von 50–55 entnommen wurden. Die HS-Gruppe bestand aus 22 Kühen, wobei die Proben in der Sommersaison entnommen wurden, nachdem der THI innerhalb eines Monats allmählich von 68 auf 80 anstieg und eine Woche lang stabil bei 80 blieb. Vor der Fütterung wurden Morgenmilchproben entnommen und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Die detaillierten Merkmale der ausgewählten Milchkühe, die Futterzusammensetzung, die Temperatur, die Luftfeuchtigkeit, die Rektaltemperatur, die Atemfrequenz und die Produktionsmerkmale der beiden Gruppen von Milchkühen sind in der Ergänzungstabelle S1–S4 aufgeführt, die auf die veröffentlichte Veröffentlichung verweist16.

Milchproben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut, homogenisiert und 30 Minuten lang bei 4 °C und 20.000 g zentrifugiert. Alle Proben wurden bei 298 K mit einem VARIAN VNMRS 600 MHz NMR-SPEKTROMETER (Varian Inc., Palo Alto, CA) analysiert, das bei 599,871 MHz unter Verwendung einer 5-mm-Inverse-Protonen-(HX)-Dreifachresonanzsonde mit Z-Achsen-Gradientenspule arbeitete . Die 1H-NMR-Spektren des Milchserums wurden mit der wasserunterdrückten standardmäßigen 1D-CPMG-Pulssequenz (RD-90°-(τ-180°-τ)n-ACQ) aufgezeichnet, wobei eine feste Gesamt-Spin-Spin-Relaxationsverzögerung von 2nτ von 320 ms wurden angewendet, um die breiten NMR-Signale von langsam taumelnden Molekülen (z. B. Proteinen) abzuschwächen und diejenigen von Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht und einigen Lipidkomponenten zurückzuhalten36. Die freien Induktionszerfälle (FIDs) wurden über 64 K Datenpunkte mit einer spektralen Breite von 12000 Hz und 128 Scans erfasst. Die FIDs wurden vor der Fourier-Transformation (FT) mit Nullen auf die doppelte Größe aufgefüllt und mit einem exponentiellen Linienverbreiterungsfaktor von 0,5 Hz multipliziert. Die 1H-NMR-Spektren von Milchfett erfordern keine Vorsättigung der Wasserresonanz. Hier haben wir eine einfache 901-Puls-Erfassungssequenz verwendet, da wir vollständig entspannte Spektren gemessen haben. Wir haben 64 Transienten in 32.768 Datenpunkten gesammelt; Die anderen Parameter waren wie folgt: Relaxationsverzögerung = 2 s, Spektralbreite = 20 ppm und Erfassungszeit = 1,36 s. Die Metaboliten wurden identifiziert, indem die experimentellen Spektren in die Chenomx-Spektraldatenbank (Edmonton, AB, Kanada) eingefügt und mit den Spektren von Standardverbindungen verglichen wurden.

