Automatisierte Vitrifizierung von Kryo - Chengdu Kryospeicher Co., Ltd

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 2985 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Geschwindigkeit und Effizienz der Datenerfassung und Bildverarbeitung in der Kryo-Elektronenmikroskopie hat im letzten Jahrzehnt zugenommen. Die Techniken zur Kryo-Probenvorbereitung hinken jedoch hinterher und es werden schnellere und reproduzierbarere Probenvorbereitungsgeräte benötigt. Hier stellen wir ein Vitrifikationsgerät mit hochautomatisierter Probenhandhabung vor, das nur eine begrenzte Benutzerinteraktion erfordert. Darüber hinaus ermöglicht das Gerät die Untersuchung dünner Filme mittels Lichtmikroskopie, da die überschüssige Flüssigkeit durch Absaugen über Röhrchen und nicht über Löschpapier entfernt wird. In Kombination mit der Taupunktkontrolle ermöglicht dies eine kontrollierte und reproduzierbare Dünnschichtvorbereitung. Der Vorteil besteht darin, dass die Qualität der vorbereiteten Kryoprobe vor der elektronenmikroskopischen Datenerfassung charakterisiert wird. Die Praktikabilität und Leistung des Geräts werden durch experimentelle Ergebnisse veranschaulicht, die durch Vitrifizierung von Proteinsuspensionen, Lipidvesikeln, Bakterien- und menschlichen Zellen gewonnen wurden, gefolgt von einer Bildgebung mittels Einzelpartikelanalyse, Kryo-Elektronentomographie und kryokorrelierter Licht- und Elektronenmikroskopie.

Die Kryo-Fixierung in Glaswasser (amorphes Eis) durch schnelles Einfrieren biologischer Proben kann zu einer nahezu perfekten strukturellen Konservierung biologischer Proben wie Proteinsuspensionen, Viren, Bakterien und eukaryotischen Zellen führen. Die Kryofixierung erfordert eine ausreichend hohe Gefrierrate (>100.000 °C/s), damit die Bildung von Eis (Kristallen) verhindert wird. Dadurch nimmt das Wasser einen glasartigen, amorphen, metastabilen Übergangszustand ein1. Mithilfe der Vitrifikation kann die Struktur von Proteinen und Zellen in ihrer natürlichen, hydratisierten Umgebung bis zur atomaren Auflösung erhalten bleiben. Verglaste Proben sind mit den Vakuumbedingungen kompatibel, die für die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) erforderlich sind, und können auch mit optischer Kryo-Fluoreszenz-Lichtmikroskopie (cryofLM)2 untersucht werden. Die korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM)3 vereint die Vorteile der EM (hohe Auflösung, struktureller Kontext) mit den Vorteilen der breiten Palette verfügbarer Lichtmikroskopietechniken (Live-Bildgebung, vielseitige Markierung)4,5.

Die Vitrifizierung mittels Tauchgefrieren unter Verwendung von flüssigem Ethan oder einer Ethan/Propan-Mischung als kryogenes Mittel6 erwies sich als praktischer Ansatz für die Kryovorbereitung biologischer Proben mit einer Dicke von bis zu 10 Mikrometern1,7. Bei der Kryo-EM werden gereinigte Protein- und Virussuspensionen in dünnen Wasserschichten mit einer Größe von mehreren zehn Nanometern konserviert, aus denen mithilfe von SPA8,9 Rekonstruktionen mit atomarer Auflösung ermittelt werden können. Auch größere Strukturen wie Bakterien und adhärente Zellen mit einer Dicke von bis zu einigen Mikrometern eignen sich für die Vitrifizierung. Dreidimensionale Rekonstruktionen mit molekularer Auflösung können mithilfe der Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) von Proben mit einer Dicke von bis zu etwa einem halben Mikrometer ermittelt werden10,11. Die Minimierung der Dicke der Flüssigkeitsschicht ist wichtig, da das die Probe umgebende Medium Elektronen streut, was zum Hintergrundrauschen in den Bildern beiträgt, dadurch das Signal-Rausch-Verhältnis in den Bildern verringert und die erreichbare Auflösung in resultierenden dreidimensionalen Rekonstruktionen verringert.

Der wesentliche Schritt der Erzeugung einer dünnen flüssigen Probenschicht auf einem Elektronenmikroskop-Probenträger für EM (typischerweise eine löchrige Kohlenstoffschicht, die von einem Kupfergitter mit 3,05 mm Durchmesser getragen wird) ist problematisch, da dünne Wasserschichten von Natur aus instabil sind und eine genaue Kontrolle darüber nicht möglich ist Die Dicke der Wasserschicht ist schwierig. Es wurde festgestellt, dass die Hydrophilisierung des Trägerfilms durch Glimmentladung in Luft oder Alkylamin12,13 zur Bildung einer dünnen Flüssigkeitsschicht auf dem Trägerfilm beiträgt und eine feuchtgesättigte Umgebung zur Stabilisierung der dünnen Schicht beiträgt. Derzeitige gängige Praxis besteht darin, mehrere Mikroliter Probenlösung auf einen glimmentladenen Trägerfilm aufzutragen und anschließend überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier abzutupfen, das anschließend tauchgefroren wird14,15.

Allerdings birgt diese Methode mehrere Herausforderungen. Erstens ist es schwierig, die Dicke der Wasserschicht zu kontrollieren und ihre Verteilung über das Gitter zu bestimmen. Da die Dicke der Wasserschicht von vielen Faktoren beeinflusst wird, darunter den Eigenschaften des Trägers, der Probe (Typ, Konzentration, Puffer, gelöste Stoffe usw.) und den Umgebungsbedingungen (Temperatur und Luftfeuchtigkeit)16, werden optimale Parameter häufig über die Zeit ermittelt Aufwändiges Ausprobieren mit iterativen Zyklen des Einfrierens und der Analyse mittels Kryo-EM. Zweitens gehen während des Prozesses relativ große Probenmengen verloren, da der größte Teil der Probe vom Löschpapier absorbiert wird, sodass weniger als ein Promille der Probe auf dem Gitter verbleibt17. Drittens wird berichtet, dass die Verwendung von Löschpapier nachteilige Auswirkungen wie Proteinaggregation und Denaturierung haben kann18,19. Darüber hinaus sind die manuelle Probenaufbringung, die Handhabung von Pinzetten und der Transfer zwischen Behältern und verschiedenen Maschinen zeitaufwändig und erfordern umfangreiche Schulungs- und Benutzerkenntnisse. Da die aktuellen hochmodernen Anwendungen der Kryo-EM das Roboter-Probenladen mehrerer Gitter, eine hochautomatisierte Datenaufzeichnung20,21 und eine Bildverarbeitung im laufenden Betrieb22 umfassen, sind Geschwindigkeit und Qualität der Probenvorbereitung zu Engpässen in der Probenvorbereitung geworden Gesamtprozess.

