Kryo

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 9930 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die kryogene Elektronenmikroskopie wurde zu einem leistungsstarken Werkzeug zur Untersuchung biologischer Objekte. Bei nichtbiologischen Objekten (Lösungen, Gele, Dispersionen, Tone) ist die Polemik über die Interpretation der Ergebnisse der kryogenen Mikroskopie immer noch im Gange und spaltet sich in zwei widersprüchliche Trends: die Betrachtung der Struktur als nahezu realer Zustand der Probe oder als Gefrierartefakte. In dieser Studie wurde eine Mikrostruktur einer Reihe stabiler wässriger Lösungen und Dispersionen (Agar, Kaolin, Montmorillonit, Nanopartikel) mittels Kryo-REM und konfokalem LSM untersucht, um kryofixierte und nicht gefrorene Strukturen zu vergleichen. Die beobachtete Korrelation zwischen diesen beiden Methoden für untersuchte Systeme (Agar, Kaolin, Montmorillonit, NPs) erlaubte die Aussage, dass eine geordnete Mikrostruktur ein inhärentes Merkmal dieser Systeme ist. Einige Inkonsistenzen in den Mikrostrukturabmessungen wurden diskutiert und auf die Unterschiede in den Volumen- und Grenzflächenschichten zurückgeführt. Angeblich besitzen NaCl-Lösungen auch eine dynamische (Femtosekundenebene) Mikrostruktur aus reinen Wasserclustern und solvatisierten Na+- und Cl--Ionen, die sich auf abnormale Eigenschaften des Elektrolyten auswirken können.

Seit der Entdeckung der kryogenen Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) vor über dreißig Jahren wurden auf diesem Gebiet zahlreiche Daten gesammelt1,2. Diese Bildgebungstechnik ermöglicht die Beobachtung von Proben im Mikro- und Nanobereich in ihrer natürlichen wässrigen Umgebung, ohne dass ein Trocknen zu einer irreversiblen Strukturverformung führt. Die Beobachtung wird durch die Wasserverfestigung durch kryogene Mittel, also die Kryofixierung, möglich. Letzteres ist ein entscheidender Schritt in dieser Technik: Ultraschnelles Einfrieren verhindert das Wachstum von Eiskristallen und hält die ursprünglichen Strukturen intakt. Die Kryofixierung erfolgt in der Regel durch Eintauchen einer Probe in ein Kryomittel (Stickstoffbrei, Propan, Ethan usw.), gefolgt von einem Bruch (um die innere Struktur der Probe zu beobachten) und einer Sublimation (d. h. Eisätzen), die dies ermöglicht Struktur ohne Wasserschicht beobachten. Heute ist die Kryo-EM-Technik ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung biologischer Objekte. Eine lang andauernde Diskussion über die Kongruenz zwischen ihrer Mikrostruktur im kryofixierten und nicht gefrorenen Zustand wurde durch den Konsens abgeschlossen, dass Kryo-EM-Ergebnisse den nahezu realen Zustand biologischer Proben in Teilen ihrer dichteren Strukturelemente (Skelett, Membran usw.) widerspiegeln. )1,2. Der Konsens basierte auf den gesammelten Daten, die die Korrelation zwischen verschiedenen Bildgebungstechniken zeigten. Was die flüssigen und gelartigen biologischen Komponenten (Schleim, inter- und extrazelluläre Flüssigkeiten usw.) betrifft, bestehen immer noch Zweifel, die auf die Schwierigkeiten bei der Visualisierung von Strukturen geringer Dichte (geringer Kontrast, Beweglichkeit usw.) zurückzuführen sind. . Eine Möglichkeit, dieses Problem zu lösen, besteht darin, Techniken zu entwickeln, die es ermöglichen, nasse Proben unter nahezu natürlichen Bedingungen mit hoher Auflösung zu beobachten. In diese Richtung wurde über die Entwicklung eines neuartigen atmosphärischen SEM (ASEM) berichtet, bei dem es sich um eine Kombination aus einem invertierten Rasterelektronenmikroskop (mit einer abnehmbaren offenen Kulturschale) und einem Fluoreszenzmikroskop handelt3. Das ASEM ermöglicht die quasi-simultane Beobachtung desselben Bereichs von der Ober- und Unterseite der Probe in wässriger Lösung (eingekapselt in einem elektronendurchlässigen SiN-Film) bei Atmosphärendruck. Mit dieser Technik wurden neuronale Verbindungen, Osteoblasten, endoplasmatisches Retikulum, Knochengewebe, Endozytose und Mitose von Zellen abgebildet3,4.

Im Vergleich zu biologischen Objekten besitzen nichtbiologische wässrige Systeme (z. B. Lösungen, Dispersionen, Gele, Tone) keine ausgeprägten (dichten) Phasengrenzen im Wasser, und die Interpretation ihrer Kryo-EM-Ergebnisse ist immer noch unklar und zweigeteilt widersprüchliche Trends. Einem Trend zufolge wird die an kryofixierten Proben beobachtete Mikrostruktur als Ergebnis der Bildung wässriger Kristallite interpretiert – als Gefrierartefakt5,6,7,8,9,10,11. Letzteres tritt auf, wenn gelöste/dispergierte Substanzen in Richtung Eiskristallperipherie diffundieren und dort eine Struktur bilden7. In einem anderen Trend wird die Mikrostruktur kryofixierter Proben als nahezu realitätsnah betrachtet. Dieser Standpunkt wird häufig durch Korrelation mit Bildern der optischen oder konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) gestützt, wie z. B. für geschäumte Frakturierungsflüssigkeiten, mit Pektin aus Äpfeln gebildete Emulsionen, Nanopartikeldispersionen und mineralische Tone8,11,12 gezeigt wurde. 13,14,15. Aufgefallene Unterschiede in der Mikrostrukturdimension (im Vergleich zu LSM- und Kryo-EM-Ergebnissen) wurden nicht interpretiert und waren daher verwirrend8. Die widersprüchlichen Meinungen zur kryofixierten Mikrostruktur deuten darauf hin, dass die experimentellen Ergebnisse nicht mit dem allgemein akzeptierten Konzept für Lösungen und Kolloide als homogen verteilte Moleküle/Ionen/Partikel im Lösungsmittel übereinstimmen16. Daher ist die Polemik über die Interpretation kryogener Mikroskopie-Beobachtungen nicht-biologischer Proben immer noch im Gange und weitere Forschung ist erforderlich, um dieses Problem zu klären.