Fünfzig Mikroliter (50 μl) Milch wurden mit 350 μl Lösungsmitteln bestehend aus Methanol und Methyl-tert-butylether (MTBE) im Verhältnis 1:1 (v:v) gemischt und Vitamin E-Acetat als interner Standard hinzugefügt ( IS), bei einer Endkonzentration von 25 ppm. Die Lösung wurde durch eine Captiva 96-Well-Filterplatte (Agilent, Santa Clara, CA, USA) filtriert. LC-MS/MS-Analysen wurden mit dem ultraschnellen LC (UFLC) 20ADXR-System von Shimadzu und einem 5600 Triple TOF-Massenspektrometer (Applied Biosystems/MDS Sciex, Concord, ON, Kanada) durchgeführt. Fünf Mikroliter (5 μl) der vorbereiteten Proben wurden bei 40 °C in eine Säule injiziert (ACQUITY UPLC HSS T3 1,8 μm, 2,1 × 100 mm Säule, Waters, Dublin, Irland). Die Temperatur des Autosamplers wurde bei 15 °C gehalten. Der Gradient bestand aus mobiler Phase A (10 mM Ammoniumformiat in Wasser) und mobiler Phase B (10 mM Ammoniumformiat in Methanol), gepumpt mit 0,3 ml/min innerhalb einer Gesamtlaufzeit von 33 min. Die linearen Gradienten waren: 70 % B nach 1 Minute, 99 % B nach 15 Minuten, 99 % B nach 20 Minuten, 1 % B nach 20,1 Minuten und 1 % B nach 33 Minuten. Die Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) wurde im positiven Ionisationsmodus eingerichtet. Die MS-Parameter für die Erkennung waren wie folgt: ESI-Quellenspannung 5,5 kV; Verdampfertemperatur: 550 °C; Druck des Trocknungsgases (N2), 60 psi; Zerstäubergasdruck (N2), 60 psi; Vorhanggasdruck (N2), 30 psi; und Declustering-Potenzial 50 V. Der Scanbereich betrug m/z 60–1.000. Die Datenerfassung und -verarbeitung erfolgte mit der Analyst® TF 1.6-Software (Applied Biosystems/MDS Sciex). Die automatische Kalibrierung wurde mit dem Calibrant Delivery System sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus durchgeführt. Die Metaboliten wurden mithilfe des informationsabhängigen Erfassungsmodus in den MS/MS-Analysen identifiziert. Die Kollisionsenergie betrug 35 eV. Zur Identifizierung der Ionenstrukturen wurden hochauflösende MS, Isotopenhäufigkeitsverhältnisse, MS/MS, die Human Metabolome-Datenbank, die METLIN-Datenbank37, eine Literatursuche und Vergleiche mit Standards eingesetzt. Qualitätskontrollproben (QC) wurden alle 10 LC-MS-Läufe erfasst, um die Reproduzierbarkeit des Instruments zu überwachen. Die Plasmaproben der verschiedenen Gruppen wurden während der Analyse zufällig abgewechselt. Die automatische Kalibrierung wurde mit dem Calibrant Delivery System sowohl im positiven als auch im negativen Ionenmodus durchgeführt.

Die rohen 1H-NMR-Spektren wurden mithilfe der TopSpin-Software (Version 3.0; BrukerBiospin) manuell hinsichtlich Phasen- und Basislinienverzerrungen korrigiert und auf die anomere Dublettresonanz von Laktose (δ 5,233 ppm) für die Milchserumspektren und das 3-(Trimethylsilyl)propionsäure bezogen -2,2,3,3,d4 saures Natriumsalz (δ 0,0 ppm) Signal für die Milchfettspektren. Die 1H-NMR-Spektren aller Proben wurden in Integralbereiche von 0,001 ppm eingeteilt und über den Bereich von 0,5–7,0 ppm unter Ausschluss von Wasser (δ 4,7–5,12) unter Verwendung des AMIX-Softwarepakets (Version 3.8.3, BrukerBiospin) integriert. Die Spektren wurden auf die Gesamtsumme der Spektralintegrale normiert, um Unterschiede in den Probenkonzentrationen auszugleichen. Die zweidimensionalen Datenmatrizen aus den Milchserum- und Fettdaten wurden für die anschließende SIMCA-P-Analyse in eine Excel-Datei integriert.

Die rohen LC-MS-Datendateien (.wiff) wurden mit ProteoWizard (http://metlin.scripps.edu/xcms/download/pwiz/pwiz.zip) in das mzXML-Format konvertiert. Die Dateien wurden mit einem Open-Source-XCMS-Paket (Version 1.20.1) in der Statistiksoftware R (Version 2.10.0) zur Spitzenunterscheidung, Filterung und Ausrichtung verarbeitet38. Während der XCMS-Implementierung wurde die R-Paket-KAMERA verwendet, um die Isotopen-, Addukt- und Produkt-Ionen-Peaks zu kommentieren. Die resultierenden zweidimensionalen Matrizen, einschließlich der Beobachtungen (Probennamen) in Spalten, der Variablen (m/z-Retentionszeitpaare) in Zeilen und der Peakflächen, wurden als CSV-Dateien gespeichert. Der IS wurde zur Datenqualitätskontrolle (Reproduzierbarkeit) und Normalisierung verwendet.