Es wurden alternative Probenvorbereitungsmethoden zum Blotting vorgeschlagen und entwickelt, zu denen das Auftragen minimaler Probenmengen durch Sprühen23,24, Tintenstrahldosieren25,26, Mikrokapillarschreiben18 oder Kontaktstiftdrucken27 gehört. Bei diesen Methoden ist es nicht erforderlich, überschüssige Flüssigkeit vom Gitter zu entfernen, und die wertvolle Probe wird effizient genutzt. Darüber hinaus sind die kürzlich entwickelten Vitrifizierungssysteme hochautomatisiert und minimieren Schritte im Zusammenhang mit Handhabungs-, Wiederholbarkeits- und Geschwindigkeitsproblemen. Einige Nachteile dieser Systeme bestehen darin, dass die Probenverteilung über das Gitter räumlich begrenzt ist oder dass für eine gute Verteilung spezielle Gitter erforderlich sind28. Darüber hinaus eignen sich die meisten Systeme für die Vitrifizierung von Suspensionen, sind jedoch nicht speziell für den Einsatz bei viel größeren Proben wie anhaftenden Zellen oder Bakterien konzipiert. Darüber hinaus befasst sich keine dieser Methoden mit der Lösung zeitaufwändiger Testzyklen zwischen Vitrifizierung und Qualitätsbewertung durch Kryo-EM29.

Hier haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein Vitrifikationsgerät für die Kryomikroskopie zu entwickeln, das (i) die Bestimmung der Verwendbarkeit einer vitrifizierten Probe vor der Durchführung der Kryomikroskopie ermöglicht, (ii) mit allen Arten von Proben (Proteinen, Bakterien und Zellen) kompatibel ist, (iii ) erzeugt auf reproduzierbare Weise Gitter mit kontrollierbarer Probeneisdicke und (iv) verfügt über einen hohen Automatisierungsgrad. Wir präsentieren ein Tauchgefriergerät, das über eine umfassende Automatisierung des Probenvorbereitungsprozesses verfügt, einschließlich Gitterhandhabung, Glimmentladung, Steuerung kryogener Flüssigkeiten und Probenaufgabe. Das Gerät nutzt die Probenentnahme durch Absaugen – nicht durch Filterpapier – und ermöglicht eine visuelle Inspektion des Gitters während der Dünnfilmbildung. Die Beobachtung von Interferenzmustern durch Lichtmikroskopie in Kombination mit der Taupunkttemperaturkontrolle des Gitters ermöglicht eine präzise Kontrolle der Wasserschichtdicke und die Bestimmung des optimalen Zeitpunkts für die Vitrifizierung. Die optische Überwachung der Dünnschichtbildung vor dem Eintauchen erwies sich als brauchbare und zuverlässige Methode zur Qualitätsbeurteilung vor zeitaufwändiger Kryo-EM-Analyse. Die Ergebnisse, über die wir hier berichten, zeigen, dass das Gerät zur Vitrifizierung von Proteinen, Liposomen, Viren, Bakterien und Zellen für Einzelpartikel-, tomographische und CLEM-Kryoelektronenmikroskopietechniken verwendet werden kann.

Der Linkam-Kolben ist ein hochautomatisiertes Gerät, das Proben auf einem EM-Trägergitter für die Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie vorbereitet. Zu den Hauptmerkmalen gehört, dass die Probenaufbringung durch Eintauchen des Gitters in die Probenlösung erfolgt und die Einstellung der Probenfilmdicke durch langsames Herausziehen des Gitters aus der Probenlösung und anschließendes Absaugen erfolgt. Die Lufttaupunkttemperatur des Gitters wird kontrolliert und die Bildung der Wasserschichtdicke auf dem Gitter wird live durch Transmissions- und/oder Reflexionslichtmikroskopie untersucht (und aufgezeichnet). Der Arbeitsablauf dieses Linkam-Systems unterscheidet sich von anderen Arbeitsabläufen beim Eintauchen von Gittern durch die folgenden Schritte: Gitterentnahme aus einer Aufbewahrungsbox, Glimmentladung, Probenauftrag, Flüssigkeitsentfernung, Vitrifikation (Eintauchen der Probe in eine kryogene Lösung) und Laden in eine kryogene Aufbewahrungsbox erfolgen automatisch (Abb. 1). Bei anderen Tauchgefriergeräten, z. B. dem Thermo Fisher Scientific Vitrobot und dem Leica EM GP, liegt der wichtigste Schritt zwischen Blotting und Vitrifikation (wodurch die Probendicke bestimmt wird) und wird durch einen voreingestellten Zeitparameter bestimmt. Beim Linkam-Kolben sind alle Schritte bis auf die Auswahl der Probendicke automatisiert, was eine präzise zeitliche Abstimmung der Vitrifizierung ermöglicht.

Schematischer Überblick über den Arbeitsablauf herkömmlicher Tauchgeräte (oben), bei denen die Glimmentladung und Probenaufgabe nicht mit automatischer Probenentnahme und anschließendem Tauchvorgang integriert sind. Beim Linkam-Ansatz (unten) sind alle Schritte in einen automatisierten Workflow integriert. Bei diesem Ansatz erfolgt die Probenaufgabe nicht durch Pipettieren, sondern durch Eintauchen des Gitters in die Lösung, und die Probenentnahme erfolgt nicht durch Abtupfen mit Filterpapier, sondern durch Absaugen mit einem Röhrchen. Der Prozess der Dünnschichtbildung wird live verfolgt und nur der Zeitpunkt des Eintauchens wird manuell vorgenommen, genau im Gegensatz zum herkömmlichen Arbeitsablauf.