Eine weitere wesentliche Frage hängt mit der Vitrifizierung von Wasser und/oder der Größe der bei der Kryofixierung gebildeten Eiskristalle zusammen. Es ist bekannt, dass reines Wasser bei hohen Gefrierraten (auch „kritische (minimale) Abkühlraten“) in der Größenordnung von ~ 106 K/s2,17,18 als dünne Schicht oder kleines Tröpfchen verglast werden kann. Das Vorhandensein gelöster Stoffe verringert die kritischen Abkühlungsraten um Größenordnungen. Für eine Vielzahl gelöster Stoffe (Ethanol, Methanol, Natriumchlorid, Glycerin, Ethylenglykol, Dextrose usw.) ist die kritische Abkühlgeschwindigkeit eine exponentielle Funktion der Konzentration und korreliert mit dem Stokes-Radius des gelösten Stoffes17. In der Kryo-EM-Praxis liegen die erzielten Kühlraten jedoch immer noch weit unter den theoretischen Grenzen18. Es wird angenommen, dass der Volumenanteil des Kristalleises innerhalb der Probe klein genug ist und hochauflösende Rekonstruktionen nicht verhindert2,18. Das heißt, bei Proben ohne ausgeprägte Grenzflächengrenzen im Wasser bleiben Zweifel bestehen – was wir bei Kryo-EM-Messungen wirklich beobachten: Probenstruktur oder Gefrierartefakte? Beobachten wir, dass eine dynamische Solvat-Mikrostruktur im flüssigen Zustand existierte, die wir zum Zeitpunkt der Kryofixierung „stoppten“, oder entstand die Mikrostruktur im Moment des Gefrierens? Das Problem wird durch offensichtliche Ähnlichkeiten zwischen kryofixierten Strukturen von Lösungen und Dispersionen unterschiedlicher chemischer Natur gelöster Stoffe (Tonmineralien, Polysaccharide, kolloidale Gele usw.) noch komplizierter: Waben-, schwammige und lamellenförmige Mikrostrukturen wurden häufig beobachtet10,11,14 ,15. Diese Ähnlichkeiten in der Mikrostruktur wurden üblicherweise als Beweis für die Existenz von Gefrierartefakten interpretiert, die nicht der Realität entsprechen8,9.

Ziel dieser Studie war es, die Mikrostruktur stabiler wässriger Lösungen und Dispersionen von Substanzen unterschiedlichen chemischen Ursprungs (Agar, Kaolin, Montmorillonit, ultrakleines Eisenoxid und Silbernanopartikel (MAg NPs)) mittels kryogener Rasterelektronenmikroskopie zu untersuchen (Kryo-SEM) und konfokales LSM sowie zum Vergleich kryofixierter und ungefrorener Mikrostrukturen. Bei beiden Methoden wurden die Proben als Tropfen mit ähnlichem Volumen untersucht (nicht als dünne Schicht, deren Struktur sich erheblich von der Mikrostruktur des Volumens unterscheiden kann und von Wechselwirkungen zwischen den Phasen abhängt19). Darüber hinaus wurden Kryo-SEM-Untersuchungen von NaCl-Lösungen (0,2–20 Gew.-%) durchgeführt, wobei eine stark geordnete konzentrationsabhängige Mikrostruktur festgestellt wurde. Es wurde eine dynamische Strukturierung von solvatisierten Na+- und Cl−-Ionen und reinen Wasserclustern im flüssigen Zustand vermutet.

In unserer Studie wurden die Proben während der Kryo-SEM- und konfokalen LSM-Messungen voluminös gehalten. Dies ist wichtig, da sich die Mikrostruktur dünner Schichten erheblich von der Mikrostruktur von Massenmaterialien unterscheidet und stark von der Phasengrenzenwechselwirkung abhängt19. Bei der Kryo-SEM wurde eine Probe in ein Loch im Probenstumpf gelegt oder hineingegossen (Abb. 1a). Die Probenvorbereitung für LSM-Messungen erfolgte unter Verwendung einer Gummidichtung, um Volumen bereitzustellen (Schichtdicke zu erhöhen) (Abb. 2a). Fluoreszierende Farbstoffe (Fluorescein, Rhodamin B, Atto 550 NHS), die in die Proben eingebracht wurden, ermöglichten die Verwendung einer ultraniedrigen Laserleistung (0,01–0,15 mW), die die Probenerwärmung, Verzerrung und Wasserverdunstung während der Messungen minimierte.

Fotos eines Stücks Agargel mit Rhodamin B und Probenträger mit 10-mm-Aluminiumhalter, wobei das Gel für Kryo-SEM-Messungen vorbereitet wurde (a); Kryo-SEM-Bilder von Agargel mit Rhodamin B (b).

Fotos eines Stücks Agargel mit Rhodamin B und Glasobjektträgern mit dem für konfokale LSM-Messungen vorbereiteten Gel (a); Konfokale LSM-Bilder von Agargel mit Rhodamin B (Anregungswellenlänge 561 nm, Laserleistung ~ 0,14 mW): „Inseln“ (b), kugelförmige (c links und mittlere Bilder) und geschichtete Strukturen (c rechts); geordnete Mikrostrukturen (d). Kontrast und Helligkeit wurden angepasst.

Bei Kryo-SEM-Messungen von Agargel mit Rhodamin B wurden zwei Arten von Mikrostrukturen beobachtet, schwammige und lamellare, die wie chaotisch gemischte „Inseln“ mit unregelmäßigen Formen (20–400 µm groß) und gezackten Kanten zusammenfallen (Abb. 1b). . Die schwammige Mikrostruktur ist feiner (~ 1 µm-Maßstab), wohingegen die lamellare Mikrostruktur größer ist (~ 10 µm-Maßstab). „Inseln“ werden von der Mikrostruktur der größeren Lamellen durch eine Schale getrennt – eine dünne Schicht, die sich von der Massenmikrostruktur der „Insel“ unterscheidet (Abb. 1b, zweite Reihe). Lamellen sind in Abständen von bis zu 100 µm streng ausgerichtet, während die einzelnen Lamellenelemente diskontinuierlich sind (Abb. 1b, untere Reihe). Kryo-SEM-Messungen zeigten das Vorhandensein einer geordneten Mikrostruktur im Agargel mit Rhodamin B.

Konfokale LSM-Bilder des Agargels mit Rhodamin B zeigten ebenfalls „Inseln“ mit unregelmäßigen Formen (Abb. 2b). Ähnlich wie bei Kryo-REM-Ergebnissen handelt es sich bei den „Inseln“ um volumetrische Strukturen mit unregelmäßigen Formen und einer Größe von 20–400 µm. In den meisten Fällen sahen die „Inseln“ und der Raum zwischen den „Inseln“ einheitlich aus und die Ordnung der Mikrostruktur ist nicht sichtbar. Dennoch wurden mehrere eindeutige Beispiele für die Ordnung der Mikrostruktur gefunden, hauptsächlich nahe der Glasobjektträgergrenze, wenn die „Insel“ auf dem Glas liegt oder „zerbrochen“ war (Abb. 2c–d). Insbesondere wurde festgestellt, dass einige der „Inseln“ aus in Reihen gestapelten Kügelchen (ca. 20 µm Durchmesser) bestehen; die Breite der Reihe betrug ~ 40 µm (Abb. 2c, links, Mitte). Solche Kügelchen wurden während der Kryo-SEM-Studie nicht beobachtet. Auch an der „Insel“-Grenze wurde eine Schichtstruktur festgestellt; Der Abstand zwischen den Schichten lag in der Größenordnung von 8–12 µm (Abb. 2c, rechts). Die in Abb. 2d dargestellten hochgeordneten länglichen (mit Periodizität ~ 5 µm) und porösen (~ 10 µm-Maßstab) Strukturen korrelieren mit Lamellen- und Schwammstrukturen, die bei Kryo-SEM-Messungen beobachtet wurden (siehe Abb. 1b, untere Reihe). Somit liefern konfokale LSM-Messungen von Proben ohne Schritte zur Strukturöffnung (Entfernen von Wasser, Brechen, Sublimation) den Beweis für das Vorhandensein von Mikrostrukturen in nicht gefrorenem Agar-Gel.