Die resultierenden Datensätze wurden dann in das Softwarepaket SIMCA-P 13.0 (Umetrics AB, Umeå, Schweden) importiert; Pareto- und Center-Skalierung wurden auf die LC-MS- bzw. 1H-NMR-Daten angewendet, um das Rauschen und Artefakte in den Modellen zu reduzieren. An den skalierten Daten wurde eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt, um die globalen Cluster- und Trennungstrends oder Ausreißer zu visualisieren. PLS-DA-Modelle wurden angewendet, um das Modell durch 999 zufällige Permutationstests gegen Überanpassung zu validieren. Unterscheidungsvariablen wurden gemäß den S-Diagrammen, der Variablenbedeutung in den Projektionswerten (VIP > 1) und den Rohdatendiagrammen in den OPLS-DA-Modellen ausgewählt16, 17, 18. Darüber hinaus wurden unabhängige t-Tests (P < 0,05) (SPSS Version 13.0) verwendet, um die Bedeutung jedes Metaboliten bei der Unterscheidung der HS-Gruppe von den HS-freien Gruppen zu bestimmen.

Um die Korrelationen zwischen den Konzentrationen aller in Milch entdeckten potenziellen Biomarker und ihren jeweiligen Konzentrationen im Plasma zu analysieren, die zuvor aus gleichzeitig entnommenen Proben gemeldet wurden, wurden partielle Pearson-Korrelationskoeffizienten mit zwei Konfidenzniveaus (0,01 und 0,001) durch Korrektur berechnet HS-Gruppe in erster Ordnung mit dem ParCorA-Softwareprogramm, das unter http://mendes.vbi.vt.edu/tiki-index.php?page heruntergeladen werden kann. Cluster 3.0 und Treeview wurden separat für die Clusteranalyse bzw. -visualisierung verwendet.

Die Elutionsbedingungen des chromatographischen Gradienten blieben unverändert. Der Eluent wurde in ein Dreifach-Quadrupolfallen-Massenspektrometer injiziert, das mit einer ESI-Quelle (QTRAP 5500, Applied Biosystems/MDS Sciex) ausgestattet war. Alle durch LC-MS entdeckten potenziellen Kandidaten wurden durch UFLC-MS/MS im MRM-Modus erkannt. Für jeden interessierenden Analyten wurden die Kollisionsenergien und Vorläufer-/Fragment-Ionenpaare voroptimiert, um ein optimales Signal-Rausch-Verhältnis zu erzeugen. Die MRM-Übergänge sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt.

Die Konzentrationen von Zytokinen, c-reaktivem Protein und Cytochrom C sowohl im Plasma als auch in der Milch wurden mit kommerziell erhältlichen bovinspezifischen ELISA-Kits (Abcam®, Cambridge, MA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.

Zitierweise für diesen Artikel: Tian, H. et al. Integrierte Metabolomics-Studie der Milch hitzegestresster laktierender Milchkühe. Wissenschaft. Rep. 6, 24208; doi: 10.1038/srep24208 (2016).

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Diese Studie wurde vom National Key Basic Research Program of China (Peking, China; 2011CB100805), vom Agricultural Science and Technology Innovation Program (ASTIP-IAS12) und vom Research System of the VR China (nycytx-04-01) unterstützt. und durch das von der China Postdoctoral Science Foundation finanzierte Projekt (Peking, China; 2014M550907).

He Tian, Nan Zheng und Weiyu Wang: Diese Autoren haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Institut für Tierwissenschaften, Chinesische Akademie der Agrarwissenschaften, Peking, 100193, VR China

He Tian, Nan Zheng, Songli Li, Yangdong Zhang und Jiaqi Wang

Die High School ist der Renmin University of China, Peking, 100080, VR China, angeschlossen

Weiyu Wang

Hochschule für Tierwissenschaften und -technologie, Anhui Agricultural University, Hefei, 230036, VR China

Jianbo Cheng

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JW hat die gesamte Studie entworfen und überwacht. JW, HT, NZ und WW planten die Experimente; JC, SL und YZ wählten Milchkühe aus, sammelten Milchproben und stellten sie zur Verfügung. HT führte die NMR- und LC-MS-Analyse sowie das Data Mining durch und verfasste das Manuskript. JW hat das Manuskript überarbeitet. JW, HT, NZ und WW erläuterten die Auswirkungen der Ergebnisse.

Korrespondenz mit Jiaqi Wang.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tian, H., Zheng, N., Wang, W. et al. Integrierte Metabolomics-Studie der Milch hitzegestresster laktierender Milchkühe. Sci Rep 6, 24208 (2016). https://doi.org/10.1038/srep24208

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Eingegangen: 13. Januar 2016

Angenommen: 22. März 2016

Veröffentlicht: 06. April 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep24208

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