Das Design des Kryoabschnitts des Linkam-Kolbens (Abb. 2) ähnelt dem der Kryostufe Linkam CMS 19630. Der Kolben enthält einen (1) Vorratsbehälter für flüssigen Stickstoff (Abb. 2 a links); (2) ein zentraler (abgedeckter) Bereich, der den Kryobehälter, die Umgebungskammer und die Glühentladungseinheit enthält (Abb. 2b, c); (3) eine Digitalkamera und ein ×10-Lichtmikroskopobjektiv (bzw. hinter und vor den Behältern); (4) mechanisch gesteuerte und bewegliche Pinzetten (über den Kammern), die alle auf (5) einem Aluminiumrahmen montiert sind, der die elektrischen Einheiten und Pumpen enthält. Der Linkam-Kolben und die Kamera sind mit einem Laptop mit Steuersoftware verbunden (nicht in der Abbildung).

eine Linkam-Kolbenanordnung mit Flüssigstickstoffbehälter (links), Pinzettensteuerung (oben) um die zentralen Kammern (weißer Kasten). b Zentrale Kammern mit Kryokammer (links), Umweltkammer (Mitte) und Glimmentlader (rechts) und Linse (unten). c Die Kryokammer ist mit flüssigem Stickstoff aus dem Flüssigstickstoffbehälter gefüllt (siehe a) und enthält eine kryogene Gitteraufbewahrungsbox und einen Behälter für flüssiges Ethan (Standbild aus Zusatzfilm 1, der Übersichtlichkeit halber sind die Ethangasschläuche und die Messingabdeckung nicht gezeigt). Die zentrale Klimakammer enthält zwei Positionen für Probenbehälter und einen Platz für drei Gitter. In der Mitte befindet sich eine temperaturgesteuerte „Pinzettensperre“, die die Pinzette kühlt, während sie das Gitter in Position bringt, damit Wasser durch Saugrohre (nicht dargestellt) entfernt und gleichzeitig durch die Linse visuell überprüft werden kann. d Gitterbox für drei Gitter. e Temperaturgesteuerter Block mit Probenbehältern und Schleuse für Pinzette und Schlitz zur Rasterpositionierung für Saugrohre und Lichtmikroskopie.

Der Flüssigstickstoff-Dewar (Abb. 2a) enthält bis zu 200 ml flüssigen Stickstoff, der durch einen Trichter eingefüllt und mit einem Deckel mit offenem Isolierrohr für den Stickstoffgasaustritt abgeschirmt werden kann (in Abb. 2 nicht vorhanden). Der flüssige Stickstoff im Inneren des Dewargefäßes wird durch einen Temperatursensor überwacht und der Füllstand in der Kryokammer wird durch ein Ventil, das die Nachfüllung steuert, konstant gehalten.

Die Kryokammer (Abb. 2b, c) enthält einen Platz für eine speziell angefertigte Aufbewahrungsbox für kryogene Gitter, die drei verglaste Gitter für Transport und Lagerung sowie den Behälter für flüssiges Ethan aufnehmen kann. Das Ethanbad und die zugehörigen Gasfüllrohre (nicht dargestellt) werden temperaturgesteuert, um eine automatische Kondensation von Ethangas zu ermöglichen. Für das flüssige Kryogenbad werden ein konstanter Füllstand und eine konstante Temperatur (bei −183 °C) aufrechterhalten, um das Einfrieren von Ethan zu verhindern. Da die Kryokammer relativ klein ist, wird die Oberseite der Kryokammer durch eine gekühlte Kupferplatte abgeschirmt (Abb. 2b), um die kryogene Temperatur der Gasphase aufrechtzuerhalten.

Die Klimakammer (Abb. 2b, c) wird durch ein Peltier-Element temperiert und kann zwischen 3 und 50 °C eingestellt werden. Der Boden der Kammer kann einige ml entmineralisiertes Wasser enthalten, um durch Verdunstung Feuchtigkeit zu erzeugen. Der Gitterbereich enthält eine abnehmbare Gitterbox (Abb. 2c, d), in der bis zu drei EM-Gitter aufbewahrt werden können, die zur Glimmentladung und anschließenden Probenaufbringung verwendet werden können. Alternativ enthält es eine Box mit anhaftend gewachsenen Zellen auf EM-Gittern in Flüssigkeit. Die Klimakammer verfügt außerdem über zwei Positionen für Behälter zur Aufbringung flüssiger Proben. Ein Mikroskopaufbau mit integriertem ×10-Objektiv und LED-Durchlicht- und Auflichtmodus kann das EM-Gitter in der Feuchtigkeitskammer abbilden, während die Pinzette, die das Gitter hält, in die „Pinzettenverriegelung“ vor der Linse eingeführt wird. Dieses temperaturgesteuerte „Pinzettenschloss“ aus Messing (Abb. 2e) enthält einen Schlitz, durch den die Pinzette mit dem Gitter in einem Hohlzylinder positioniert werden kann. Hier wird das Gitter für die gleichzeitige Probenentnahme mittels Absaugung und lichtmikroskopischer Bildgebung positioniert. Ein austauschbares Saugmodul mit bis zu drei Saugrohren wird am Außenrand des Gitters positioniert, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Die Temperatur der „Pinzettenschleuse“ ist auf eine niedrigere Temperatur als die der Kammer eingestellt, so dass die Pinzettenspitze und das Gitter um den Taupunkt herum eingestellt werden können, um die Wasserverdunstung und damit die Dicke der Wasserschicht zu kontrollieren und gleichzeitig eine Änderung der Probenkonzentration zu verhindern .

Die Glimmentladungseinheit verfügt über drei Positionen für Gitter, die sich zwischen zwei Elektroden befinden. Mit einer kleinen ölfreien Vakuumpumpe wird das Volumen innerhalb einer Minute automatisch auf 1,8 × 10−1 mbar gepumpt. Die Glimmentladung erfolgt automatisch entsprechend den programmierbaren Einstellungen, typischerweise innerhalb von 2 Minuten bei 5 mA in Luft.

Die Vorbereitung des Linkam-Kolbens für den Einsatz erfolgt durch Einschalten aller elektrischen Einheiten (Peltier-Wasserkühler, Linsenheizung, Kolben und Support-PC), Anschließen oder Befüllen aller Verbrauchsmaterialien (Ethan-Gasflasche, flüssiger Stickstoff im Dewar, Wasser in der Umgebung). Kammer, Gitteraufbewahrungsbox im Kryobehälter, EM-Gitter in der Gitteraufnahmekartusche, flüssige Probe im Probenbehälter) und Starten der Kolben- und Kamerasteuerungssoftware und Starten des Protokolls zum Befüllen mit flüssigem Ethan. Ein detailliertes Protokoll finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 1.