In unseren früheren Studien wurde gezeigt, dass MAg-NPs, die mit natürlichen Extrakten (Z. officinale, A. muscaria, S. Crispa) synthetisiert wurden, stabile Hydrokolloide mit ausgeprägter Mikrostruktur bilden14,20,21. Natürliche Extraktverbindungen (Polysaccharide, Proteoglykane usw.) bilden eine Oberflächenschicht auf diesen NPs und sorgen für eine hohe Stabilität ihrer Hydrokolloide. Die hochgeordnete Mikrostruktur der NP-Hydrokolloide zeigt hauptsächlich parallele Streifen (Lamellen) und schwammartige Strukturen. Die Einführung von Rhodamin B (für die LSM-Bildgebung) sowie jede Änderung der Hydrokolloidzusammensetzung können möglicherweise die Mikrostruktur des Hydrokolloids beeinflussen. Aus diesem Grund wurde eine Kryo-SEM- und LSM-Bildgebung für das Hydrokolloid der MAg-NPs mit Rhodamin B durchgeführt. So ergaben Kryo-SEM-Messungen, dass MAg-NPs mit Rhodamin B verschiedene Arten von Mikrostrukturen, wie Lamellen und Schwämme, mit unterschiedlichen Maßstäben enthalten ( ~ 1 µm und ~ 10 µm, zwischen einzelnen Elementen) (Abb. S2). Kryo-SEM-EDS-Messungen bestätigten, dass die Mikrostrukturelemente durch die NPs gebildet werden: Fe- und Ag-Elemente befinden sich in den Mikrostrukturelementen und O (aus Wasser) befindet sich dazwischen (Abb. S2, a). Hochvergrößerte Bilder des Mikrostrukturelements zeigen, dass es aus 100 nm großen Kügelchen (Nanopartikeln mit Solvathülle) besteht (Abb. S2, b). Außerdem wurde eine Vielzahl größerer runder Formen mit einer Größe von 30–100 µm beobachtet (Abb. 3, markiert durch gelbe gepunktete Linien). Diese abgerundeten Strukturen bestehen innen aus 10 µm großen Lamellen oder schwammigen Strukturen und außen aus einer feinen Schale (≤ 1 µm) (Abb. 3, untere Bilder).

Fotos eines Tropfens MAg-NPs-Hydrokolloid mit Rhodamin B und Probenschlitten mit 10-mm-Aluminiumhalter mit der für Kryo-SEM-Messungen vorbereiteten Probe (a), Kryo-SEM-Bilder von MAg-NPs-Hydrokolloid mit Rhodamin B: abgerundete Strukturen sind durch Punkte eingekreist Zeilen (b).

Konfokale LSM-Messungen des MAg-NPs-Hydrokolloids mit Rhodamin B zeigten die Koexistenz zweier Strukturen: unregelmäßige, kleinere (~ 5–10 µm) und größere, abgerundete Formen (20–100 µm). Abbildung 4c zeigt konfokale LSM-Bilder dieses Hydrokolloids bei einer Anregungswellenlänge von 514 nm und im Reflexionsmodus. Der Reflexionsmodus zeigte eine klare Kantenkontur der rundlichen Struktur, eine 2,5-D-Simulation (x, y, Intensität) bestätigte eine intensive Reflexion an den Kanten der beobachteten Strukturen. Die beobachteten größeren runden Formen ähneln in Größe und Form denen, die während der Kryo-SEM-Studie beobachtet wurden. Die Gleichmäßigkeit dieser rundlichen Strukturen könnte mit dem Vorhandensein einer Schale mit winziger Struktur zusammenhängen, die bei Kryo-SEM-Messungen festgestellt wurde (Abb. 4, untere Bilder).

Fotos eines Tropfens MAg-NPs-Hydrokolloid mit Rhodamin B und Glasobjektträgern mit Gummidichtung mit der Probe dazwischen, vorbereitet für die konfokale LSM-Bildgebung (a); konfokale LSM-Bilder (Anregungswellenlänge 514 nm, Laserleistung 0,01 mW) (b); Doppelkanalmessungen (Anregung 514 nm und Reflexionsmodus), 2,5-dimensionale (2,5D) Simulation (Achsen x, y, Intensität) (c).

In der nächsten Reihe von Experimenten wurde Kaolinton mit Fluorescein für die Kryo-SEM- und konfokale LSM-Bildgebung verwendet. Kaolinpulver (Al2(OH)4Si2O5) ist hydrophil, wasserunlöslich und kann stabiles Hydrokolloid bilden – Kaolinton. Um ein besseres Fluoreszenzsignal zu liefern, wurden zwei Arten von Kaolin-Tonen hergestellt, mit Rhodamin B und Fluorescein. Rhodamin B-Farbstoff verbesserte die Bildgebung nicht (nicht gezeigt), was möglicherweise mit einer schlechten Rhodamin B-Adsorption an Kaolinpartikeln zusammenhängt (dieser Farbstoff ist in Wasser gut löslich und liegt hauptsächlich in der Wasserphase von Kaolinton vor (der Überstand ist gefärbt)). Fluorescein hat eine bessere Affinität zu Kaolinpartikeln (farbloser Überstand) und bietet einen besseren Kontrast bei der konfokalen LSM-Bildgebung, was möglicherweise mit seiner schlechten Löslichkeit in Wasser (löslich in 1 M NaOH, 50 mg/ml) und einer besseren Adsorption an Kaolinpartikeln zusammenhängt. Kryo-SEM-Messungen von Kaolinton mit Fluorescein zeigten Lamellen- und Schwammmikrostrukturen (Abb. 5). Die Wände dieser Strukturen bestehen aus flachen Mikroplatten – Kaolinpartikeln (in Abb. 5b mit gelben gepunkteten Linien eingekreist).

