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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3300 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) spielt eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie der kongestiven Herzinsuffizienz (CHF), was den Einsatz von Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmern (ACEi) bei Hunden und Menschen mit Herzerkrankungen rechtfertigt. Bahnbrechende Studien an Herzinsuffizienz bei Hunden hatten gezeigt, dass die pharmakologische Wirkung von Benazepril relativ unabhängig von Dosen über 0,25 mg/kg p.o. war, was eine Begründung für die in Europa gekennzeichnete Benazepril-Dosis bei Hunden mit Herzinsuffizienz lieferte. Die meisten dieser früheren Studien stützten sich jedoch auf Messungen der ACE-Aktivität, einem suboptimalen Endpunkt zur Charakterisierung der Wirkung von ACEi auf das RAAS. Die Ziele dieser Studie waren (i) die Erweiterung früherer mathematischer Modellierungsbemühungen der Dosis-Expositions-Wirkungs-Beziehung von Benazepril auf Biomarker des RAAS, die für die CHF-Pathophysiologie und Krankheitsprognose relevant sind; und (ii) eine Softwareimplementierung zu entwickeln, die in der Lage ist, klinische Studien mit Benazepril bei Hunden zur Dosisoptimierung am Krankenbett zu simulieren. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass 0,5 mg/kg PO alle 12 Stunden Benazepril die stärkste Reduktion von Angiotensin II und eine Hochregulierung von RAAS-Alternativweg-Biomarkern bewirken. Dieses Modell wird schließlich um relevante klinische Endpunkte erweitert, die in einer bevorstehenden prospektiven Studie an Hundepatienten mit CHF evaluiert werden.

Obwohl die genaue Pathophysiologie der Herzerkrankungen, die der kongestiven Herzinsuffizienz (CHF) zugrunde liegen, zwischen Mensch und seinem besten Freund unterschiedlich ist, spielt die Überaktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS) eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese und Entwicklung von CHF sowohl beim Menschen als auch beim Menschen Hunde. Um die RAAS-Aktivierung zu reduzieren, werden seit langem ACE-Hemmer wie Benazepril zur Behandlung von CHF bei beiden Spezies eingesetzt1,2,3. Dies macht den Einsatz von Benazepril zur Behandlung von CHF bei Hunden und Menschen zu einer hervorragenden Fallstudie für die Anwendung des One-Health-Initiative-Paradigmas. Dieses Paradigma erkennt an, dass die Sammlung von Daten über die Wirkung von Therapeutika auf CHF bei Hunden das Potenzial hat, die therapeutische Behandlung von CHF beim Menschen zu verbessern und umgekehrt4.

Das RAAS ist ein neurohormonelles Kompensationssystem, das in erster Linie Blutvolumen und -druck durch Modulation des Elektrolyttransports und des Gefäßtonus steuert. Das aktuelle Modell der RAAS-Aktivierung besteht aus zwei Hauptkomponenten. Der klassische RAAS-Weg bezieht sich auf die Peptidkaskade von Angiotensinogen zu Angiotensin I (AngI) und dann von AngI zu Angiotensin II (AngII). Diese enzymatischen Reaktionen werden durch Renin bzw. ACE katalysiert und führen letztendlich zu einer erhöhten Aldosteron (ALD)-Produktion (siehe Abb. 1;4). Zu den kurzfristigen physiologischen Folgen der klassischen RAAS-Aktivierung gehören Vasokonstriktion, renale Natrium- und Wasserretention sowie erhöhter Blutdruck. Zu den langfristigen physiologischen Folgen gehören Flüssigkeitsüberladung, erhöhte kardiale Nachlast sowie Myokard- und Gefäßfibrose5,6,7,8,9. Im Wesentlichen trägt die chronische langfristige klassische RAAS-Aktivierung zur Entwicklung von CHF10,11 bei und wird durch diese stimuliert, während eine Herunterregulierung des klassischen RAAS-Signalwegs mit einer verbesserten Langzeitprognose bei CHF9,12,13,14,15 in Verbindung gebracht wurde. Der alternative RAAS-Signalweg fungiert als Gegenregulationsmechanismus gegen die Aktivierung des klassischen Signalwegs. Die Aktivierung des alternativen RAAS-Signalwegs ist durch die Katalyse von AngII zu Angiotensin (1–7) (d. h. Ang(1–7)) durch das Enzym ACE2 gekennzeichnet. Ang(1–7) wiederum aktiviert Mas-Rezeptoren, was zu Vasodilatation, Diurese und Natriurese führt16. Aufgrund dieses physiologischen Effekts wurde die chronische alternative RAAS-Aktivierung bei CHF mit einem verringerten Risiko einer Herzinsuffizienz bei Patienten mit reduzierter und erhaltener Ejektionsfraktion in Verbindung gebracht. Ein idealer therapeutischer Arzneimittelkandidat für CHF würde daher beide Wege gleichzeitig modulieren und die Aktivität des klassischen RAAS herunterregulieren, während der alternative RAAS-Weg erhalten bleibt oder hochreguliert wird13. Über die Wirkung von Benazepril auf das alternative RAAS bei Menschen oder Hunden ist jedoch wenig bekannt.

Biologische Waffen der RAAS. Man geht davon aus, dass die RAAS-Aktivierung zwei Hauptpfade aufweist, die als gegenregulatorische Mechanismen gegeneinander wirken. Der klassische RAAS-Weg (in Rot-Orange) bezieht sich auf die Peptidkaskade von Angiotensin I (Ang I) zu Angiotensin II (Ang II) über ACE. Dies stimuliert die Aldosteronproduktion, die dann die AT1-Rezeptoren (AT1R) aktiviert. Physiologische Folgen der klassischen RAAS-Aktivierung, einschließlich Vasokonstriktion, Hypertrophie und Fibrose, verschlimmern typischerweise die kongestive Herzinsuffizienz (CHF). Benazepril hemmt ACE und aktiviert dadurch den alternativen RAAS-Signalweg (in grün). Die Aktivierung des alternativen RAAS-Signalwegs ist durch die Katalyse von Ang II zu Ang1-7 durch das Enzym ACE2 gekennzeichnet. Ang1-7 wiederum aktiviert Mas-Rezeptoren, was zu Vasodilatation, Diurese und Natriurese führt. Diese Effekte schützen vor CHF. Unser Ziel ist es, mithilfe mathematischer Modelle eine Dosierung zu bestimmen, die sowohl die Aktivierung des klassischen RAAS-Signalwegs reduziert als auch die Aktivierung alternativer RAAS-Signalwege stimuliert. Diese hypothetische Dosierung würde die CHF-schützende Wirkung von Benazepril maximieren.

Benazeprilhydrochlorid ist ein Nicht-Sulfhydryl-ACE-Hemmer, der häufig zur Behandlung von CHF bei Menschen und Hunden eingesetzt wird. Wie andere ACE-Hemmer ist Benazepril ein Prodrug, das durch Esterasen, hauptsächlich in der Leber, durch Hydrolyse schnell in sein aktives Benazeprilat umgewandelt wird17. Obwohl häufig verschrieben, ist der empfohlene Dosierungsbereich von Benazepril recht breit und es besteht kein klarer Konsens über die ideale Dosis für Patienten mit CHF. Beim Menschen wird Benazepril in der Regel gegen Bluthochdruck in einer Anfangsdosis von 2,5–10 mg pro Tag verschrieben und dann auf 20 oder 40 mg pro Tag erhöht, ein- oder zweimal täglich (alle 24 Stunden oder alle 12 Stunden) verabreicht, was ungefähr 0,5 mg/Tag entspricht. kg alle 12 Stunden für einen 60 kg schweren Erwachsenen18. Bei Hunden beträgt die angegebene Benazepril-Dosis in der EU 0,25–1,0 mg/kg p.o. alle 24 Stunden, während in den Veterinärkonsenserklärungen von ACVIM eine Dosis von 0,5 mg/kg p.o. alle 12 Stunden19 empfohlen wird. Pharmakokinetische (PK) und pharmakodynamische (PD) Studien zum Vergleich verschiedener Benazepril-Dosen bei gesunden Hunden haben bisher keine einheitlichen Empfehlungen geliefert. Die Studie, die für die Registrierung von Benazepril in der EU verwendet wurde, zeigte, dass eine einzelne PO-Dosis von Benazepril die ACE-Aktivität bis zu 24 Stunden lang wirksam unterdrückte und dass die ACE-Hemmung im Plasma unabhängig von einer Dosierung ≥ 0,25 mg/kg2 war. Eine anschließende erneute Analyse dieser Daten mithilfe mathematischer Modelle legte jedoch nahe, dass eine Dosierung alle 12 Stunden (im Gegensatz zu einer Dosierung alle 24 Stunden) eine stärkere Hemmung von ACE bei gleicher Gesamtdosis alle 24 Stunden bewirken würde20. Darüber hinaus deutete eine andere Studie mit Einzeldosen von Enalapril und Benazepril in einer Dosierung von 0,5 mg/kg auf eine viel kürzere Wirkungsdauer hin, wobei die ACE-Unterdrückung < 12 h21 anhielt, und eine kürzlich durchgeführte retrospektive Studie an Hunden mit Herzklappenerkrankungen deutete auf verbesserte Ergebnisse hin q12h Dosierung22.