Die Vorbereitung des Kryogitters erfolgt automatisch nach dem Start der programmierten Sequenz (Zusatzfilm 1). Zunächst wird ein Gitter von der Pinzette aufgenommen und in die Glimmentladungseinheit übertragen, wo es im Luftplasma freigesetzt und hydrophil gemacht wird. Anschließend wird das Glimmentladungsgitter erneut aufgenommen und in den mit der Probe gefüllten Behälter überführt, wo die Probe durch Eintauchen in die temperierte Probenflüssigkeit auf das Gitter aufgetragen wird. Zum Befüllen des Probenbehälters werden mindestens 10 µL benötigt. Durch das Eintauchen werden tatsächlich weniger als 0,5 µL auf das Gitter aufgetragen, während bei der manuellen Anwendung im Allgemeinen weniger als 2–3 µL verbraucht werden. Sowohl die Einweichzeit des Gitters als auch die Rückzugsgeschwindigkeit des Gitters aus dem Flüssigkeitsbehälter sind programmierbar. Das Gitter wird anschließend mit der Pinzette vor eine temperaturgesteuerte ×10-Lichtmikroskopielinse gelegt. Die Pinzettenspitze und das darin gehaltene Gitter sind in dieser Konfiguration beide temperaturgesteuert, da die Pinzette die temperaturgesteuerte „Pinzettenverriegelung“ aus Messing berührt, die einige Grad unter dem Taupunkt der Temperatur der Klimakammer eingestellt ist. Dann wird ein Saugmodul mit zwei oder drei Röhren vor dem Gitter platziert, das den Rand des Gitters berührt, und bei der Aktivierung wird überschüssige Flüssigkeit mit einem einstellbaren und kalibrierten Fluss abgesaugt. Gleichzeitig wird die Dicke der Wasserschicht auf dem Gitter visuell durch das Mikroskop mit angeschlossener Kamera überwacht und der Zeitpunkt der Übertragung in den Behälter für flüssiges Ethan und der Verglasung durch Eintauchen wird vom Bediener auf der Grundlage des Echtzeit-Kamerabilds ausgelöst. Nach der Vitrifizierung wird das Gitter in die Aufbewahrungsbox für kryogene Gitter oder eine Kryokassette für die Kryofluoreszenzbildgebung in der Kryostufe CMS196V3 überführt.

Um einen Blick auf das Gitter für die Echtzeit-Lichtmikroskopie-Beobachtung zu ermöglichen, wurden anstelle von Filterpapier Röhrchen zum Entfernen überschüssiger Flüssigkeit aus dem EM-Gitter verwendet (Abb. 3 und 4, Zusatzfilm 3). Die lichtmikroskopische Beobachtung der „Massenflüssigkeit“ auf dem Gitter nach dem Auftragen der Probe durch Eintauchen führt zu keinem spezifischen Merkmal, das zu einer Dickenschätzung der Wasserschicht führt (Abb. 3a). Wenn das Wasser dünner wird, entstehen farbige Dünnfilm-Interferenzmuster, die durch die Interferenz von Licht erzeugt werden, das von der Luft-Wasser-Grenzfläche auf der Kohlenstoffseite des Gitters und dem Kohlenstofffilm ausgeht (Abb. 3b). Bei weiterer Entfernung der Flüssigkeit verschwinden diese farbigen Interferenzstreifen, wenn der Abstand zwischen der Wasseroberfläche und der Kohlenstoffschicht weniger als ~200 nm beträgt (Abb. 3c). Nach weiterer Flüssigkeitsentfernung erscheint ein kreuzförmiges Lichtmuster, wenn sich das Meniskusreservoir an der Seite des Gitters bildet (Abb. 3d). In diesem Moment erscheint eine helle Scheibe in der Mitte des Quadrats (Abb. 3e), da die Wasserschichtdicke in der Mitte auf etwa weniger als einen Mikrometer reduziert ist (wie aus der resultierenden Elektronentransparenz nach der Vitrifizierung ersichtlich). An den Seiten ist noch ein dickerer Wassermeniskus an den Gitterstäben befestigt, der in einem dunklen Rand erscheint (Abb. 3f). Bei weiterer Wasserentfernung kann es sein, dass dieses Wasser auch vollständig entfernt wird (hier nicht dargestellt), aber unserer Erfahrung nach trocknet dann auch die Mitte des Gitters aus. Kryo-EM-Beobachtungen zeigten, dass nur die beiden letztgenannten „Zustände“ nach der Vitrifizierung eine elektronendurchlässige verglaste Wasserschicht aufweisen (Abb. 3e und f), während die anderen Zustände die Eindringtiefe der Elektronen überschreiten, was zu schwarzen Quadraten im Kryo führt -EM-Bilder. Der optimale Zeitpunkt für die Vitrifizierung ist also, wenn Gitterquadrate bei lichtmikroskopischer Betrachtung einen hellen zentralen Bereich und einen dunklen äußeren Ring zu haben scheinen. Um in unseren Experimenten ein großes Sichtfeld zu erhalten, verwendeten wir hauptsächlich ein 10-fach-Objektiv. Durch die Verwendung einer ×20-Linse konnten die Unterschiede zwischen offenen und mit Wasser bedeckten Löchern (mit Quantifoil 2/2-Kohlenstofffolie) deutlicher beobachtet werden, was eine genauere Bestimmung des Verglasungspunkts ermöglichte, allerdings auf Kosten der Kenntnis der Dicke Variation der Wasserschicht über dem Gitter (Ergänzende Abbildung 3C).

Beurteilung der Filmdicke durch Echtzeit-LM und Kryo-EM. Erste zwei Spalten: LM-Beobachtungen (Gitterübersicht, Gitterquadrat), dritte Spalte: Kryo-EM-Ansicht desselben Quadrats nach der Vitrifizierung, letzte Spalte: schematische Seitenansicht, erläuternde Abbildung eines Quadrats mit Gitterstäben in Hellbraun, Kohlenstoffschicht in Grau und Flüssigkeitsoberflächen in blauen Linien. a Unmittelbar nach dem Auftragen der Probe durch Eintauchen ist die Hauptprobenlösung auf beiden Seiten des Gitters vorhanden und es können keine spezifischen Merkmale durch Lichtmikroskopie beobachtet werden. Die schematische Übersicht zeigt die Flüssigkeitsoberfläche (blaue Linien), die Gitterstäbe (beige) und die Kohlenstoffschicht auf einer Seite des Gitters (grau). b Nach dem Entfernen des Wassers erscheinen farbige Interferenzringe, vermutlich aufgrund von Lichtinterferenzen zwischen der Wasseroberfläche und der Kohlenstoffschicht auf der Kohlenstoffseite des Gitters. Interferenzlinien können innerhalb eines Quadrats auftreten, sich aber auch über mehrere Quadrate erstrecken. c Interferenzmuster verschwinden und in der Nähe von Gitterkanten verändert sich das Erscheinungsbild leicht durch die Berührung der Wasserschicht mit den Gitterstäben. d In der Mitte der Gitterquadrate erscheint ein hellerer Fleck, vermutlich weil die Wasseroberfläche innerhalb des Quadrats eine konkave Form annimmt. e Wieder entstehen Interferenzringe, nun aufgrund von Interferenzen zwischen der anderen Wasserschicht in der Kohlenstoffschicht (siehe Zusatzfilm 3). Der hellere Fleck stellt Wasserschichten dar, die dünner als einige hundert Nanometer sind: Kryo-EM-Bilder dieses Quadrats zeigen elektronendurchlässige zentrale Regionen. Dunklere Bereiche an den Rändern des LM-Bildes sind wahrscheinlich das Ergebnis von Lichtstrahlen, die zu den Gitterstäben hin gebrochen und von diesen absorbiert werden. f Der zentrale Bereich dehnt sich im LM-Bild aus. Kryo-EM zeigt eine Erweiterung des elektronendurchlässigen Bereichs, während an den Rändern eine weiche Kante erscheint. Ansichten wie in e und f sind der richtige Zeitpunkt für die Vitrifizierung und führen zu verwendbaren Gitterquadraten für die Kryo-EM-Bildgebung. Ein gutes und einfaches visuelles Kriterium ist, dass der schwarze Rahmen um das Planquadrat nach Überschreiten der größten Fläche wieder zurückweicht, wie in (e) gezeigt.