Fotos eines Tropfens Kaolin-Ton mit Fluorescein und eines Probenträgers mit Kaolin-Ton in einem Aluminiumhalter, vorbereitet für das Einfrieren mit Stickstoffbrei (a), Kryo-REM-Bilder von Kaolin-Ton mit Fluorescein (b). Fotos von Kaolin-Ton mit Fluorescein, Glasobjektträgern mit Gummidichtung und Kaolin-Ton dazwischen für die konfokale LSM-Bildgebung (c); Konfokale LSM-Bilder, erhalten bei einer Anregungswellenlänge von 405 nm und einer Laserleistung von 0,002 mW (hell – Kaolin, dunkel – Wasser). Beispiele für die parallele Ausrichtung von Kaolin-Mikrotiterplatten sind in den gelben gestrichelten Linien (d) dargestellt.

Konfokale LSM-Messungen zeigten eine eher chaotische Verteilung der Kaolin-Mikroplatten mit charakteristischem Merkmal – paralleler Ausrichtung der Kaolin-Mikroplatten (Abb. 5d, heller Kontrast – Kaolin, dunkel – Wasser). Einige Beispiele für die parallele Ausrichtung von Kaolin-Mikroplatten sind in Abb. 5d mit einer gepunkteten Linie eingekreist. Letztere Beobachtung korreliert mit Kryo-SEM-Messungen.

In Fortsetzung der Studie wurde ein weiterer Mineralton, Montmorillonit, für die Kryo-SEM- und konfokale LSM-Bildgebung verwendet (Abb. 6a, c). Montmorillonit-Pulver ((Na,Ca)0,33(Al,Mg)2(Si4O10)(OH)2·nH2O) ist hydrophil, wasserunlöslich und kann stabiles Hydrokolloid bilden – Montmorillonit-Ton. Um die konfokale LSM-Bildgebung zu verbessern, wurden zwei Proben von Montmorillonit-Ton mit fluoreszierenden Farbstoffen, Fluorescein und Atto 550 NHS-Ester, hergestellt. Kryo-SEM-Messungen zeigten eine poröse, schwammige Mikrostruktur von Montmorillonit-Ton (Abb. 6b). Der Maßstab dieser Mikrostruktur unterschied sich um das Drei- bis Vierfache (Abb. 6b, erste Reihe, zeigt Mikrostrukturen im Maßstab von ~ 4 µm und ~ 11 µm). Konfokale LSM-Messungen (Abb. 6d) zeigten auch eine hochporöse perforierte Struktur, die mit zuvor veröffentlichten Ergebnissen korreliert2,8,9. Dabei war die Porengröße überwiegend klein, etwa 1 µm, mit einzelnen Einschlüssen größerer Poren (5–20 µm).

Fotos eines Montmorillonit-Tons mit Fluorescein, Probenshuttle mit der Probe für Kryo-SEM (a), Kryo-SEM-Bilder von Montmorillonit-Ton mit Fluorescein (b). Fotos eines Montmorillonit-Tons mit Fluorescein, einem Tropfen zwischen den Glasobjektträgern mit Gummidichtung für die konfokale LSM-Bildgebung (c); Konfokale LSM-Bilder, erhalten bei Anregung 405 nm, Laserleistung 0,002 mW (hell – Montmorillonit, dunkel – Wasser) (d).

Darüber hinaus wurde der Fluoreszenzfarbstoff Atto 550 NHS-Ester (MFCD05865403) in Montmorillonit-Ton eingebracht. Dieser Fluoreszenzfarbstoff ist in DMSO löslich und hat eine Affinität zu Montmorillonit-Partikeln (farbloser Überstand). Die visuelle Beobachtung des Montmorillonit-Tons mit Atto 550 NHS-Ester ergab, dass die Zugabe dieses Farbstoffs die Viskosität verringerte und die Fließfähigkeit erhöhte. Letzteres hing mit der Abnahme der Oberflächenspannung von Montmorillonit-Ton aufgrund der Zugabe von DMSO zusammen, wobei die Oberflächenspannung deutlich niedriger ist als die von Wasser (71,9 bzw. 42,3 mN.m−1 (bei 303,2 K) für Wasser und DMSO)22. Aufgrund der erhöhten Fließfähigkeit (schnelle Partikelbewegung) wurden die konfokalen LSM-Messungen ohne Gummidichtung durchgeführt, wobei der Ton durch eine Glasabdeckung abgedeckt wurde, die die Dicke der Probe verringert (~ 300 µm). Die konfokalen LSM-Messungen (Anregungswellenlänge 561 nm, ultraniedrige Laserleistung ~ 0,01 mW) zeigten gerade, lange Strukturen – Linien (Lamellen) (Abb. 7a). Die Linien waren gruppiert und sehr parallel. Sie bildeten auch spitze Winkel (~ 38°). Wir beziehen die Beobachtung von Lamellenstrukturen auf die verbesserte Wechselwirkung (Affinität) zwischen Mineralton und Glasobjektträgeroberfläche (aufgrund der verringerten Oberflächenspannung und der verbesserten Benetzbarkeit des Tons). Interessanterweise wurden bei Kryo-SEM-Messungen ähnliche spitzwinklige Strukturen auf der Montmorillonit-Tonoberfläche an der Grenze zwischen Probe und Luft festgestellt (Abb. 7b). Diese Ergebnisse zeigten, dass Montmorillonit-Ton je nach hinzugefügtem Fluoreszenzfarbstoff und wahrscheinlich der Dicke der Schicht unterschiedliche Arten von Mikrostrukturen aufweisen kann, nämlich eine gleichmäßige poröse perforierte Struktur und sehr parallele lange Linien (z. B. Lamellen). Diese Ergebnisse zeigen, dass die bei konfokalen LSM-Messungen beobachtete Mikrostruktur von Montmorillonit-Ton stark von der Grenzflächenwechselwirkung an der Ton/Glas-Grenze abhängt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse der Kryo-SEM- und konfokalen LSM-Messungen von Montmorillonit-Ton mit Fluorescein miteinander korrelieren und das Vorhandensein einer gut organisierten Mikrostruktur zeigen.

Konfokale LSM-Bilder von Montmorillonit-Ton mit Atto 550 NHS-Ester (Anregungswellenlänge 561 nm, Laserleistung 0,012 mW, hell – Montmorillonit, dunkel – Wasser) (a); Kryo-SEM-Bilder der Oberfläche (Luft/Ton-Grenze) von Montmorillonit-Ton, die unteren Bilder zeigen Ähnlichkeit (spitze Winkel markiert durch gestrichelte Linien) zwischen Strukturen, die mit Kryo-SEM-Technik (links) und konfokaler LSM-Technik (rechts) (b) beobachtet wurden Montmorillonit-Ton/Luft- und Montmorillonit-Ton/Glas-Grenzen.