Es gibt mehrere Gründe, warum sich die Entwicklung konsistenter Empfehlungen für die Dosierung von ACEi in der Veterinärmedizin als schwierig erwiesen hat. In der Vergangenheit wurde die ACE-Aktivität als Ersatz für die RAAS-Aktivität verwendet. Kürzlich wurde jedoch gezeigt, dass die ACE-Aktivität ein ineffizientes Maß für die RAAS-Aktivierung ist. Zahlreiche Studien an Menschen und Hunden haben gezeigt, dass zwischen der zirkulierenden ACE-Aktivität und den Ang II-Konzentrationen kein Zusammenhang besteht4,23. Eine zweite Herausforderung bei der Entwicklung von Planungsempfehlungen ist die erhebliche chronobiologische Modulation des RAAS. Frühere experimentelle Modelle der RAAS-Aktivierung berücksichtigten die Chronobiologie des RAAS nicht, während zeitgenössische Forschungen gezeigt haben, dass Biomarker des Renin-Signalwegs bei Hunden zirkadianen Schwankungen unterliegen4,23,24. Schließlich wurden in bestehenden PKPD-Studien zur Wirkung verschiedener ACEi nicht konsequent Biomarker für alternative RAAS-Aktivierung zusätzlich zu Biomarkern für klassische RAAS-Aktivierung untersucht.

Insgesamt sind zwar die Auswirkungen von ACEi, wie Benazepril, auf die ACE-Aktivität ziemlich gut charakterisiert und der Nutzen der ACE-Hemmung bei CHF wurde in mehreren klinischen Studien sowohl an Menschen als auch an Hunden (0,25 bis 1,0 mg/kg alle 12 Stunden) eindeutig nachgewiesen -q24h) ist wenig über die Wirkung von Benazepril auf den alternativen RAAS-Signalweg bei beiden Arten bekannt. Das Verständnis der dosisabhängigen Wirkung von Benazepril auf Biomarker sowohl des klassischen als auch des alternativen RAAS-Signalwegs bei Hunden würde die Erforschung von Benazepril-Dosierungen ermöglichen, die eine Herunterregulierung des klassischen RAAS bewirken und gleichzeitig das alternative RAAS erhalten oder hochregulieren. Dies würde zu einer Optimierung des klinischen Nutzens führen. Die Sammlung von Daten, die einen solch differenzierten Ansatz zur Dosisoptimierung bei Hunden ermöglichen, würde wertvolle translationale Informationen für eine ähnliche Dosisoptimierung von ACEi beim Menschen liefern. Um die dosisabhängigen Wirkungen von Benazepril auf den klassischen und alternativen Arm des RAAS zu modellieren und vorherzusagen, wollten wir ein nichtlineares Mixed-Effects-Modell (NLME) der Benazepril-PKPD erstellen. Die NLME-Modellierung der Benazepril-PKPD hat sich bereits zuvor als effiziente Methode zur Beschreibung der Wirkung von Benazepril auf das klassische RAAS bei Hunden erwiesen und ist ein anerkannter Rahmen für die Erstellung von PKPD-Modellen11.

Um Daten für diese Modellierungs- und Simulationsbemühungen zu erstellen, wurden neun gesunde Beagles intensiv beprobt, während ihnen Benazepril in verschiedenen Dosierungen und Häufigkeiten verabreicht wurde. Nach der Erstellung der Daten bestand unser Ziel darin, ein quantitatives Systempharmakologiemodell (QSP) zu verwenden, um die PKPD-Beziehung von Benazepril(at) zu Biomarkern des RAAS zu charakterisieren, die für die CHF-Pathophysiologie relevant und mit Morbidität/Mortalität assoziiert sind {Angiotensin I, II, III, IV, (1–7)}. Die QSP-Modellierung ist eine Untergruppe der PKPD-Modelle, die darauf abzielt, das Verhalten eines Arzneimittels im Hinblick auf die Biologie seines Wirkmechanismus zu beschreiben. Nach der Entwicklung und Kalibrierung des Modells haben wir eine Softwareimplementierung des Benazeprilat-RAAS-QSP-Modells weiterentwickelt, mit der die Wirkung von Benazepril HCL in verschiedenen Dosen in einer größeren Population virtueller Hunde schnell simuliert werden kann. Durch die Entwicklung einer benutzerfreundlichen Simulationsschnittstelle für unser Modell bestand das Ziel dieser Arbeit darin, eine erste Vorhersage der optimalen Dosis/Zeit der Benazepril-Verabreichung bei Hunden zu treffen, um zukünftige Untersuchungen bei Patienten mit CHF zu unterstützen.

Alle Studienhunde erhielten wie vorgesehen alle oralen Benazepril-Dosen. Hunde wurden auf Nebenwirkungen im Zusammenhang mit der Benazepril-Kennzeichnung sowie auf solche im Zusammenhang mit dem allgemeinen Tierschutz überwacht, z. B. Erbrechen, Durchfall, Appetitlosigkeit, Schwäche/Hypotonie, Müdigkeit, Koordinationsstörungen, Hyperkreatininämie. Bei den Tieren wurden im Verlauf der Studie keine nachteiligen Wirkungen beobachtet, und die durchgeführten Blutbild- und Chemieuntersuchungen ergaben keine Hinweise auf hämatologische oder biochemische Anomalien aufgrund der Benazepril-Dosierung.

Die Daten wurden für die mathematische Modellierung gemäß den Anweisungen in der Monolix-Dokumentation25 zusammengestellt und standardisiert. Mit Ausnahme der Standardisierung der Einheiten als molare Mengen und Konzentrationen wurden die Rohdaten nicht transformiert. Die Dosen wurden anhand des Molekulargewichts von Benazepril-HCl transformiert, während die Konzentrationen anhand des Molekulargewichts des aktiven Metaboliten Benazeprilat transformiert wurden. Die Daten wurden vor, während und nach der mathematischen Modellierung auf Massentrends und Datenqualität überprüft.

Daten unterhalb der unteren Quantifizierungsgrenze (LLOQ) wurden modelliert, indem der Wahrscheinlichkeitsfunktion ein Term hinzugefügt wurde, der die Wahrscheinlichkeit beschreibt, dass die wahre Beobachtung zwischen Null und dem LLOQ liegt. Dies entspricht der im NONMEM (Non-linear Mixed) implementierten M3-Methode Software zur Modellierung von Effekten.

Der log10-Zeitverlauf von Benazeprilat sowie der relevanten RAAS-Biomarker ist in Abb. 2 wiedergegeben. Bemerkenswert ist, dass es einige experimentelle Hintergrundstörungen in der Pharmakodynamik einiger Biomarker gab, die letztendlich die Qualität der Modellvorhersage beeinträchtigten. Das Rauschen war am deutlichsten beim Biomarker Angiotensin III (2–8) (d. h. AngIII), wo die Größenordnung der Bestimmungsgrenze (2,5 pmol/L) etwa die Hälfte der Messung im 3. Quartil (5,1 pmol/L) betrug. . Vermutete Ausreißer wurden markiert und als Modellkovariaten auf statistische Signifikanz getestet. Es wurde jedoch festgestellt, dass keiner der gekennzeichneten Datenpunkte signifikant genug Ausreißer darstellte, um von der Modellerstellung ausgeschlossen zu werden.

Pharmakodynamik von RAAS-Biomarkern. Ein Überblick über den Plasma-Zeitverlauf mehrerer RAAS-Biomarker sowie des aktiven Metaboliten von Benazepril, Benazeprilat. Der zeitliche Verlauf jedes Subjekts wird durch eine rote Linie und Punkte angezeigt. Die goldene Kurve ist der mittlere Zeitverlaufswert.

Im Folgenden finden Sie eine Zusammenfassung des Modellbildungsprozesses. Die empirische Basisversion des vollständigen Modells war größtenteils eine Adaption des Benazeprilat-PKPD-Modells von Mochel et al.23. Insgesamt wurden ausgehend vom empirischen Basismodell über 100 verschiedene Strukturmodifikationen getestet, um unser endgültiges QSP-Modell zu erstellen. Um die Ergebnisberichterstattung zu vereinfachen, werden die wichtigsten getesteten Modifikationen in den folgenden beiden Abschnitten zusammengefasst. Trotz der Aufteilung der Abschnitte in PK und PD wurden nach der Erstellung eines Basismodells alle Modellanpassungen am vollständigen PKPD-Datensatz durchgeführt.

Der PK-Teil des Basismodells war ein herkömmliches 2-Kompartiment-Mamillenmodell mit sättigbarem Austausch zwischen dem zentralen und dem peripheren Kompartiment. Aufbauend auf diesem ersten Modell wurden mehrere Modifikationen der PK-Struktur evaluiert. Zunächst wurden mehrere Standard-Kompartimentvarianten getestet, dh unter Verwendung von 1-, 2- oder 3-Kompartiment-Dispositionsfunktionen. Insgesamt übertraf ein 2-Kompartiment-PK-Modell die anderen Kandidatenmodelle aufgrund der Präzision einzelner Parameter und der Gesamtqualität der Anpassung. Zweitens wurde die unspezifische (geringe Affinität, hohe Kapazität) Bindung von Benazeprilat an Plasmaproteine durch ein drittes Kompartiment innerhalb des zentralen Kompartiments repräsentiert, das den freien Umlauf von Benazeprilat darstellte. Das Volumen des unspezifischen Bindungskompartiments (Vns) stellt die relative Bindungskapazität von Benazeprilat dar, das im Plasma verteilt ist, aber nicht frei zirkuliert oder mit ACE interagiert. Daher ist die Gesamtmenge an messbarem Benazeprilat im Plasma eine Kombination aus der unspezifisch an Plasmaproteine (Ins) gebundenen Menge (geringe Affinität, hohe Kapazität), der spezifisch an ACE gebundenen Menge (hohe Affinität, niedrige Kapazität) und der Menge von Benazeprilat im freien Verkehr (Ifree)4,20. Die Variable I wurde ausgewählt, um Benazeprilat darzustellen, da es die ACE-Aktivität hemmt.