a LM-Übersicht des EM-Gitters mit flüssiger Probe (oben, letztes Filmbild vor der Vitrifizierung) und b Kryo-EM-Übersicht des Gitters nach der Vitrifizierung (oben). Die Zahlen 1, 2 und 3 in a und b bezeichnen dieselben Gitterquadrate, die das Erscheinungsbild unterschiedlicher Probendicken in LM und EM zeigen. Die optimale Probendicke wird um Position 2 herum erreicht. Beachten Sie, dass in b, Einschub 3, die meisten Löcher auf der Trägerfolie nicht von einer Eisschicht bedeckt sind und b, Einschub 2, mehr nutzbare Löcher in der Trägerfolie für die Datenerfassung enthält. Weiße Kreise markieren die Positionen der Saugrohre.

Erste Experimente zeigten, dass das Absaugen von Flüssigkeit mithilfe eines einzelnen Saugrohrs an der Unterseite des Gitters zu einem steilen Dickengradienten zwischen wassergefüllten Quadraten und trockenen Quadraten führte. Dies hatte zur Folge, dass zu jedem Zeitpunkt des Prozesses nur eine sehr begrenzte Anzahl von Quadraten die gewünschte Dicke aufwies, die für die Datenerfassung geeignet war. Um mehr Quadrate mit optimaler Dicke und einer besseren Verteilung über das Gitter zu erhalten, haben wir verschiedene Anordnungen von Saugrohren getestet. Es zeigte sich, dass die Positionierung von zwei Saugrohren auf der linken und rechten Seite des Gitters die reproduzierbarsten und besten Ergebnisse lieferte (ergänzende Abbildung 2). Aussehen, Qualität und allgemeine Verwendbarkeit für die Datenerfassung der hergestellten Gitter (Abb. 4) waren mit denen vergleichbar, die in unserem Labor mit dem Thermo Fisher Scientific Vitrobot oder dem Leica EM GP vitrifiziert wurden.

Da die Wasserentfernung an den Seiten des Gitters erfolgt, während an der (zentralen) Position der Pinzettenspitze häufig Wasser auf dem Gitter zurückgehalten wird, entsteht ein Dickengradient, der den richtigen Zeitpunkt der Vitrifizierung ermöglicht, um eine große nutzbare Gitterfläche zu erzeugen Quadrate. Es muss gesagt werden, dass die Probe selbst (Zusammensetzung, Viskosität, Oberflächenspannung) Einfluss darauf hat, wie sich dieser Gradient verhält und wie viel Wasser auf dem Gitter zurückgehalten wird. Auch die Art der Gitter (Masche, Material, Dicke) und die Qualität (Falten, Risse, Löcher) der Kohlenstoffschicht sowie die Art des Kohlenstofffilms (Lacey oder Quantifoil: Menge und Größe der Löcher) beeinflussen das Wasserverhalten Gitter während der Schichtverdünnung durch Absaugen. Individuelle Unterschiede zwischen Gittern und Proben hatten jedoch keinen Einfluss auf die Qualität der verglasten Gitter. Bei der Vorbereitung wird jede Probe einzeln beurteilt.

Darüber hinaus ermöglichte die LM-Beobachtung die Beobachtung mehrerer Phänomene, die sich als nützlich für die Beurteilung der Qualität des Gitters erwiesen. Erstens konnte während der Wasserentfernung durch Absaugen eine Aggregation von Proteinen und Vesikeln auf dem Gitter beobachtet werden. Aggregate im Mikrometerbereich führen zu lokalen Dickenschwankungen der Wasseroberfläche, die sich in Kontrastschwankungen niederschlagen, die mit LM beobachtet werden können. Eine Aggregation von Protein innerhalb der Löcher in der Folie konnte im aktuellen Aufbau nicht beobachtet werden. Gelegentlich wurden auch hydrophobe Stellen auf der Kohlenstofffolie durch ungleichmäßiges Zurückziehen der Wasserränder beobachtet (ergänzende Abbildung 3).

Obwohl die visuelle Inspektion der Gitterquadrate im optischen Bild vor dem Eintauchen ein nützlicher Hinweis auf die Qualität und Verwendbarkeit des resultierenden verglasten Gitters durch Kryo-EM ist, ist die Dicke des Eisfilms über den Löchern in der Kohlenstoffschicht von entscheidender Bedeutung. Die einzelnen Löcher mit einem Durchmesser von zwei Mikrometern in den Quantifoil R2/2 EM-Gittern können mit einem ×10 NA 0,25-Objektiv in Kombination mit einer 5-MP-Digitalkamera beobachtet werden, wodurch untersucht werden kann, ob die Löcher mit Wasser bedeckt bleiben oder durch die große Oberfläche aufplatzen Spannung. Die allgemeine Tendenz war, dass bei Quadraten mit Wasser an den Rändern die Löcher im Kohlenstofffilm bedeckt sind. Wenn an den Außenrändern des Quadrats wenig Wasser vorhanden ist, sind die Löcher offen und nicht mit Wasser bedeckt.

Während das Vorhandensein großer Wassermengen durch Sog kontrolliert wird, reagieren inhärent instabile dünne Wasserschichten empfindlich auf die relative Luftfeuchtigkeit ihrer Umgebung. Da das Instrument über keine aktive Feuchtigkeitskontrolle verfügt (zur Erhöhung der Umgebungsfeuchtigkeit, um die Verdunstung zu reduzieren), ist das Gitter von einer variablen Luftfeuchtigkeit von etwa 79 % umgeben (typisch in den Niederlanden). Daher wurde die Pinzettenspitze und damit das Gitter mithilfe einer „Pinzettensperre“ (Abb. 2c) auf einige Grad unter die eingestellte Temperatur in der Klimakammer gekühlt, um das Gitter auf dem Taupunkt zu halten und eine Verdunstung zu vermeiden18. Auf diese Weise konnten wir die Verdunstung von Wasser aus dem Gitter kontrollieren und günstige Zustände für die Vitrifizierung (Abb. 3e und f) mehrere Minuten lang aufrechterhalten (Zusatzabbildung 4 und Zusatzfilm 2).