Im Rahmen der Studie wurden Reinstwasser und NaCl-Lösungen (0,2–20 Gew.-%) mithilfe der Kryo-SEM-Technik untersucht. Reinstwasser zeigte eine homogene gepunktete Oberfläche (Abb. S3, erste Reihe), wohingegen NaCl-Lösung (0,2 Gew.-%) diskontinuierliche Lamellenstrukturen mit dünnen Wänden zeigte; Der Abstand zwischen den Lamellen betrug 10 ± 2 µm. Bei einer NaCl-Konzentration von 0,8 und 0,9 Gew.-% wurden die Lamellenwände dicker und kontinuierlicher. Lamellenstrukturen bildeten Domänen, die in unterschiedlichen Winkeln zueinander ausgerichtet sind. Bei NaCl-Konzentrationen im Bereich von 1,1 bis 1,5 Gew.-% traten Brücken zwischen den Lamellen auf, die die Lamellenstruktur in eine zellartige umwandelten. Dabei nahm die Wandstärke zu und es wurden immer noch mehrere Löcher in den Wänden beobachtet. Bei NaCl-Konzentrationen von 2,0 und 5,0 Gew.-% wurde die Mikrostruktur vollständig zellartig. Die zellartigen Elemente sind länglich, ihre Querausdehnung beträgt etwa 10 ± 2 µm. Bei NaCl-Konzentrationen von 10,0 und 20,0 Gew.-% nahm die Größe der zellähnlichen Elemente ab (Querdimension 5–8 µm) und die Wanddicke nahm weiter zu. Längs- und Querabmessungen der Elementarzellen näherten sich einander an (Abb. S3). Ein Merkmal wie Mikrolöcher in den Wänden wurde bei NaCl-Lösungen im Konzentrationsbereich von 0,8–2,0 Gew.-% festgestellt (Abb. S4). Das Vorhandensein von Mikrolöchern (0,5–2,0 µm Durchmesser) kann auf Luftblasen zurückgeführt oder als spezifisches Merkmal angesehen werden, das für die Kontinuität der Mikrostrukturwände sorgt.

Die Kryo-SEM-Elementarkartierung zeigte, dass die Na- und Cl-Elemente überwiegend in den Mikrostrukturwänden positioniert waren, während O (aus H2O) zwischen den Wänden lag (Abb. 8a). Na- und Cl-Elemente befinden sich überwiegend in den Mikrostrukturwänden (die homogene Verteilung des für das Plasmasputtern verwendeten Pt-Elements deutete darauf hin, dass mikrostrukturelle Elemente nicht über die Oberfläche der Probe hinausragten und den Elektronenfluss beeinträchtigten). Eine detaillierte Untersuchung (auf Nanoebene) der Struktur dieser Wände ergab, dass sie aus rundlichen Strukturen mit einer Größe von < 50 nm bestehen (Abb. 8b) (Kryo-SEM-EDS-Messungen „im Punkt“ für die beobachteten Kugeln wurden aus technischen Gründen nicht durchgeführt Einschränkung: Bei einer so hohen Vergrößerung (× 100.000) schmilzt die Energie des Elektronenstrahls und zerstört den Analysebereich im Laufe der Zeit (~ 30 s), die zum Sammeln des EDS-Spektrums benötigt wird. Bei NaCl-Lösungen im Konzentrationsbereich von 0,2 bis 5,0 Gew.-% sind die rundlichen Strukturen zufällig gepackt und bilden Solvatationswände, während sie bei Konzentrationen von 10,0 oder 20,0 Gew.-% längliche Drähte bilden (~ 100 nm dick, ≤ 3 µm Länge), die wiederum sind in komplexen Mustern organisiert und bilden die Wände einer zellähnlichen Mikrostruktur. Kryo-SEM-Bilder von NaCl-Lösungen im Mikromaßstab zeigen eine komplexe volumetrische Mikrostruktur, die sich mit zunehmender Konzentration von einer diskontinuierlichen lamellaren Struktur (bei 0,2–1,5 Gew.-%) in eine zellartige Struktur (bei 2,0–20,0 Gew.-%) umwandelt (Abb. S5, S6). Die dreidimensionale (3D) Mikrostruktur von NaCl-Lösungen kann als eine Menge unterschiedlich ausgerichteter Domänen aggregierter zellartiger Elemente beschrieben werden. Die Größe der Domänen beträgt in jeder Dimension etwa 100–500 µm. Die Dicke der Solvatationswände nahm mit der NaCl-Konzentration zu. Eine detaillierte Untersuchung dieser Funktion ist in der ergänzenden Abbildung S7, Tabelle S1–S3 dargestellt.

Cryo-SEM EDS-Elementarkartierung einer 10 Gew.-%igen NaCl-Lösung: Na-, Cl-, O- und Pt-Elementarverteilung. Pt wurde zum Plasmasputtern verwendet. Seine homogene Verteilung zeigt, dass mikrostrukturelle Elemente aus der Probe nicht über die Oberfläche gelangten und den Elektronenfluss beeinflussten (a). Kryo-SEM-Bilder von NaCl-Lösungen (0,8–20 Gew.-%): Mikrostruktur auf nanoskaliger Ebene (b).

Ein weiteres interessantes Merkmal war die Abweichung der Na- und Cl-Atomkonzentrationen vom stöchiometrischen Verhältnis: Abhängig von der analysierten Fläche herrschte die Menge an Na- oder Cl-Atomen vor. In einigen untersuchten Gebieten betrug das Verhältnis zwischen Na- und Cl-Atomen 1 : 1,88. Auf Flächen im Bereich von 475–1230 µm2 (ca. 43,1 ∙ 10−6 mm3, Röntgendurchdringung ~ 3,5 µm) wurde ein Missverhältnis zwischen der Na- und Cl-Atomverteilung beobachtet. Eine solche Inhomogenität kann dazu führen, dass bestimmte Reaktionen lokal vorherrschen und saure oder basische Verbindungen wie HClO, NaOH usw. entstehen. Diese Schlussfolgerung korreliert mit früheren Studien, in denen die mikroskalige pH-Inhomogenität von gefrorenen NaCl-Lösungen bestätigt wurde23,24. Insbesondere wurde das Vorhandensein eines pH-Gradienten ∆pH = 0,2 innerhalb der Solvatisierungswände in der gefrorenen 20 mM NaCl-Lösung mithilfe der ratiometrischen Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen23. Eine andere Studie zeigte, dass Gefrier- und Auftauprozesse in Gegenwart von NaCl den pH-Wert erheblich verändern und zur Zersetzung von Gallussäure führen können24.

Es kann davon ausgegangen werden, dass die beobachtete hochgeordnete Mikrostruktur von NaCl-Lösungen einen nahezu realen Zustand widerspiegelt, d. h. die dynamische Mikrostruktur von reinen Wasserclustern und dicht gepackten solvatisierten Na+- und Cl−-Ionen ist ein inhärentes Merkmal dieses Systems. Diese Annahme kann hilfreich sein, um beispielsweise Elektrolytstörungen zu verstehen.