Null-, Erst-, gemischte und sequentielle Absorptionsstrukturen wurden getestet, um die Arzneimittelabsorption aus dem Depotkompartiment (dh dem Darmlumen) zu modellieren. Es wurde festgestellt, dass ein Modell, das weitgehend der sequentiellen Absorption entspricht, aber kontinuierlich ist, andere Konkurrenzmodelle übertrifft. Diese Modellunterstruktur verwendet eine Reihe von Absorptionen 1. Ordnung, kann jedoch als kontinuierliches Analogon zu einer sequentiellen Absorption 0./1. Ordnung angesehen werden.

In diesem Modell wurde das erste Depotkompartiment für Benazepril nach oraler Verabreichung als 1abs bezeichnet. Die Absorption erster Ordnung erfolgte entweder sofort mit der Geschwindigkeit ka1 in das Kompartiment des frei zirkulierenden Benazeprilats (fr) oder die Absorption wurde um eine Absorptionsrate ka durch ein vorzirkulierendes Zwischenkompartiment (pr) verzögert. Typischerweise wird die Menge an Benazeprilat, die zwischen den Kompartimenten ausgetauscht wird, als Im, n, für Inhibitor bezeichnet, wobei die Indizes m und n jeweils für das Ursprungs- und das Zielkompartiment stehen. Fbio stellt die Gesamtbioverfügbarkeit dar (Gleichung 1). Die Dosen werden in Benazepril-HCl verabreicht, aber als Metabolit Benazeprilat gemessen. Um die Komplexität der Modellierung zu verringern, aber die Absorption und die Varianz bei der Umwandlung von Benazepril in Benazeprilat beizubehalten, wird das gesamte bioverfügbare Benazepril im Modell als Benazeprilat behandelt. Fbio oder die Gesamtbioverfügbarkeit wird im Modell lediglich geschätzt, um diese Varianz beizubehalten und die numerische Instabilität bei der Schätzung zu verringern. Ohne IV-Daten gibt es für die endgültige geschätzte Fbio jedoch keine eindeutige pharmakologische Interpretation.

Zusammenfassend war das endgültige Brustmodell ohne ACE-Bindungskinetik (Gleichung 2) ein 2-Kompartiment-PK-Modell mit unspezifischer Proteinbindung, dargestellt durch ein 3. Kompartiment (Ins), und ein kontinuierliches Analogon zur sequentiellen Absorption 0-/1-Ordnung von etwas Depotfach.

Die Austauschrate zwischen den Kompartimenten wurde durch die Raten kf, g bestimmt, wobei f und g (f ≠ g) entweder freie Zirkulation (fr), Gewebe (ts) oder unspezifisch im Kreislauf gebunden (ns) waren. Der Restfehler lässt sich am besten mithilfe einer normalproportionalen Fehlerfunktion modellieren (Gleichung 6). Die einzige Ausnahme bildeten die Eliminationsraten, die als kCl, d angegeben wurden, wobei Clearance bedeutete, dass der Parameter von der Clearance abgeleitet wurde und d das Ursprungskompartiment war.

Der primäre Wirkmechanismus von Benazeprilat ist die Hemmung von ACE, um die Katalyse von AngI zu AngII zu verhindern. Um diesen Mechanismus zu berücksichtigen, wurde zunächst ein logistisches Sättigungsmodell implementiert. Es wurde jedoch festgestellt, dass das überlegene Modell zur Vorhersage der ACE-Hemmung durch Benazeprilat das differenzielle Michaelis-Menten-Modell der Katalysehemmung ist, wobei ACE das Enzym (E), Benazeprilat der Inhibitor (I), AngI das Substrat (S) und AngII das ist Produkt (P) (Gl. 3). Die Verteilung von ACE im Gewebe (ts) und im freien Kreislauf (fr) wurde ebenfalls berücksichtigt. Die in Gl. verwendete Nomenklatur. (3) steht im Einklang mit früheren Beschreibungen des Michaelis-Menten-Modells26.

Zweikompartiment-Mamillenmodelle bestimmten die Kinetik der Biomarker AngI, AngII und Ang(1–7). Die Menge in diesen Kompartimenten wurde jeweils durch S (Substrat), P (Produkt) und Ang(1–7) dargestellt. Die beiden Kompartimente für diese Angiotensine wurden freie Zirkulation (fr) und Gewebe (ts) genannt. Umwandlungsschritte im klassischen und alternativen RAAS-Weg wurden durch eine Reihe katalytischer Schritte modelliert, wie zuvor beschrieben27.

Schließlich regelt die Funktion fCT(t) den Einfluss der Chronobiologie auf die Produktionsrate des Substrats (rs). fct(t) ist eine skalierte Kosinusfunktion, bei der die Wellenlänge (oder Periode) an 24 Stunden angepasst ist, die relative maximale Amplitude die skalare PRA (Peak-Reninamplitude) ist und die Skala dieser Amplitude durch δ24hr bestimmt wird. Die Chronobiologie wird hier nur in Bezug auf die AngI-Produktion modelliert (Gleichung 4).

Die Katalysen von AngII zu AngIII und AngIII zu AngIV wurden über eine Reihe katalytischer Umwandlungsmodelle modelliert (Gleichung 5). Die Spaltungen von AngII zu AngIII und AngIII zu IV werden hauptsächlich durch die renal gebundenen Aminopeptidasen A bzw. N28,29,30 durchgeführt. Vfree wurde in zwei Verteilungsvolumina im Kreislaufsystem unterteilt; ein kleines Nierenvolumen (Vrn) und ein größeres Plasmavolumen (Vpl). Der gesamte Abbau von AngII zu AngIII und AngIII zu AngIV war mit dem Nierenvolumen verknüpft, da sich dort die Aminopeptidasen A und N physiologisch befinden.

Alle Analytreste wurden am besten durch proportionale Fehlermodelle (Gleichung 6) beschrieben, wobei die Konzentration eines bestimmten Biomarkers durch ε skaliert wurde. ε ist eine Normalverteilung mit der Standardabweichung b, also ε ~ N(0, b).

ANOVA-Tests an Kovariaten zeigten, dass die Modellleistung durch die Einbeziehung von Kovariateneffekten nicht wesentlich verbessert würde. Das vollständige, in Mlxtran geschriebene Modell ist in den Zusatzdateien verfügbar, und ein Modelldiagramm, das die vollständige Struktur detailliert beschreibt, ist in Abb. 3 wiedergegeben. In der S1-Tabelle findet der Leser eine detaillierte Beschreibung aller im Abschnitt „Ergebnisse“ definierten mathematischen Symbole .

Detailliertes Modelldiagramm. Detailliertes Diagramm der endgültigen Modellstruktur. Die Pharmakokinetik von Benazeprilat wurde mithilfe eines 2-Kompartiment-Modells mit einer Mischung aus 1. Ordnung und 1. Ordnung verzögert durch 1. Ordnung Transferabsorption aus dem Depotkompartiment modelliert. Beide Verteilungsvolumina, frei und im Gewebe, wurden mit einer festen Menge an ACE modelliert, auf die Benazeprilat einwirken konnte. Eine unspezifische Bindung wirkte sich auf das Freiverkehrsfach aus. Zur Beschreibung der Umwandlung von Angiotensin I in seine verschiedenen Metaboliten wurde eine Reihe direkter Reaktionsmodelle verwendet. Das freie Verteilungsvolumen wurde für Ang III und Ang IV in Plasma- und Nierenvolumen unterteilt. Ein kinetisches Michaelis-Menten-Modell der Inhibitor-, Substrat- und Enzyminteraktion wurde verwendet, um die kompetitive Hemmung von ACE durch Benazeprilat zu beschreiben. k3 und k-3 waren die Parameter, die die Assoziation und Dissoziation von ACE-Benazeprilat (Enzym-Inhibitor) steuerten, während k1 und k-1 die Geschwindigkeit der Assoziation und Dissoziation von ACE-Angiotensin (Enzym-Substrat) bestimmten. k2 kontrollierte die Produktionsrate von Angiotensin II aus Angiotensin I über ACE. Eine unabhängige Clearance für jeden Metaboliten sowie Benazeprilat kontrollierte die Geschwindigkeit der Entfernung verschiedener Moleküle aus dem Plasma.

Die Untersuchung der SAEM-Suche und eine Sensitivitätsanalyse der anfänglichen Parameterwerte ergaben eine stabile und präzise Suche für alle Parameterschätzungen. Das endgültig ausgewählte Modell wies eine hohe Präzision der über RSE bewerteten Parameterschätzungen auf (die Mehrheit der Schätzungen < 35 %). Eine Zusammenfassung der Modellparameterschätzungen, einschließlich typischer Werte, RSE (%) und interindividueller Variabilität (IIV), finden Sie in Tabelle 1.