Um die Leistung des Vitrifikationsgeräts zu validieren, haben wir verschiedene Proben und Techniken getestet. Abgesehen von der Anpassung der Lösungskonzentrationen haben wir keine Parameter optimiert und alle Proben wurden innerhalb weniger Vitrifizierungssitzungen hergestellt. Für die Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse haben wir frisch gereinigtes Apoferritin vitrifiziert und einige Gitter vorbereitet. Von einem der Gitter haben wir mehrere tausend Bilder aufgenommen und eine 2,4 Å-Rekonstruktion ermittelt, in die wir die Röntgenstruktur einpassen konnten (PDB-Eintrag 6RJH) (Abb. 5a).

a Ergebnisse der Einzelpartikelanalyse für Apoferritin (n = 1). Typisches Kryo-EM-Bild aus der Datenerfassung (links), 3D-Rekonstruktion von Apoferritin mit 2,4 Å Auflösung (Mitte) und Anpassung der Röntgenstruktur von Pferdemilz-Apoferritin (PDB 6rjh in Gelb) in die EM-Dichte (rechts). b Kryo-ET auf DNA-Origami-Würfeln (n = 1). Kryo-EM-Ansicht mehrerer Löcher in löchriger Kohlenstofffolie (links) und der Partikelverteilung innerhalb eines Lochs (Mitte links), ein Schnitt durch das Tomogrammvolumen, der die Oberseite der DNA-Bänder zeigt (Mitte rechts), und eine 3D-Oberfläche Darstellung von 12 DNA-Origami-Würfeln (rechts, einzeln gefärbt). c Kryo-EM von Lipidvesikeln (n = 5). Kryo-EM-Übersicht, die die Eisdicke in einem EM-Gitterquadrat zeigt, das typischerweise zur Datenerfassung verwendet wird (links) und eine Übersicht über die Verteilung von Vesikeln innerhalb eines Lochs im Kohlenstofffilm (Mitte links), ein Schnitt durch ein Tomogrammvolumen von ein mehrschichtiges Vesikel (Mitte rechts) und die 3D-Oberflächendarstellung der einzelnen Lipidschichten (rechts, mit farbigen Lipidschichten).

Für Cryo-ET haben wir DNA-Origami-Würfel vitrifiziert. Hierbei handelt es sich um eine Probe, die dazu neigt, sich zu aggregieren und an der Luft-Wasser-Grenzfläche anzuhaften. Obwohl die Aggregation nicht wesentlich reduziert wurde, konnten wir eine Kryo-ET durchführen. Die tomographische Rekonstruktion zeigte die DNA deutlich als Bänder des Würfels (Abb. 5b). In einem anderen Experiment, das auf die 2D-Kryo-EM-Bildgebung liposomaler Vesikel abzielte, wurden Amphotericin-B-Vesikel (Ambisome®) vitrifiziert. Kryo-EM-Bilder dieser Proben zeigten eine gute Verteilung der bedeckten Löcher innerhalb eines Gitterquadrats und es wurden gute Bilder von vielen Löchern erhalten (Abb. 5c, zwei linke Felder). Proben wurden auch mittels Kryo-ET an multilamellaren Vesikeln hergestellt, wodurch mehrere Membranschichten der Vesikel sichtbar wurden (Abb. 5c, zwei rechte Felder).

Neben der Eignung für Protein- und Liposomensuspensionen ermöglicht das Vitrifikationsgerät auch die Präparation von Zellen. Dies wird durch die Vitrifizierung und Kryo-ET-Bildgebung sowohl von E. coli-Bakteriensuspensionen als auch von 17 Klon-1-Mauszellen gezeigt, die adhärent auf Gold-EM-Gittern gezüchtet wurden (Abb. 6a, b). Schließlich führten wir auch Kryo-CLEM an diesen mit Mitotracker fluoreszierend gefärbten eukaryotischen Zellen durch, gefolgt von Kryo-LM-Bildgebung (Abb. 6c, links) und zusätzlicher Kryo-EM (Abb. 6c, Mitte, rechts).

a Kryo-Elektronenmikroskopie von Bakterien. Typische Kryo-EM-Übersicht eines einzelnen Maschenquadrats einer Bakterienprobe, die die Eisdicke und Verteilung der Bakterien zeigt (links) und eine Ansicht innerhalb eines Lochs im Kohlenstofffilm (rechts). b Typischer Kryo-EM-Überblick über ein einzelnes Maschenquadrat von Zellen, die auf einem EM-Gitter gezüchtet wurden (links) und Kryo-EM-Bild in einem dünnen Teil der Zelle, das innere Vesikel und Mitochondrien mit typischen phosphatreichen elektronendichten Einschlüssen zeigt (rechts) . c Kryo-CLEM von Zellen. Kryo-Lichtmikroskopie-Bildübersicht des zentralen Teils eines Suchgitters, das eine Überlagerung eines Dunkelfeldbilds (weiß) und eines Fluoreszenzbilds (grün) fluoreszierend markierter Zellen (links) ist, Überlagerung des cryoLM-Fluoreszenzbilds über dem Kryo -EM-Übersicht (weiß) (Mitte), rotes Rechteck zeigt die Position des Maschenquadrats an, das bei höherer Vergrößerung angezeigt wird (rechts).

Wir hatten zwei Hauptanreize, dieses Vitrifikationsgerät für die Vorbereitung von Kryo-EM-Proben zu entwickeln und zu bauen. Ein erstes Ziel bestand darin, den Vitrifizierungsprozess konsistenter, weniger benutzerabhängig und einfacher kontrollierbar zu machen. Daher wurden die Schritte zur Gitterhandhabung automatisiert, von der Entnahme eines EM-Gitters (aus der benutzerdefinierten Gitterbox; Abb. 1d) bis zum Einlegen eines vollständig verarbeiteten Kryo-EM-Gitters in einen Kryobehälter zur Lagerung (und für die Kryo-LM-Bildgebung in Spezialkassetten). )30. Durch die Integration von Glimmentladung und Probenauftrag wird die Interaktion des Benutzers mit dem Gitter minimiert, was den Vorteil hat, dass die Verschlechterung (Faltenbildung) oder der Verlust des Gitters minimiert werden. Um den Bedienkomfort zu erhöhen, sind die Verflüssigung des kryogenen Gases (Ethan oder Ethan/Propan) und die Aufrechterhaltung des kryogenen Flüssigkeitsspiegels (Ethan und Stickstoff) vollständig automatisiert.