Es ist allgemein anerkannt, dass Wasser aufgrund eines ausgedehnten Netzwerks von Wasserstoffbrückenbindungen eine hochstrukturierte Flüssigkeit ist; Es besteht jedoch keine Einigkeit darüber, wie die Struktur definiert werden soll25,26. In den letzten Jahren wurde festgestellt, dass Wassermoleküle verschiedene Arten von Strukturen bilden können, z. B. Dimere, Tetramere, Hexamere und Nanocluster27. Solche Wasserstrukturen wurden auf 2D-Oberflächen sichtbar gemacht (auf NaCl(001)-Filmen, die von einer Au(111)-, NaCl(100)-Doppelschicht auf Ag(111)-, Cu(110)-Oberflächen usw. getragen werden)27,28,29 ,30,31. Insbesondere wurde festgestellt, dass Wasser zu verschiedenen Clustern aggregiert, wobei Wasserdimere auf einer Cd(0001)-Oberfläche dominieren27. Interessanterweise wurden die amorphen Eisnanoflocken ausschließlich aus Wasserdimeren aufgebaut. Es wurde gezeigt, dass die ultrahohe Stabilität von Wasserdimeren auf der adsorptionsinduzierten Erhöhung des Dipolmoments von Wasser beruht27. In Salzlösungen existieren zwei Arten von Wassermolekülen nebeneinander: nicht wechselwirkende und direkt mit Ionen wechselwirkende, die eine dynamische Hydratationshülle (Solvatschichten) bilden25,26. Es wurde gezeigt, dass sich die Struktur von Wasser in Solvatschichten von der von nicht wechselwirkendem Wasser unterscheidet und andere Eigenschaften aufweist (z. B. eine größere mittlere Dichte als reines Wasser)26,32. Hydratisierte Ionen können auf einer Pikosekunden-Zeitskala als starre Kugeln betrachtet werden, sodass man sich die Lösung als flüssiges Wasser mit schwebenden Kugeln vorstellen kann33. Dabei hing die Änderung der makroskopischen Eigenschaften von Lösungen (z. B. Erhöhung der Viskosität) normalerweise mit einer Änderung der Wasserstoffbrückenstruktur von reinem Wasser zusammen34,35. Messungen der Orientierungskorrelationszeit von Wassermolekülen in hochkonzentrierten Mg(ClO4)2-, NaClO4- und Na2SO4-Lösungen mittels Femtosekunden-Pump-Probe-Spektroskopie zeigten jedoch, dass die Zugabe von Ionen keinen Einfluss auf die Rotationsdynamik von Wassermolekülen außerhalb hatte die ersten Solvathüllen der Ionen33. Die für reines Wasser und hochkonzentrierte Lösungen von NaClO4, Na2SO4 erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass der Anisotropieabfall wassergebundener OH-Gruppen nicht durch die Anwesenheit hoher Konzentrationen von ClO4−, SO42− und/oder Na+-Ionen beeinflusst wurde. Dies deutete darauf hin, dass auch in hochkonzentrierten Salzlösungen Ionen mit Solvathüllen neben reinem Wasser vorliegen, was mit unseren Erkenntnissen übereinstimmt. Darüber hinaus wurde die Bildung geordneter Partikelcluster entlang der Fließrichtung in Dispersionen sichtbar gemacht und als Ursprung der Scherverdickung in kolloidalen Dispersionen interpretiert36.

In dieser Studie wurde die Mikrostruktur stabiler wässriger Systeme mithilfe von Kryo-SEM- und konfokalen LSM-Techniken untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine Übereinstimmung der Strukturmerkmale, die durch Kryo-SEM- und konfokale LSM-Messungen für Agargel, Mineralton (Montmorillonit und Kaolin) und NP-Hydrokolloid beobachtet wurden. Insbesondere bei Agar-Gel waren solche gemeinsamen Mikrostrukturmerkmale volumetrische Strukturen mit unregelmäßigen Formen mit einer Größe von 20–400 µm, Schichtstrukturen, hochgeordnete längliche und poröse Strukturen. Ein gemeinsames Merkmal von MAg-NPs waren rundliche Formen mit einer Größe von 20–100 µm. Ein charakteristisches Merkmal von Kaolin-Ton war die parallele Ausrichtung der Kaolin-Mikroplättchen, während es sich bei Montmorillonit-Ton um eine poröse, schwammige Mikrostruktur handelte. Neben ähnlichen Merkmalen, die zwischen den Ergebnissen der beiden verwendeten Techniken beobachtet wurden, gab es auch Unterschiede, wie z. B. eine Inkonsistenz der Gesamtansicht und Dimension der Mikrostruktur. Letzteres kann den verschiedenen Probenbeobachtungszonen während der Messungen zugeordnet werden: Bei der Kryo-SEM wird die Volumenstruktur beobachtet (aufgrund von Probenbrüchen), während bei der konfokalen LSM-Studie eine dünne (einige Mikrometer) Schicht nahe der Glasoberfläche untersucht wurde ( Beispielsweise beträgt die Tiefe bei 1 AE ~ 1 µm (Schema in Abb. 9a). Wie bekannt, unterscheidet sich die Mikrostruktur des Volumens erheblich von der Oberflächenschicht. Abbildung 9b zeigt Beispiele für Mikrostrukturskalenübergänge im Polysaccharidgel (Luft/Gel-Grenze) von der Masse zur Oberfläche durch die Zwischenschicht. Der Skalenübergang kann von einer grobskaligen Mikrostruktur in der Masse zu einer feinen Mikrostruktur auf der Oberfläche und umgekehrt von der feinen Mikrostruktur in der Masse zu einer grobskaligen auf der Oberfläche erfolgen (Abb. 9b)37. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Ergebnisse konfokaler LSM-Messungen wasserhaltiger nichtbiologischer Systeme (dh ohne ausgeprägte Grenzen im Wasser) stark von der Wechselwirkung zwischen Glas und Probe (Affinität zwischen ihnen, Benetzbarkeit usw.) abhängen. Diese Schlussfolgerung wird auch durch unsere oben beschriebenen Ergebnisse konfokaler LSM-Messungen von Montmorillonit-Ton mit Atto 550 NHS gestützt. Montmorillonit-Ton mit diesem Fluoreszenzfarbstoff zeigte hochparallele Strukturen, was auf eine verbesserte Affinität zwischen Ton und Glasoberfläche zurückzuführen war (zum Vergleich: Montmorillonit-Ton mit Fluoreszein zeigte nur poröse, schwammige Strukturen). Daher unterscheidet sich die Mikrostruktur der oberflächennahen Schicht (Substrat/Probe, Luft/Probe) in Maßstab und Muster deutlich von der in der Masse.

Schema der Probenbeobachtung bei konfokalen LSM- und Kryo-SEM-Messungen (a); Beispiele für Mikrostruktur-Skalentransfer durch Übergangsschichten (durch gepunktete Linie eingekreist) von der Oberfläche zur Masse im Polysaccharid-Gel an der Luft/Gel-Grenze37 (b); Schema der dynamischen Solvatisierungsmikrostruktur (c).