Die Untersuchung der zusammenfassenden Darstellungen der Anpassungsgüte (Abb. 4, 5, 6) zeigt, dass die Benazeprilat-Vorhersagen des Modells weitgehend mit experimentellen Messungen übereinstimmen. Wichtig ist, dass das endgültige PKPD-Modell, das die gleichzeitige Anpassung aller Angiotensine ermöglichte, die zeitlich variierenden Veränderungen sowohl des klassischen als auch des alternativen Arms des RAAS zufriedenstellend charakterisierte, wie die Standard-Anpassungsdiagnostik von zeigt Beobachtungen vs. Vorhersagen (Abb. 4), die einzelnen Vorhersagen (Abb. 5) und die simulationsbasierte Validierungsdiagnose (dh NPDEs, Abb. 6).

Beobachtungen vs. Vorhersagen. Die Beobachtungen werden im Vergleich zu den Vorhersagen für alle Metaboliten und Arzneimittelkonzentrationsdaten aufgetragen. Dies ergibt ein vollständiges Bild der Modellleistung. Die goldene Linie ist die LOESS-Kurve, die die Korrelation zwischen Beobachtungen und Vorhersagen zeigt. Die diagonal aufgetragene schwarze Linie stellt eine ideale Modellleistung ohne Fehlspezifikation dar. Die allgemeine Übereinstimmung zwischen LOESS und der idealisierten Kurve weist darauf hin, dass es kaum Fehlspezifikationen in der Modellstruktur gibt.

Beispiel einzelner Vorhersagen. Eine Stichprobe einzelner Beobachtungen im Vergleich zu Vorhersagen, die zufällig aus den Konzentrations- und Metabolitendaten ausgewählt wurden. Die allgemeine Übereinstimmung zwischen dem zeitlichen Verlauf der Plasmakonzentration und den individuellen Vorhersagen zeigt, dass das Modell die Beobachtungen mit hoher Genauigkeit reproduziert.

Normalisierte Vorhersageverteilungsfehler. Normalisierte Vorhersageverteilungsfehler (NPDEs) sind ein Analogon zu Residuen, die zur Diagnose sowohl struktureller Fehlspezifikationen des Modells als auch der Leistung des Residuenfehlermodells verwendet werden. Die Verteilung eines genau spezifizierten Modells ist im Idealfall normal. Bänder stellen das 90 %-Vorhersageband für das 95., 50. bzw. 5. Perzentil dar. Kurven sind die beobachteten Perzentile für das 95., 50. bzw. 5. Perzentil. Die Daten werden in regelmäßigen Abständen gruppiert, um diese durchschnittlichen Trends abzuleiten. Wenn das Strukturmodell für jeden Binning-Bereich gut zu den Daten passt, werden die beobachteten Perzentile symmetrisch über eine 50. Perzentilkurve verteilt, die in das 50. Perzentilband fällt. Wenn das Fehlermodell gut spezifiziert ist, liegen die beobachteten Perzentile innerhalb der Vorhersagebänder. Jede Fehlspezifikation ist im Idealfall zufällig. Das Modell scheint Angiotensin (1–7) für kleine Messwerte leicht zu unterschätzen, ansonsten besteht jedoch eine hohe Übereinstimmung zwischen Modell und Daten.

In dieser Anwendung gibt es drei Hauptansichten (Abb. 7). In allen Ansichten wird der Zeitpunkt der ersten Benazepril-Dosis im 24-Stunden-Format angegeben. Auf der linken Seite der Anwendung befindet sich ein Menü zum Festlegen der Dosierung, Parameter der Simulation und Modalitäten zur Berechnung der Fläche unter der Wirkungskurve (AUEC), die die Wirkung des aktiven Benazeprilats auf das RAAS bei verschiedenen Dosen vs. Placebo-Kontrolle. Beachten Sie, dass das Anwendungsmenü ausgeblendet werden kann, um den Plotbereich zu vergrößern.

Anwendungsansichten. Unsere Anwendung bietet eine benutzerfreundliche Möglichkeit, unser Modell der RAAS-Reaktion auf verschiedene Verabreichungspläne von Benazepril anzuwenden. Ein zusammenklappbares Widget auf der linken Seite ermöglicht es dem Benutzer, die Simulation festzulegen. Die Anwendung verfügt über 3 separate Panels. Im ersten Panel kann ein einzelnes Dosierungsschema auf eine große simulierte Tierpopulation angewendet werden. Anschließend wird die Vorhersageverteilung der simulierten Patientenreaktionen zur Untersuchung aufgezeichnet. Im zweiten Bereich kann der Benutzer einen Vergleich zwischen mehreren vorgeschlagenen Verabreichungsplänen durchführen. Die in diesem Panel erstellten Diagramme zeigen den mittleren Zeitverlauf der verschiedenen Metaboliten als Reaktion auf die vorgeschlagenen Zeitpläne. Der Benutzer hat außerdem Zugriff auf einen X-Achsen-Zoom und AUC-Vergleichszusammenfassungen auf der rechten Seite. Das letzte Panel besteht lediglich aus einer Dokumentation des Simulations-Engine-Codes und Tipps zur Verwendung.

Das Menü auf der linken Seite ist in drei Registerkarten unterteilt, die es dem Benutzer ermöglichen, Parameter der Simulation zu definieren. Auf der Registerkarte „Dosierung“ kann der Benutzer den Dosierungsplan hinsichtlich des Zeitpunkts der ersten Dosis, der Anzahl der Dosen, der Dosierungsgröße und des Intervalls zwischen den Dosen definieren. Über die Registerkarte „Simulationsparameter“ erhält der Benutzer Zugriff auf die Zeitskala der Simulation, die Feinheit des für die Simulation verwendeten Rasters und die Stichprobengröße, die zur Berechnung des Medians und der Vorhersageintervalle der simulierten PKPD verwendet wird. Schließlich bietet die Registerkarte „AUEC“ die Möglichkeit, pharmakodynamische Wirkungen zwischen konkurrierenden Dosierungsszenarien zu vergleichen, indem ein Zeitraum definiert wird, für den AUEC-Schätzungen berechnet werden.

Die erste Registerkarte bietet dem Benutzer Tools zur Analyse der Verteilung der Reaktionen nach einer einzigen Benazepril-Behandlung. Die Verteilung wird anhand des Medianeffekts (blaue Linie), des Medianeffekts von Placebo bei Verwendung derselben simulierten Personen (gestrichelte schwarze Linie) und des 90 %-Vorhersageintervalls (blaue Bänder) in Schritten von 10 %, d. h. 5 % bis 95 %, angegeben. 15 % bis 85 % usw. Die AUEC der Behandlung vs. Placebo kann für die Zeitspanne zwischen den gestrichelten vertikalen Linien verglichen werden. Der prozentuale Unterschied zwischen diesen beiden AUECs wird in der schwebenden Beschriftung dokumentiert.

Das zweite Panel ermöglicht dem Benutzer den Vergleich von bis zu vier Dosierungsschemata von Wettbewerbern mit Placebo. In diesem Bereich kann der Benutzer die mittlere Reaktion (Schlüssel unten) und den Placeboeffekt (gestrichelte schwarze Linie) sehen, jedoch nicht die Verteilung der Antworten. Auf der rechten Seite der Seite kann der Benutzer den prozentualen Unterschied zu Placebo bei den in dieser Studie modellierten RAAS-Komponenten vergleichen, indem er durch die verschiedenen Datentabellen blättert. Bei diesen Vergleichen handelt es sich um Prozentsätze relativ zu Placebo.

Bei der letzten Ansicht handelt es sich lediglich um eine Dokumentation des Modells, das die Simulations-Engine antreibt, sowie allgemeine Empfehlungen zur Verwendung der Software. Es bietet außerdem eine kurze Zusammenfassung des Anwendungsdesigns und eine vollständige Reproduktion des R-Codes, aus dem das Modell besteht. In dieser Ansicht bietet das Anwendungsmenü auch eine kurze Zusammenfassung der Benutzerwarnungen.

Als letzte Überlegung in unserer Studie haben wir vier Dosierungsszenarien in unserer Simulationsmaschine direkt verglichen: 0,25 mg/kg alle 24 Stunden in der Morgensonne, 0,25 mg/kg alle 24 Stunden in der Nachmittagssonne, 0,25 mg/kg alle 12 Stunden und 0,5 mg/kg alle 12 Stunden. In unserer Simulationsanwendung haben wir die Engine so eingestellt, dass sie die mittlere AUEC von 500 Hunden (abgeglichen zwischen virtuellen Versuchen) mit einer Stichprobenrate von 500 Mal über einen Zeitraum von 25 virtuellen Tagen vergleicht. Der mittlere AUEC-Vergleich wurde am 20. Tag über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführt. Die lange virtuelle Simulationszeit stellte sicher, dass die simulierten Hunde den Steady-State-PD von Benazeprilat erreichten. Bei 0,25 mg/kg alle 24 Stunden konnten wir unabhängig vom Dosierungszeitpunkt im Vergleich zu Placebo einen Rückgang von AngII um etwa 55 % und einen Anstieg von Ang(1–7) um 95 % feststellen. Bei einem Behandlungsplan von 0,5 mg/kg alle 12 Stunden sahen wir im Vergleich zu Placebo einen Rückgang von AngII um etwa 80 % und einen Anstieg von Ang(1–7) um 135 %. Insgesamt wurde bei der Dosierung alle 24 Stunden (im Vergleich zur Dosierung alle 12 Stunden) eine größere tägliche Biomarker-Varianz beobachtet. Die zusammenfassenden Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt, während die mittleren Zeitverläufe in Abb. 8 dargestellt sind.