Ein zweites Ziel bestand darin, Kryo-EM-Gitter mit einer reproduzierbareren Dicke der Glaswasserschicht herzustellen und während der Vorbereitung direktes Feedback zur Probendicke und -verteilung auf dem Gitter zu erhalten. Vorabkenntnisse über die Dicke der glasartigen Wasserschicht und die allgemeine Verwendbarkeit der vorbereiteten Kryoprobe vor der Durchführung der Kryo-Elektronenmikroskopie-Bildgebung verhindern zeitaufwändige Zyklen der Probenvorbereitung und Gitterqualitätsprüfung in der Kryo-Elektronenmikroskopie. Um während der Wasserentfernung auf Informationen zur Schichtdicke zuzugreifen, haben wir auf die Verwendung von Filterpapier verzichtet, das die Sicht auf das Gitter verdeckt, und uns stattdessen für die Absaugung entschieden, um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, indem wir mehrere Röhrchen verwendet haben, die bei positioniert sind der äußere Rand des Elektronenmikroskopiegitters. Durch die Absaugung können im Gegensatz zu herkömmlichem Filterpapier sowohl die Geschwindigkeit als auch die Dauer der Flüssigkeitsentfernung einfach reguliert werden, da die Geschwindigkeit der Entfernung eine intrinsische Eigenschaft des Papiers ist. Unsere Methode hat den zusätzlichen Vorteil, dass sie jeglichen möglichen Einfluss des Filterpapiers auf die Chemie der Probe beseitigt18,31. Ein großer Vorteil des aktuellen Aufbaus mit Flüssigkeitsaspiration besteht darin, dass er die Positionierung einer Lichtmikroskopielinse mit Kamera und Beleuchtung für Reflexions- und Transmissionsmodi um das Gitter herum und die Beobachtung des Gitters während der Probenentnahme ermöglicht. Erste Experimente mit einer ×20-Linse lieferten ein relativ großes Sichtfeld auf etwa 45 Quadraten (5 × 9 Quadrate, 423 × 762 µm) mit einer nutzbaren Sicht auf die 2-Mikrometer-Löcher. Das aktuelle und bevorzugte Setup verwendet ein ×10-Objektiv (16 × 26 Quadrate; 1,35 mm × 2,2 mm mit einer verbesserten 20-MP-Kamera), das eine weniger detaillierte Ansicht einzelner 2-Mikron-Löcher bietet, aber eine relativ große Ansicht, die etwa entspricht 70 % der gesamten Gitterfläche, die in EM beobachtet werden kann.

Der Vergleich der aufgezeichneten Lichtmikroskopie während der Präparation und der daraus resultierenden Kryo-Elektronenmikroskopie der verglasten Gitter zeigte, dass die Dicke des verglasten Wassers in der Kryo-EM mithilfe der Lichtmikroskopie qualitativ abgeschätzt werden konnte. Anhand lichtmikroskopischer Bilder konnten die Bereiche, die im Kryo-EM elektronendurchlässig sind, leicht identifiziert und sogar der Unterschied zwischen wassergefüllten und leeren Löchern im Kohlenstoff beobachtet werden. Obwohl die Zeit zwischen der letzten LM-Beobachtung und der Vitrifizierung bis zu einer Sekunde beträgt, ist sie schnell genug, sodass nicht viele Änderungen auftreten. Die resultierende Dicke der verglasten Wasserschichten wurde nicht quantitativ gemessen, aber auf der Grundlage der Partikelgröße in den verschiedenen Proben und Tomographiedaten haben wir geschätzt, dass die resultierenden verglasten Wasserschichten zwischen etwa 50 und 200 nm variieren. Insgesamt liefert die lichtmikroskopische Beobachtung von Dünnschichtinterferenzen eine gute Abschätzung für einen geeigneten Zeitpunkt der Vitrifizierung und führt zu Gittern mit einer Dicke der verglasten Wasserschicht, die praktisch verwendbar sind.

Obwohl Weißlicht-Dünnschichtinterferenz detaillierte Informationen über die Filmdicke liefern kann32, kann im aktuellen Aufbau mit Transmission und reflektiertem Licht die genaue Farbe nicht bestimmt werden. Außerdem sind dünne Filme unter ~100 nm farblos und verändern nur die Intensität, die nicht auf eine bestimmte Dicke zurückgeführt werden kann, da sie durch Unterschiede in der Hintergrundintensität maskiert werden. Allerdings ist die quantitative Dünnschichtanalyse im Bereich von 50–200 nm wichtig für die Bestimmung der optimalen Dicke für hochauflösende Kryo-EM kleiner Partikel und wäre eine wünschenswerte Funktion für einen Kolbenaufbau. Mit geeigneten spektral aufgelösten Nachweis- und Analysemethoden könnte die quantitative Dicke des Flüssigkeitsfilms optisch bestimmt werden. Im Prinzip wurde die Interferenzfarbanalyse mit Licht von drei Wellenlängen33 oder eine Kombination aus Holographie und Interferometrie34 für die optische Vollfeld-Dünnschichtmessung demonstriert. Für die Messung von Filmen mit einer Dicke von weniger als 100 nm sind jedoch wahrscheinlich kürzere Wellenlängen erforderlich.

Durch Absaugen mit zwei oder drei Schläuchen kann große Wassermenge effizient vom Rand des Gitters entfernt werden. Dies führte zu einer leicht variierenden Dicke der verteilten Wasserschicht über dem Gitter, wobei die dickeren Bereiche in der Nähe der Mitte des Gitters und der Pinzettenspitze und die dünneren Bereiche in der Nähe der Peripherie des Gitters lagen. Diese Variation der Eisdicke ist wünschenswert und stellt sicher, dass auf jedem Gitter eine Mindestanzahl nutzbarer Quadrate vorhanden ist. Eine Optimierung der Sauggeschwindigkeit ist möglich, in unseren Händen jedoch nicht notwendig.

Da die visuelle Inspektion Vorkenntnisse über die Qualität und Verwendbarkeit der Gitter für Kryo-EM liefert, werden nur gute Gitter in das TEM übertragen und für die Datenerfassung verwendet und wir haben eine perfekte Ausbeute an Gittern, während wir die gelegentlichen Gitter, die sich nicht verhielten, verwerfen gut beim Ausdünnen, z. B. durch Biegen oder Bruch der Trägerfolie, vor dem Eintauchen. Bei gereinigten Protein- und Liposomenproben ist innerhalb eines einzelnen Rasters typischerweise ein Drittel der Quadrate (insbesondere rund um die Position der Saugrohre) zu trocken und für die Datenerfassung unbrauchbar, ein Drittel ist nutzbar (die überwiegende Mehrheit der Folienlöcher ist abgedeckt). mit Glaswasser) und ein Drittel hat ungefähr die gleiche Anzahl leerer und gefüllter Folienlöcher, sodass die nutzbare Anzahl der Quadrate pro Gitter zwischen 30 % und 60 % (n = 16) schwankt. Bei Gittern mit Bakterien und anhaftenden Zellen war die Ausbeute viel besser, da das Wasser um diese Strukturen herum besser zurückgehalten wird und sie weniger empfindlich gegenüber Austrocknung sind.