Die Korrelation zwischen Kryo-SEM- und konfokalen LSM-Messungen stabiler wasserhaltiger Systeme (Agar, Kaolin, Montmorillonit, MAg-NPs) ließ den Schluss zu, dass eine geordnete Mikrostruktur ein inhärentes Merkmal dieser Systeme ist. Es wird angenommen, dass NaCl-Lösungen auch eine dynamische (Femtosekunden-Ebene) geordnete Mikrostruktur besitzen können, die aus reinen Wasserclustern und dicht gepackten solvatisierten Na+- und Cl−-Ionen besteht (vorgeschlagenes Schema in Abb. 9c). Die Annahme über die Existenz von Mikrostrukturen kann zum Verständnis abnormaler Eigenschaften (z. B. Dichte, Viskosität, pH-Wert) einiger wässriger Systeme (Elektrolyte, Dispersionen usw.) beitragen.

Die analytischen Reagenzien von Agar (CAS 9002-18-0, A1296), Kaolin (CAS 1332-58-7), Montmorillonit (CAS 1318-93-0), Rhodamin B (CAS 81-88-9), Fluorescein ( freie Säure) (CAS 2321-07-5), CaCl2∙2H2O (CAS 10035-04-8), Fluoreszenzfarbstoff Atto 550 NHS-Ester (MFCD05865403), Dimethylsulfoxid (DMSO) (CAS 67-68-5) wurden gekauft von Sigma-Aldrich und wie erhalten verwendet. Natriumchlorid 99,9 % rein (CAS 7647-14-5) und Ammoniumhydroxid (CAS 1310-73-2) wurden von POCH SA bezogen. Während der gesamten Experimente wurde hochreines Wasser (Widerstand > 17 MΩcm) aus einem GZY-P10-Wassersystem verwendet. Für Kryo-REM-Messungen wurde entionisiertes, hochreines, sterilfiltriertes Wasser (CAS 7732-8-5, Sigma-Aldrich) verwendet. Für konfokale LSM-Messungen wurden Glasobjektträger 24 × 50 mm (Menzel Gläser) und 18 × 18 mm (Zeiss) sowie Gummidichtung (O-Ring, 13 × 1 mm) verwendet.

In dieser Studie wurde ein Hydrokolloid aus ultrakleinen Eisenoxid- und Silber-NPs (MAg) verwendet, dessen Herstellung, physikalisch-chemische und biologische Charakterisierung bereitgestellt wurde21. MAg-NPs-Hydrokolloide sind in der Lage, stabile wässrige Dispersionen und bei hoher Konzentration (≥ 37 mg/ml) kolloidale Gele zu bilden. In dieser Studie wurde dem MAg-Hydrokolloid der Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin B zugesetzt (Hydrokolloidkonzentration: NPs – 38,2 mg/ml, Rhodamin B – 49,2 µg/ml), um den Kontrast bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)-Bildgebung zu verbessern (bis). Verwenden Sie eine extrem niedrige Laserleistung, um die Erwärmung der Probe und die Wasserverdunstung während der Messungen zu minimieren. Die Konzentration von Rhodamin B im MAg-Hydrokolloid betrug 49,2 µg/ml. Nach der Zugabe von Rhodamin B wurde das MAg-Hydrokolloid verwirbelt und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 °C gelagert.

Zur Herstellung von Agargel (5 Gew.-%) mit Rhodamin B wurde eine Rhodamin B-Lösung (100 µl, 2,95 mg/ml) mit 4900 µl Wasser gemischt und mit Agarpulver (250 mg) kombiniert. Die Konzentration von Rhodamin B im Agargel betrug 59 µg/ml. Um das Agar zu lösen, wurde ein hitzebeständiges Glas mit der vorbereiteten Mischung für einige Minuten in die Mikrowelle gestellt, um ein Kochen zu vermeiden. Das abgekühlte, starre und transparente Gel wurde bis zur Verwendung an einem dunklen Ort bei 4 °C gelagert.

Um Kaolinton (27,5 Gew.-%) herzustellen, wurden 1,5 g Kaolinpulver mit 5000 µl Wasser gemischt, dann wurden 1,6 mg Fluorescein, 150 µl 5 M NaOH und 300 µl CaCl2 ∙2H2O (5 Gew.-%) zugegeben. gemischt, 2 h lang beschallt und 48 h lang bei Raumtemperatur im Dunkeln belassen. Die Konzentration von Fluorescein in Kaolin-Ton betrug 293,5 µg/ml. Vorbereiteter Kaolinton wurde bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 °C gelagert.

Um Montmorillonit-Ton (30 Gew.-%) herzustellen, wurden 1,5 g Montmorillonit-Pulver mit 4550 µl Wasser gemischt, dann wurden 1,6 mg Fluorescein, 150 µl 5 M NaOH und 300 µl 5 Gew.-% CaCl2 ∙2H2O hinzugefügt und gemischt. 2 Stunden lang beschallt und 48 Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur belassen. Die Konzentration von Fluorescein im Montmorillonit-Ton betrug 320 µg/ml. Vorbereiteter Montmorillonit-Ton wurde bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 °C gelagert.

Um Montmorillonit-Ton mit dem Fluoreszenzfarbstoff Atto 550 NHS-Ester herzustellen, wurde 1 µl Farbstoff-Stammlösung (1 mg/100 µl DMSO) in 1 ml Wasser verdünnt. Dann wurden 200 µl dieser Lösung mit 300 µl Wasser, 150 mg Montmorillonit-Pulver, 10 µl 5 Gew.-% CaCl2 ∙2H2O und 10 µl 5 M NaOH gemischt. Die Konzentration des Atto 550 NHS-Esters im Montmorillonit-Ton betrug 3,85 µg/ml. Vorbereiteter Montmorillonit-Ton wurde vor den Messungen 48 Stunden lang im Dunkeln bei 4 °C gelagert.

Natriumchloridlösungen (0,2–20 Gew.-%) wurden unter Verwendung von Reinstwasser hergestellt.