Zusammenfassung der Simulation. In diesem Simulationsszenario werden vier Verabreichungspläne verglichen: (1) 0,25 mg/kg alle 24 Stunden um 8 Uhr morgens; (2) 0,25 mg/kg alle 24 Stunden um 20 Uhr; (3) 0,25 mg/kg zweimal täglich um 8 Uhr und 20 Uhr; (4) 0,5 mg/kg zweimal täglich um 8 Uhr und 20 Uhr. Für jedes Szenario wurden 500 Personen simuliert (insgesamt 2500 Personen, mit Placebo). Kurven sind der mittlere zeitliche Verlauf des Moleküls aus dieser simulierten Population. Vergleiche zwischen Zeitplänen werden durchgeführt, indem der prozentuale Unterschied zwischen der mittleren AUC und dem Placebo (jeder Zeitplan) berechnet wird. Die zusammenfassenden Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Sowohl bei Hunden als auch beim Menschen spielt die klassische RAAS-Überaktivierung eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese und Entwicklung von CHF4. Um die klassische RAAS-Überaktivierung bei CHF zu modulieren, gibt es in beiden Spezies eine lange Tradition der Verwendung von ACE-Hemmern wie Benazepril1,2,3. Die Verbesserung unseres Verständnisses der Wirkung von ACEi auf CHF bei Hunden hat das Potenzial, die therapeutische Behandlung von CHF beim Menschen zu verbessern und umgekehrt4. Die Aktivierung des alternativen RAAS-Signalwegs ist durch die Katalyse von AngII zu Ang(1–7) durch das Enzym ACE2 gekennzeichnet. Ang(1–7) wiederum aktiviert Mas-Rezeptoren (Esteban PloS One 2009). Im direkten Gegensatz zur Auswirkung einer Überaktivierung des klassischen Signalwegs auf CHF ist die Aktivierung des alternativen Signalwegs mit verbesserten klinischen Ergebnissen über eine verringerte und erhaltene Ejektionsfraktion und ein verringertes Risiko einer Herzinsuffizienz verbunden.

Ein ideales Therapeutikum für CHF würde sowohl den klassischen als auch den alternativen RAAS-Signalweg modulieren und die Aktivität des klassischen RAAS-Signalwegs herunterregulieren, während der alternative RAAS-Signalweg erhalten bleibt oder hochreguliert wird13. Obwohl die Wirkung von ACEi auf die ACE-Aktivität und AngII sowohl in der Veterinär- als auch in der Humanliteratur recht gut charakterisiert wurde, ist wenig über die Wirkung von ACEi auf den alternativen Arm des RAAS bekannt. Daher hängt jede weitere Dosisoptimierung von ACEi von der Untersuchung der Wirkung dieses therapeutischen Arzneimittels auf dem alternativen Weg ab. Die Charakterisierung dieses Effekts bei Hunden erweitert wesentlich unser Verständnis darüber, wie die therapeutische Behandlung von CHF bei Hunden optimiert werden kann, und liefert gleichzeitig wertvolle Einblicke in die molekularen Wirkungen von ACEi für die Übertragung auf CHF beim Menschen31.

Darüber hinaus ist der empfohlene Dosierungsbereich für Benazepril bei Menschen und Hunden recht breit und es besteht kein klarer Konsens über die ideale Dosis bei Patienten mit CHF. PKPD-Studien zum Vergleich verschiedener Benazepril-Dosen bei gesunden Hunden haben keine einheitlichen Empfehlungen geliefert. Bei King et al. Eine einzelne orale Dosis Benazepril unterdrückte die ACE-Aktivität wirksam für bis zu 24 Stunden und die ACE-Hemmung im Plasma war unabhängig von einer Dosierung ≥ 0,25 mg/kg17. Eine anschließende erneute Analyse dieser Daten mittels PK-Modellierung deutete darauf hin, dass eine Dosierung alle 12 Stunden eine stärkere Hemmung von ACE bei gleicher Gesamtdosis alle 24 Stunden bewirken würde20. Später stellten Hamlin und Nakayama fest, dass eine Einzeldosis Benazepril mit 0,5 mg/kg ACE < 12 Stunden lang unterdrückte21. Schließlich deutete eine kürzlich durchgeführte retrospektive Studie an Hunden mit Herzklappenerkrankungen auf verbesserte Ergebnisse bei einer Dosierung alle 12 Stunden hin22.

In dieser Studie haben wir versucht, Wissenslücken bei der optimalen Benazepril-Dosierung zu schließen, indem wir die dosisabhängigen Auswirkungen von Benazepril auf Biomarker sowohl des klassischen als auch des alternativen RAAS-Signalwegs bei Hunden beschrieben haben. Die Lösung, die wir implementiert haben, um diese Wissenslücken zu schließen, bestand darin, eine Modellierungs- und Simulationsplattform für die Wirkung von Benazepril auf beide Arme des RAAS aufzubauen. Diese Simulations-Engine ermöglicht die Untersuchung von Benazepril-Dosierungen, die sowohl eine erhebliche Herunterregulierung des klassischen RAAS bewirken, als auch das alternative RAAS erhalten oder hochregulieren. Dies ermöglicht den direkten Vergleich mehrerer Dosierungsschemata mithilfe virtueller klinischer Studien und letztendlich die Optimierung des klinischen Nutzens.

Zur Bewertung der Modellleistung wurden mehrere Metriken verwendet. Diagnostische Darstellungen der Anpassungsgüte auf Populationsebene wie Beobachtungen vs. Vorhersagen und NPDEs zeigten, dass die strukturelle Fehlspezifikation sehr gering war. Wenn wir uns auf individuelle Vorhersagen konzentrieren, sehen wir ein dynamisches Modell, das in der Lage ist, komplexe individuelle Variationen anzupassen, ohne übermäßig an Rauschen und falsche Trends in den Daten angepasst zu sein. Wichtig ist, dass unsere Präzision der Parameterschätzungen für einen so großen Parametersatz sehr hoch war. Um diese Präzision zu erreichen, mussten einige Parameter auf explorative Werte festgelegt werden. Dies ist jedoch ein erwartetes Ergebnis bei der Verwendung von Enzymkinematikmodellen. Obwohl die Präzision dieser Parameter hoch war, sollten sie ohne experimentelle Überprüfung nicht übermäßig interpretiert werden.

Mit unserer Simulationsmaschine haben wir uns entschieden, mehrere sinnvolle Dosierungspläne zu vergleichen, darunter 0,25 mg/kg PO alle 24 Stunden und 0,5 mg/kg PO alle 12 Stunden – und decken damit den Bereich der in der EU und den USA am häufigsten verwendeten Dosierungspläne ab. Vergleiche zwischen den Dosierungsplänen wurden basierend auf der Fläche unter der Wirkungskurve der Biomarker-Reaktion (AUEC) im Vergleich zu Placebo durchgeführt.

Die Chronobiologie spielte in dieser Studie eine bescheidene Rolle bei der Planung von Benazepril. Während die Simulations-Engine zur Untersuchung verschiedener Dosierungen verwendet wird, scheint die Abenddosierung die geringste Varianz beim klassischen RAAS zu erzeugen, während die Morgendosierung die geringste Varianz bei AngIII- und AngIV-PD zu erzeugen scheint. Die morgendliche und abendliche Verabreichung führt im gesamten Biomarker-Panel zu derselben relativen AUC-Verbesserung gegenüber Placebo.

Von den verglichenen Zeitplänen wurde die stärkste Herunterregulierung klassischer RAAS-Biomarker und Hochregulierung alternativer RAAS-Biomarker bei der Benazepril-Dosis von 0,5 mg/kg p.o. alle 12 Stunden beobachtet. Dies sollte jedoch in einen Zusammenhang gebracht werden, da die Verbesserung von 0,5 mg/kg alle 12 Stunden gegenüber 0,25 mg/kg alle 12 Stunden 12,5 %, 13,3 %, 14,2 %, 13,1 % und 14,3 % für Ang(1–7), AngI(1–) beträgt. 10), AngII(2–8), AngIII bzw. AngIV. Diese jeweiligen Änderungen der Konzentrationen klassischer und alternativer RAAS-Biomarker müssen mit klinischen Ergebnissen verknüpft werden, um eine klinische Dosierungsauswahl treffen zu können.