Kryo-SEM-Messungen wurden mit dem Rasterelektronenmikroskop JEOL 7001F durchgeführt, das mit dem PP3000T-Kryosystem von Quorum Technologies ausgestattet war (einschließlich SEM-Kalttisch, Antikontaminator, säulenmontierter Vorbereitungskammer, PrepDek-Probenvorbereitungstisch, Turbopumpenstapel und CHE3000-Kaltgaskühlsystem). ). Das PP3000T-Kryosystem nutzt die Stickstoff-Schlamm-Tauchgefriermethode zum schnellen Einfrieren von Proben. Flüssiger Stickstoff gefriert bei 63 K (− 210 °C) und einem breiten Druckbereich. Durch Eintauchen eines Gegenstands in Stickstoffschlamm wird eine schnellere Abkühlung erreicht als durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff bei dessen Siedepunkt (‒196 °C). Eine hohe Abkühlgeschwindigkeit verhindert das Wachstum von Eiskristallen und fixiert sie in der Keimbildungsphase (mit einer Größe von bis zu 10 nm).2 Gemäß dem Protokoll (PP3000T-Benutzerhandbuch Version 1.4) wurde ein schnelles Einfrieren der Proben an der Arbeitsstation (Markenzeichen PrepDek) durchgeführt, zu der Slusher-Töpfe für gehören Probenvorbereitung und -manipulation sowie die Steuerelektronik. Flüssige Proben wurden als Tropfen (~ 30 µl) und Agargel als Stückchen in ein Loch des Probenstücks gegeben, sodass es über die Oberfläche hinausragte, und auf einem Shuttle montiert. Nach dem Einfrieren wurde die Probe mithilfe eines Kryotransfergeräts in die auf der Säule montierte Vorbereitungskammer übertragen, wodurch sie unter Vakuum gelagert und sauber und feuchtigkeitsfrei gehalten werden konnte. Die mit großen Kaltflächen ausgestattete Vorbereitungskammer bietet die Möglichkeit zum Brechen, Sublimieren und Plasmasputtern von Proben. In der Vorbereitungskammer wurde die Temperatur der Kaltstufe bei etwa ‒185 °C (beim Brechen und Sputtern der Probe) mit einer Stabilität von 1 °C gehalten, und das Kammervakuum lag im Bereich von 8,5·10–4 Pa. Sublimation (Eisätzen). ) wurde bei ‒90 °C durchgeführt; Die Dauer variierte je nach Probe und wurde experimentell ausgewählt (typischerweise zwischen 5 und 50 Minuten), sofern nicht anders angegeben. Die Plasma-Sputter-Beschichtung wurde unter Verwendung eines Pt-Targets durchgeführt. Von der Vorbereitungskammer wurde die Probe anschließend zur Beobachtung in die REM-Kammer überführt. Im Inneren des Elektronenmikroskops befindet sich ein kalter Tisch, der die Proben während der Beobachtung gefroren hält. Die Temperatur des Kalttisches im Elektronenmikroskop wurde auf –190 ± 2 °C (Vakuumniveau ~ 2,6·10–5 Pa) gehalten. Sekundärelektronenbilder der gefrorenen Probe wurden bei 5 keV aufgenommen. Die energiedispersive Analyse (EDS) wurde mit dem X-Max 80 mm2 Large Area SDD Silicon Drift Detector (Oxford Instruments) bei 15 keV durchgeführt. Kryo-SEM-Messungen von NaCl-Lösungen wurden mit goldbedampften Probenröhrchen durchgeführt, die Sublimationsdauer betrug 30–60 Minuten bei ‒ 90 °C; Die Sublimationszeit für die Kryo-SEM-EDS-Analyse wurde auf 10–15 Minuten verkürzt (um die Probenoberfläche flach zu halten).

Die Bildgebung von Agargel, Mineralton und NP-Hydrokolloid bei Raumtemperatur (ohne Einfrieren) wurde mit einem konfokalen LSM Zeiss LSM 780 durchgeführt, das mit einem abstimmbaren Femtosekunden-Infrarotlaser zur Zwei-Photonen-Anregung ausgestattet war. Die Probe (30 µl oder 4 × 4 mm großes Gelstück) wurde auf einen Glasobjektträger (24 × 50 mm) gelegt, mit einer Gummidichtung (O-Ring 13 × 1 mm) oben, innerhalb der Gummidichtung (zur Aufbewahrung). Probe volumetrisch während der Messung; Dicke eines Gummipolsters ≈ Dicke der Probe) und mit einem weiteren Glasobjektträger (18 × 18 mm) abgedeckt (um die Wasserverdunstung während der Messungen zu reduzieren) (siehe Abb. 2a). Die Messungen aller Proben wurden mit dem Objektiv C-Apochromat 40x/1,20 W Corr M27 (numerische Apertur 1,2) bei niedriger Laserleistung (< 1 % der nominalen Laserleistung; zur Reduzierung der Wasserverdunstung und laserinduzierter Veränderungen in der Probe) durchgeführt. , Verstärkung 830. Für die Bildaufzeichnung wurde der Zeilenmittelwertmodus angewendet. Die Konzentrationen von Rhodamin B, Fluorescein und Atto 550 NHS-Fluoreszenzfarbstoffen in den Proben wurden oben im Abschnitt „Herstellung von Lösungen und Dispersionen“ erwähnt. Agargel mit Rhodamin B wurde bei einer Laseranregungswellenlänge von 561 nm und einem Emissionsbereich von 585–735 nm gemessen. MAg-NPs-Hydrokolloid mit Rhodamin B wurde bei einer Anregungswellenlänge von 514 nm, einer Emission von 536–674 nm und im Reflexionsmodus gemessen. Die 2,5-dimensionalen (2,5D) Bilder (Achsen x, y, Intensität) wurden mithilfe einer Verarbeitungstechnik erhalten, die die Zusammenführung zweier Bilder ermöglicht. Messungen von Kaolin- und Montmorillonit-Tonen mit Fluorescein wurden bei einer Anregung von 405 nm durchgeführt, und die Emission wurde im Bereich 416–493 nm aufgezeichnet. Montmorillonit-Ton mit Atto 550 NHS-Ester wurde zwischen einen Glasobjektträger und ein Deckglas (ohne Gummidichtung) getropft und bei einer Anregungswellenlänge von 561 nm und einer Emission von 571–670 nm gemessen. Alle Bilder wurden in der Nähe der Glasobjektträgeroberfläche aufgenommen.

Alle während dieser Studie generierten und analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Die finanzielle Unterstützung erfolgte durch das NanoBioMedical Centre der Adam-Mickiewicz-Universität Posen, Polen. Die Finanzierung der Open-Access-Kosten für Veröffentlichungen erfolgte durch das ID-UB-Programm der Adam-Mickiewicz-Universität Posen, Polen. Der Autor ist Dr. Barbara Peplińska sehr dankbar für die Zusammenarbeit und den Unterricht in kryogener Rasterelektronenmikroskopie, für fruchtbare Diskussionen, Kommentare, das Korrekturlesen und Bearbeiten von Artikeln. Der Autor möchte sich auch bei Dr. Bartosz Grzeszkowiak und Dr. Weronika Andrzejewska für den Fluoreszenzfarbstoff Atto und Reinstwasser bedanken, die ihnen freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurden.

NanoBioMedical Centre, Adam-Mickiewicz-Universität, 61-614, Posen, Polen

Olena Iwaschchenko

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OI schrieb den Haupttext des Manuskripts, bereitete Abbildungen vor und führte Messungen durch.

Korrespondenz mit Olena Ivashchenko.

Der Autor gibt keine Interessenkonflikte an.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ivashchenko, O. Kryo-SEM- und konfokale LSM-Studien von Agargel, Nanopartikel-Hydrokolloid, Mineralton und Salzlösungen. Sci Rep 12, 9930 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14230-w

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Eingegangen: 18. März 2022

Angenommen: 02. Juni 2022

Veröffentlicht: 15. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14230-w

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