Ein interessantes Ergebnis unserer Simulationen ist, dass im Allgemeinen eine hohe Übereinstimmung zwischen der Dosierung von Benazepril alle 24 Stunden und alle 12 Stunden besteht, solange die Gesamtdosis pro Tag konstant gehalten wird. Beispielsweise erzeugen 0,5 mg/kg alle 24 Stunden und 0,25 mg/kg alle 12 Stunden ähnliche pharmakodynamische Wirkungen auf das RAAS, obwohl die Dosierung alle 12 Stunden im Vergleich zur Dosierung alle 24 Stunden zu geringeren Schwankungen der Angiotensinen im Plasma führte. Bemerkenswert ist, dass, obwohl bei menschlichen Patienten über geschlechtsspezifische Unterschiede bei Herzinsuffizienz-Biomarkern berichtet wurde32, unsere experimentelle Studie keine signifikanten Unterschiede in der RAAS-Pharmakodynamik zwischen männlichen und weiblichen Hunden nachweisen konnte. Dies sollte jedoch angesichts der geringen Stichprobengröße in unserer Studie mit Vorsicht interpretiert werden.

Nach bestem Wissen der Autoren handelt es sich hierbei um die Erstbeschreibung einer Simulationsmaschine zur Optimierung der Dosierung therapeutischer Arzneimittel in der Veterinärmedizin. Obwohl für die Anwendung am Krankenbett eine experimentelle Validierung erforderlich ist, eignet sich die Modellstruktur problemlos für eine solche Validierung. Viele Parameter sind direkt messbar, da sie aussagekräftige pharmakologische Interpretationen haben. Beispielsweise könnten die kinetischen Michaelis-Menten-Parameter, die die ACE-Hemmung steuern, möglicherweise unabhängig voneinander gemessen werden – möglicherweise in vitro. Darüber hinaus kann die Kinetik jedes einzelnen Moleküls in IV-PK-Zeitverlaufsstudien in vivo separat gemessen werden. Darüber hinaus kann dieses Modell durch die Verwendung einer Kombination aus In-vitro-Studien zur Definition enzymkinematischer Parameter, In-vivo-Studien zur Kinetik einzelner Metaboliten, Literaturwerten für Basisparameter und allometrischer Skalierung von Parametern des Brustkompartiments problemlos in ein bettseitiges Tool umgewandelt werden Hunde und Menschen. Dabei müssten andere physiologische Variablen wie Geschlecht und ethnische Zugehörigkeit berücksichtigt werden, die wichtige Kovariaten des Behandlungsansprechens auf ACEi bei menschlichen Patienten mit CHF sind33,34. Eine weitere wichtige Variable, die bei dem Versuch, unser Modell auf den Menschen zu übertragen, einbezogen werden muss, ist die Tatsache, dass viele endogene Peptide sowie Albumin bekanntermaßen die ACE-Aktivität in vivo unterdrücken35,36. Tatsächlich deuten frühe Berichte von Ryan et al.37 darauf hin, dass viele endogene kleine Moleküle (< 10 kDa) bereits erheblich zur ACE-Hemmung beitragen würden. Ob diese Beobachtungen auch bei Hunden zutreffen, bleibt abzuwarten. Interessanterweise wurde jedoch auch über eine endogene ACE-Hemmung in Seren von Eseln, Ziegen und Rindern berichtet35.

In dieser Studie gibt es mehrere praktische Einschränkungen, die als Leitfaden für zukünftige Modellverfeinerungen anerkannt werden sollten. Erstens wurden unsere Ergebnisse aus einem experimentellen Modell der RAAS-Aktivierung als Reaktion auf eine Einzeldosis Benazepril abgeleitet und nicht aus einer wiederholten Gabe in einer klinischen Studie mit Hunde-CHF-Patienten. Außerdem war die Stichprobengröße der Studie im Vergleich zu einem ausgereiften klinischen Studiendesign recht begrenzt. Folglich berücksichtigt unsere Simulationsmaschine nicht mehrere physiologische Faktoren, die potenziell die Wirkung von Benazepril in einer Patientenpopulation beeinflussen könnten, wie etwa die Auswirkungen von Alter, Rasse und anderen Begleitmedikamenten, die bekanntermaßen das RAAS modulieren, wie etwa Furosemid38 und Spironolacton39. Diese Informationen werden in einer prospektiven klinischen Studie an Hundepatienten mit CHF bereitgestellt, um unsere modellbasierten Vorhersagen anzupassen. Schließlich wurde das therapeutische Fenster bei Vergleichen zwischen Dosierungsplänen nicht berücksichtigt. Insbesondere gibt es hohe Dosen von Benazepril, die der Benutzer in unserer Simulationsmaschine angeben kann (max. 2 mg/kg alle 6 Stunden), die nicht experimentell getestet wurden; obwohl in früheren Studien eine Sicherheit von bis zu 1 mg/kg alle 24 Stunden nachgewiesen wurde22.

Dieses umfangreiche QSP-Modell des RAAS als Reaktion auf Benazepril und die Entwicklung dieses Modells zu einem Instrument zur Optimierung von Benazepril am Krankenbett bei CHF und ähnlichen Krankheiten ist höchst neuartig. Durch die Entwicklung einer benutzerfreundlichen Simulationsschnittstelle für unser Modell sind wir nun in der Lage, eine erste Vorhersage der optimalen Dosis/Zeit der Benazepril-Verabreichung bei Hunden zu treffen, um zukünftige Untersuchungen bei Patienten mit CHF zu unterstützen. Über die in diesem Manuskript mit unserem Tool vorgestellte Forschung hinaus können Simulationswerkzeuge die Wirkung wissenschaftlicher Forschung kontinuierlich erweitern, indem sie zum Testen neuer Hypothesen zur Dosisoptimierung verwendet werden und verbessert werden, wenn neue Daten zur Verfeinerung von Parameterschätzungen verfügbar werden. Die Daten, die wir in einem experimentellen Modell der RAAS-Aktivierung gemessen haben, müssen noch direkt mit den klinischen Ergebnissen bei CHF verknüpft werden, daher besteht die Möglichkeit, das Modell mit einer Verknüpfungsfunktion auf Krankheitsergebnisse auszudehnen. Dies ist für die endgültige Anwendung bei der Dosierungsauswahl erforderlich. Die wichtigste Erweiterung besteht darin, eine relevante Auswahl von Simulationen experimentell zu validieren; Diese Option wird derzeit geprüft. Dieser modellbasierte Ansatz unterstützt nun das Design einer bevorstehenden prospektiven multizentrischen klinischen Studie an Hundepatienten mit CHF, um die Ergebnisse unseres Simulators zu bestätigen und unsere modellbasierten Vorhersagen mit tatsächlichen klinischen Informationen zu verfeinern. Diese klinische Studie wird dazu beitragen, zu bestätigen, ob sich der beobachtete Unterschied bei der PKPD zwischen verschiedenen Dosierungen in klinischen Vorteilen bei Hunden mit natürlich vorkommender CHF niederschlägt.

Die experimentellen Verfahren wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften der Iowa State University durchgeführt. Die Studie wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Iowa State University gemäß Protokoll 19-344 genehmigt. Bei der Fertigstellung dieser Studie hielten sich die Autoren an die ARRIVE-Richtlinien.

Neun speziell gezüchtete Laborbeagles (5 kastrierte Männchen und 4 kastrierte Weibchen), 40–42 Monate alt, mit einem Gewicht von 9,0–13,5 kg, wurden basierend auf Körpergewicht und Geschlecht randomisiert in drei orale Dosierungsgruppen von Benazepril eingeteilt. Die systemische und kardiovaskuläre Gesundheit aller Hunde wurde vor der Studie durch körperliche Untersuchung, routinemäßige Laboruntersuchungen (großes Blutbild, biochemische Serumanalyse), Blutdruckmessung und Echokardiographie bestätigt.

Die Studienhunde wurden in der Abteilung „Laboratory Animal Resources“ am Iowa State University College of Veterinary Medicine untergebracht. Vor dem Experiment wurden die Hunde > 1 Monat lang an die Einrichtung gewöhnt. Die Hunde wurden paarweise in angrenzenden Ställen (ungefähr 2 m2 pro Hund oder 4 m2 pro Paar) auf erhöhtem, gummibeschichtetem Gitterboden untergebracht. Die Haltungsbedingungen wurden mit einer Umgebungstemperatur von 18 °C, einem 12-stündigen Lichtzyklus (07:00 bis 19:00 Uhr) und Zugang zu Wasser nach Belieben standardisiert. Nur an intensiven Probenahmetagen (D1, D18 und D35) wurden die Hunde in einzelne Wohneinheiten aufgeteilt und der Wasserverbrauch wurde alle 8 Stunden für den Zeitraum von 24 Stunden quantifiziert.

Nach der Probenentnahme an den Probenahmetagen (D-5, D12 und D29) wurde den Hunden 5 Tage lang um 23:00 Uhr alle 24 Stunden eine natriumarme Diät (Hill's Prescription Diet h/d, 17 mg Natrium pro 100 kcal) angeboten eine stetige Aktivierung von RAAS erreichen4,23,24. Nach der Datenerfassung zu D2, D35 und D36 begann bei den Hunden eine 10-tägige Auswaschphase zwischen den Zyklen, in der ihnen alle 24 Stunden um 09:00 Uhr ihre Standardnahrung (Royal Canin Beagle Adult, 110 mg Natrium pro 100 kcal) angeboten wurde. Die Menge an natriumarmer Nahrung wurde so berechnet, dass die Hunde während der gesamten Studie die gleiche Kalorienaufnahme erhielten.

Diese 35-tägige prospektive Studie wurde in drei Zeiträume mit drei verschiedenen Benazepril-Dosierungsgruppen unterteilt: (A) 0,125 mg/kg alle 12 Stunden p.o., (B) 0,25 mg/kg alle 12 Stunden p.o. und (C) 0,5 mg/kg alle 24 Stunden p.o. Alle Hunde erhielten alle Behandlungen im partiellen Crossover-Design (ABC/BCA/CAB). Die Hunde wurden zu jedem Zeitpunkt in der gleichen Reihenfolge beprobt und der genaue Zeitpunkt der Probenahme wurde aufgezeichnet. Die Blutprobenentnahme wurde in Tage der Probenahme zu Beginn (D-5, D12 und D29), Tage mit spärlicher Probenahme (Tage 0, 17 und 34) und Tage mit intensiver Probenahme (D1, D18 und D35) unterteilt. Die Basislinien- und spärliche Probenahme erfolgte um 07:00 Uhr.

An intensiven Probenahmetagen (D1, D18 und D35) wurde die Blutentnahme ab 07:00 Uhr (0 Stunden, unmittelbar vor der oralen Benazepril-Gabe) durchgeführt und bei +0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 12,5, 13 wiederholt , 14, 16, 20 und 24 Stunden nach der Dosierung. Benazepril (NELIO® 5 mg Kautabletten, Ceva Sante Animale) wurde an intensiven Probenahmetagen nach der 0-stündigen Blutentnahme (alle Dosisgruppen) und der 12-stündigen Blutentnahme (nur alle 12-Stunden-Dosisgruppen) verabreicht. Die Benazepril-Dosis wurde auf 1,25-mg-Schritte genau berechnet.

Venöse Blutproben wurden aus einer äußeren Hals- oder Kopfvene mit einer 1-Zoll-Nadel der Größe 20 oder 22 entnommen, die an einer 6-ml-Spritze angebracht war. Die Hunde wurden während der Blutentnahme in derselben Position (sitzend mit ausgestrecktem Hals) gehalten und gehalten. An intensiven Probenahmetagen wurden zu jedem Zeitpunkt etwa 4 ml Vollblut gesammelt, wobei 2 ml in ein Sammelröhrchen ohne Zusatzstoffe und 2 ml in ein Lithium-Heparin-Röhrchen mit 11,2 µl Dichlorvos, zubereitet als 6 mg/ml-Lösung, überführt wurden in Acetonitril. An den Basistagen wurden etwa 6 ml Vollblut gesammelt, wobei 2 ml in ein zusatzfreies Röhrchen für die RAAS-Analyse, 2 ml in ein EDTA-Röhrchen für das vollständige Blutbild und 2 ml in ein zusatzfreies Röhrchen für Serum gegeben wurden Chemie-Panel. An Tagen mit geringer Probenahme wurden 2 ml Blut gesammelt und in ein Röhrchen ohne Zusatzstoffe gegeben. Alle für die pharmakokinetische oder RAAS-Analyse vorgesehenen Proben wurden 15 Minuten lang zentrifugiert. Anschließend wurde Plasma oder Serum in Kryoröhrchen überführt, die dann zur späteren Analyse bei –80 °C gelagert wurden. Proben für ein komplettes Blutbild oder Serumchemie-Panels wurden vom Iowa State Clinical Pathology Laboratory analysiert.

Die Plasma-Benazeprilat-Analyse wurde vom Analytical Chemistry Laboratory der Iowa State University durchgeführt. Die Analysestandards Benazeprilat und Benazeprilat-d5 wurden von Toronto Research Chemicals (Ontario, Kanada) bezogen. Die Analysestandards Benazepril und Benazepril-d5 wurden von Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan, USA) bezogen. Benazeprilat- und Benazeprilat-d5-Stammstandardlösungen wurden mit 0,25 mg/ml in 2:1:1 Acetonitril:Wasser:DMSO hergestellt. Die Stammlösungen von Benazepril und Benazepril-d5 wurden mit 1 mg/ml in Acetonitril hergestellt. Kontroll-Beagle-Plasma wurde von Equitech Bio (Kerrville, TX, USA) gekauft. Alle für die Probenvorbereitung und den Chromatographieteil der Analysemethode verwendeten Lösungsmittel wurden von Fisher Scientific (Waltham MA, USA) bezogen.

Ein Probenvolumen von 150 µL wurde mit 15 µL einer Benazeprilat-d5-Lösung mit 0,1 ppm angereichert. Plasmaproben wurden mit 600 µL Acetonitril mit 0,5 % Ameisensäure präzipitiert und mehrere Sekunden lang von Hand verwirbelt. Alle Proben wurden 5 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert. Ein 600-µL-Volumen jeder Probe wurde in ein sauberes 2-ml-Flip-Top-Röhrchen überführt. Alle Flip-Top-Röhrchen wurden in das CentriVap Concentrator-System (Labconco Corp., Kansas City, MO, USA) gegeben und zur Trockne konzentriert. Alle Proben wurden in 100 µL 50:50 Acetonitril:Wasser rekonstituiert und vor der LC-MS/MS-Analyse 5 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert. Alle Proben wurden mit einem Injektionsvolumen von 2 µL analysiert.

Für die Analyse wurde eine Vanquish Flex LC-Pumpe mit Schnittstelle zu einem TSQ Altis-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA) verwendet. Die Quellenbedingungen waren wie folgt: Sprühspannung – 3500 V, Hüllgas – 40,6 Arb, Hilfsgas – 23 Arb, Spülgas – 0,4 Arb, Ionentransferrohrtemperatur – 325 °C und Verdampfertemperatur – 350 °C. Die Gesamtlaufzeit der Methode betrug 3 Minuten. Die Auflösung von Q1 und Q3 betrug 0,7 FWHM. Das CID-Gas wurde auf 2 mTorr eingestellt. Die chromatographische Peakbreite betrug 2 s. und die Zykluszeit betrug 0,2 s. Das Massenspektrometer wurde im Positivionen-Elektrospray-Ionisationsmodus betrieben. Die Daten wurden mithilfe einer MRM-Methode (Multiple Reaction Monitoring) erfasst, bei der die Vorläuferionen Benazeprilat ([M+H]+ 397,2) und Benazeprilat-d5 ([M+H]+ 402,2) selektiert wurden.

Die für die Analyse verwendete Säule war Hypersilgold Aq 50 × 2,1 mm, 1,9 µm (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Die mobile Phase A war Wasser + 0,1 % Ameisensäure und die mobile Phase B war Acetonitril + 0,1 % Ameisensäure. Die Temperatur des Säulenofens wurde auf 35 °C eingestellt. Der Chromatographiegradient war wie folgt: Start bei 0 % B und linearer Anstieg auf 100 % B in 2,0 Min., Halten bei 100 % B für 0,4 Min., Absinken auf 0 % B in 0,01 Min. und Halten bei 0 % B für 0,59 Min . Die Flussrate der Methode betrug 0,4 ml/min.

Die Gleichgewichtskonzentrationen von Ang I, Ang II, Ang III, Ang IV, Ang 1–9, Ang 1–7 und Ang 1–5 wurden in Serumproben durch Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie/Massenspektroskopie in einem kommerziellen Labor quantifiziert ( Attoquant Diagnostics, Wien, Österreich), wie zuvor beschrieben4,40. Kurz gesagt, die Proben wurden nach der Ex-vivo-Äquilibrierung mit einem mit stabilen Isotopen markierten internen Standard für jedes Angiotensin versetzt und die Analyten wurden mithilfe einer C18-basierten Festphasenextraktion extrahiert. Extraktproben wurden mittels Massenspektrometrieanalyse unter Verwendung einer umgekehrten analytischen Säule (Acquity UPLC C18, Waters) analysiert, die im Einklang mit einem XEVO TQ-S-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (Waters Xevo TQ/S, Milford, MA) im Mehrfachreaktionsüberwachungsmodus betrieben wurde . Interne Standards wurden verwendet, um die Analytwiederfindung während des gesamten Probenvorbereitungsverfahrens in jeder einzelnen Probe zu korrigieren. Die Analytkonzentrationen wurden aus integrierten Chromatogrammen unter Berücksichtigung der entsprechenden Reaktionsfaktoren berechnet, die in entsprechenden Kalibrierungskurven in der Serummatrix ermittelt wurden, wenn die integrierten Signale ein Signal-Rausch-Verhältnis von 10 überstiegen. Die unteren Quantifizierungsgrenzen für die Analyten im Hundeserum lagen bei 3 pmol/ L (Ang I), 2 pmol/L (Ang II), 2,5 pmol/L (Ang III), 2 pmol/L (Ang IV), 2,5 pmol/L (Ang 1–7) und 2 pmol/L (Ang 1–5) bzw. 41,42.

Pharmakokinetische und pharmakodynamische Daten wurden zur Modellvorbereitung in R 4.0.243 importiert. Um die Konsistenz zwischen Verabreichungs- und Messeinheiten zu gewährleisten, wurden alle Konzentrationsdaten in Mikromol pro Liter umgerechnet. Die Molekulargewichte von Benazepril HCl und Benazeprilat wurden von PubChem44,45 erhalten.

Anstelle einer Placebogruppe wurden historische Kontrolldaten aus einer früheren Studie verwendet23. Nach der Referenzierung der Parameter auf diese Basislinie während der Anpassung entsprachen alle generierten Placebo-Simulationsreaktionen der chronobiologischen Basisfunktion mit Parametern, die aus der gleichzeitigen Modellierung aller Biomarker-Reaktionen geschätzt wurden.

Die aufgezeichneten Daten (yij) wurden in Monolix 20120 R1 (Lixoft, Frankreich) importiert und zur Schätzung von Populationsparametern (μ) und Varianz über den stochastischen Approximationserwartungsmaximierungsalgorithmus (SAEM)46 verwendet. Einzelne Parameter (ϕi) wurden über die Modi der einzelnen hinteren Verteilungen bestimmt, die mithilfe eines Markov-Chain-Monte-Carlo-Verfahrens (MCMC) geschätzt wurden. NLME-Modelle wurden wie zuvor beschrieben geschrieben (Gleichung 7)47,48.

Modellvorhersagen (F(ϕi, βi, tij)) für das i-te Individuum zum j-ten Zeitpunkt – Zeitpunkt (tij) – wurden unter Verwendung individueller Parameter und individueller Kovariaten (βi) parametrisiert. Die Residuen wurden als G(ϕi, tij) · εij modelliert, wobei G eine arithmetische Kombination aus proportionalen und additiven Fehlerverteilungen ist.

Einzelne Parameter wurden als Funktion der Populationsparameter, der interindividuellen Variabilität (ηi) und einzelner Kovariaten über die interindividuelle Variationsfunktion h(μ, ηi, βi) modelliert. Die individuelle Variabilität wurde mit einer Normalverteilung des Mittelwerts 0, der Varianz-Kovarianz-Matrix Ω und der Varianz ω2 modelliert. Typischerweise ist h(μ, ηi, βi) eine Log-Normal-Link-Funktion (Gleichung 8) oder eine Logit-Normal-Link-Funktion (Gleichung 9) in den Fällen, in denen ϕi auf einen Wert zwischen 0 und 1 beschränkt ist.

Das Systempharmakologiemodell wurde in zwei aufeinanderfolgenden Phasen erstellt. Zunächst wurde ein weitgehend empirisches PKPD-Modell mit minimaler Parametrisierung erstellt, um grundlegende biologische Variationen in den Daten zu erfassen. In der Praxis erforderte dies die Anpassung eines grundlegenden 1-, 2- oder 3-Kompartiment-Modells an die Pharmakokinetik von Benazeprilat und die anschließende Verknüpfung der PK mit den RAAS-Biomarkerkonzentrationen über verschiedene indirekte und direkte Reaktionsmodelle. Wann immer möglich, haben wir uns für Modelle mit direkten statt indirekten Effekten und weniger Kompartimente entschieden, um die Anzahl der gesamten geschätzten Parameter während der Modellanpassung zu reduzieren.

Anschließend wurden Modellkomponenten iterativ durch mechanistischere Strukturen ersetzt. Zu diesem Zweck haben wir die Peptidkaskade modelliert, die die alternativen und klassischen RAAS-Wege definiert. Wir haben auch getestet, ob wir das mathematische Modell erweitern können, um wichtige biologische Systeme wie die Clearance von Angiotensinen über die Leber vs. Nieren, unspezifische Plasmabindung, First-Pass-Metabolismus und ortsspezifischen Metabolismus einzubeziehen. Einige Komponenten und Parameter der Modellstruktur wurden willkürlich auf Literatur- oder Forschungswerte festgelegt, um die Genauigkeit relevanter biologischer Systeme zu wahren. Beispielsweise wurden unsere Modellgleichungen so umgeschrieben, dass die Produktion von AngII immer eins zu eins proportional zur Katalyse von AngI durch das Angiotensin-Converting-Enzym war. Das endgültige Modell wurde durch verschiedene arithmetische Vereinfachungen und Parametersuchoptimierungen verfeinert, um die Präzision der Parameterschätzungen so weit wie möglich zu verbessern, ohne die Anpassung an experimentelle Daten zu beeinträchtigen. Die Bedeutung von Körpergewicht, Geschlecht, Natriumaufnahme und Benazepril-Dosis für Parameterschätzungen wurde mithilfe des automatisierten Pearson-Korrelationstests und der ANOVA-Methode, wie sie in Monolix 2020 R1 implementiert sind, weiter bewertet.

Experimentelle Daten wurden zusammengestellt und zur Datenexploration, Modellentwicklung und Bewertung in die 2020R1 Monolix Suite importiert. Die Qualität der Anpassung wurde mithilfe von Standarddiagnosen für die Anpassungsgüte (z. B. beobachtet vs. Vorhersagen, Streudiagramm der Residuen) sowie anhand numerischer Zusammenfassungen der Anpassung, wie z. B. der korrigierten Bayes'schen Informationskriterien (BICc), bewertet. Die Präzision der Parameterschätzungen wurde anhand des Reststandardfehlers (RSE%) bestimmt.

Normalisierte Vorhersageverteilungsfehler (NPDEs) werden zur Bewertung von Modellfehlspezifikationen empfohlen, wenn das Studiendesign hinsichtlich der Dosierungsgruppen heterogen ist49. In dieser Studie hatten wir mehrere verschiedene Studiengruppen mit unterschiedlichen Dosierungsplänen; Daher wurden NPDEs zur Bestimmung der Anpassungsqualität im Vergleich zu konventionelleren visuellen Vorhersageprüfungen ausgewählt. In der Praxis bewerten NPDEs den Prozentsatz der Vorhersageverteilung bei jeder mittleren Vorhersage unter der Beobachtung und bilden so eine heterogene Gleichverteilung. Daher wird auf jeden Wert eine inverse kumulative Verteilungsfunktion angewendet, um eine Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion im Vergleich zur Populationsvorhersage zu erhalten.

Die gesamte für die Simulationsanwendung relevante Programmierung wurde in R v4.0.243 geschrieben. Die Modelle wurden von Mlxtran (Monolix Suite 2020R1) in die domänenspezifische Sprache und das R-Paket Odin v1.2.150 übersetzt, um klinische Studien zu simulieren. Odin bietet eine Schnittstelle für die ODE-Solver und R-Pakete deSolve v1.3051 und dde v1.0.152. Odin wurde aufgrund seiner überlegenen Fähigkeit, große ODE-Systeme zu lösen, gegenüber anderen R-Paketen verwendet.

Schließlich wurde die Anwendung zur Simulation klinischer Studien in Shiny v1.6.0 erstellt. Shiny ist ein R-Paket, das automatisch HTML-Anwendungen aus R-Code generiert. Alle Shiny-Anwendungen sind darauf ausgelegt, (1) eine HTML-basierte grafische Benutzeroberfläche (GUI) zu generieren, die es Benutzern ermöglicht, mit dem Computer zu interagieren, der die Shiny-Anwendung hostet, der als Server bezeichnet wird, und (2) R-Code auf dem Server basierend darauf auszuführen Benutzerinteraktionen mit der GUI. Um die Verwendung unseres Simulators zu erleichtern, wurde eine benutzerfreundliche GUI entwickelt, die es ermöglicht, Modalitäten für eine klinische Studiensimulation in R (dh die Definition von Parametern wie Dosierung, Dosierungsintervall, Versuchsgröße) auf einem Website-Server festzulegen.

Die im Rahmen dieser Studie generierten Daten sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Dr. Bourgois-Mochel für die logistische Unterstützung der Studie und Dr. Oliver Domenig für die quantitative Analyse der pharmakodynamischen Daten.

Die Finanzierung dieser Studie erfolgte durch Ceva Sante Animale.

SMART Pharmacology, Iowa State University College of Vet. Medicine, 2448 Lloyd, 1809 S Riverside Dr., Ames, IA, 50011-1250, USA

Benjamin K. Schneider & Jonathan P. Mochel

Veterinärklinische Wissenschaften, Iowa State University, Ames, IA, 50011-1250, USA

Jessica Ward und Samantha Sotillo

Ceva Animal Health, 33500, Libourne, Frankreich

Catherine Garelli-Paar, Emilie Guillot & Marc Prikazsky

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BKS: Methodik, Untersuchung, formale Analyse, Software, Validierung, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung; JW: Konzeptualisierung, Datenkuratierung, Untersuchung, Schreiben – ursprüngliche Entwurfsvorbereitung; SS: Datenkuratierung, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; CGP, MP: Konzeptualisierung, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung; ZB: Konzeptualisierung, Untersuchung, Schreiben – ursprüngliche Entwurfsvorbereitung; JPM: Aufsicht, Projektverwaltung, Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung, Finanzierungseinwerbung, Ressourcen, formale Analyse, Validierung, Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung.

Korrespondenz mit Jonathan P. Mochel.

Die Autoren JPM und JW waren als Berater für Ceva Sante Animale tätig und erhielten Vergütungen und Honorare für Beratung, Expertenaussagen, Reisen und Dienste als Key Opinion Leaders (KOLs). Die Autoren Garelli-Paar, Guillot und Prikazsky sind Mitarbeiter von Ceva Sante Animale. Für die Autoren SS und BKS besteht kein Interessenkonflikt.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schneider, BK, Ward, J., Sotillo, S. et al. Durchbruch: ein erstklassiger virtueller Simulator zur Dosisoptimierung von ACE-Hemmern in der translationalen Herz-Kreislauf-Medizin. Sci Rep 13, 3300 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30453-x

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Eingegangen: 21. November 2022

Angenommen: 23. Februar 2023

Veröffentlicht: 26. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30453-x

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