Während es wertvoll ist, Vorkenntnisse über die Dicke der Glaswasserschichten und die Verteilung und Menge der nutzbaren Oberfläche auf einem Gitter zu haben, bevor man Kryo-EM durchführt, ist dies nicht die einzige Voraussetzung für gut funktionierende, hochwertige nutzbare Gitter für die Datenerfassung . Darüber hinaus sind für die SPA-Datenerfassung die Probenqualität in Bezug auf bevorzugte Orientierung, Aggregation, Konzentration auf der Gitteroberfläche und Proteinzerstörung35 wichtige Parameter zur Optimierung des Gitters, die sich der lichtmikroskopischen Erkennung zu entziehen scheinen. Es schien, dass mit dem aktuellen Lichtmikroskop-Aufbau eine ausgedehnte Ansammlung von Proteinen oder Vesikeln auf dem Gitter beobachtet werden konnte, höchstwahrscheinlich durch Dickenschwankungen der Wasseroberfläche. Wir haben dies nicht ausführlicher untersucht, möchten jedoch darauf hinweisen, dass LM-Techniken zur Untersuchung der Proteinaggregation vorgeschlagen werden36,37 und die Verwendung zusätzlicher spektroskopischer oder Fluoreszenz-LM-Methoden während der Probenvorbereitung dünner Filme eine Untersuchung wert sein könnte.

Im Gegensatz zu anderen kürzlich entwickelten Probenvorbereitungsgeräten29 haben wir nicht versucht, die Menge der verwendeten Probe für die Anwendung auf dem Gitter zu minimieren. Stattdessen haben wir uns hier für die Entwicklung eines Geräts mit breiter Anwendbarkeit entschieden und daher dessen Verwendbarkeit für eine Vielzahl unterschiedlicher Proben bewertet. Apoferritin wurde als SPA-Workflow-Standard verwendet, um die Auflösung der Rekonstruktion zu beurteilen. Mit einer einzigen Vitrifikationssitzung konnten wir neun Gitter mit drei Proben vorbereiten, von denen wir eines ohne Optimierung der Eisdicke für eine Datenerfassung über Nacht verwendeten, die zu einer 3D-Karte mit einer Auflösung von 2,4 Å führte. Wir haben auch DNA-Origami-Würfelproben für Kryo-ET vorbereitet. Es ist bekannt, dass diese Art von Proben leicht aggregieren und an Luft-Wasser-Oberflächen haften bleiben. Unsere Experimente lieferten im Vergleich zu Experimenten mit anderen Vitrifikationsgeräten sehr ähnliche Ergebnisse. In derselben Sitzung haben wir auch Proben für die Kryo-EM an verschiedenen Arten von Liposomen vorbereitet, was gezeigt hat, dass diese Proben ohne großen Aufwand und Optimierung einfach vorbereitet werden können. Noch wichtiger ist, dass neben der Partikelsuspension auch Bakterien- und Zellzellen für die Kryo-EM- und Kryo-CLEM-Bildgebung vorbereitet werden konnten. Die vorbereiteten Proben und Kryo-EM-Ergebnisse waren alle nicht von denselben Proben zu unterscheiden, die mit dem Leica EM GP und dem Thermo Fisher Scientific Vitrobot Mark IV vorbereitet wurden, trotz der großen Unterschiede in Design und Automatisierungsgrad.

Aus Gründen der biologischen Sicherheit ist es wichtig, die Freisetzung schädlicher Substanzen zu verhindern. Außerdem ist es wichtig, eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu vermeiden. Wir haben festgestellt, dass es ohne ordnungsgemäße Reinigung der Pinzettenspitzen oder Austausch der Saugrohre zu einer Kreuzkontamination von Proben zwischen später hergestellten Gittern kommen kann. Die Reinigung und Dekontamination kann durch eine Kombination aus Wechselelementen, Spülungen und Hochtemperatur-Autoklaviermaßnahmen erreicht werden. Die Probentauchbehälter sowie die Probenaufnahmekartuschen sind austauschbar und können autoklaviert oder entsorgt werden. Alle Silikonschläuche sind Einwegschläuche und können problemlos ausgetauscht werden. Die Bestückung der Tauchbäder ist flexibel und Spül- oder Reinigungsschritte für die Pinzettenspitze können in der Software konfiguriert und automatisiert werden. Die Pinzetteneinheit, der rostfreie Saugschlauch und die mechanischen Module, die sich während des Saugvorgangs in unmittelbarer Nähe der Probe befinden, können einfach ausgetauscht oder entfernt und autoklaviert werden. Die Feuchtigkeitskammer kann beispielsweise mit Isopropylalkohol, Aceton oder Ethanol gespült werden und das Design verfügt über große Radien, um die Reinigung zu erleichtern. Obwohl es nicht Teil des in diesem Artikel getesteten Prototyps war, haben wir HEPA-Filter und beheizte Hochtemperatur-Abgaskanäle (~200 °C) hinzugefügt und getestet, um biologisch aktive Komponenten in neueren Versionen zu inaktivieren.

Das in diesem Artikel vorgestellte Gerät ist hochgradig automatisiert und während der Vorbereitung ist nur eine Benutzerinteraktion erforderlich, um den gewünschten Zeitpunkt für das Eintauchen zu bestimmen. Zukünftige Entwicklungen umfassen die automatische Erkennung des optimalen Zeitpunkts für die Vitrifizierung. Die hier berichteten experimentellen Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Dünnfilm-Interferenzstreifen, die erscheinen, sich verändern und verschwinden, während die Schichtdicke verringert wird, einen direkten und klaren Hinweis auf die resultierende Filmdicke nach der Vitrifizierung der Probe liefern und anhand derer sie leicht beurteilt werden können der Benutzer. Während im aktuellen Setup die Entscheidung, wann ein Sprung erfolgt, vom Benutzer getroffen wird, gehen wir davon aus, dass diese Entscheidung in Zukunft über ein konventionelles oder KI-basiertes Bildverarbeitungssystem umgesetzt wird. Darüber hinaus konnte mit der spektral aufgelösten Detektion und Analyse die quantitative Dicke des Flüssigkeitsfilms optisch bestimmt werden, wodurch der Vitrifizierungsprozess völlig benutzerunabhängig wurde.

Pferdemilz-Apoferritin wurde von Sigma (9013-31-4) gekauft und unmittelbar vor der Vitrifizierung durch Gelfiltration auf einer Superdex 200-Erhöhungssäule 3,2/300 (Cytiva) in 150 mM NaCl gereinigt. 25 mM Tris pH 7,5, 2 mM DTT-Puffer. Die Peakfraktion wurde gesammelt und zur Probenvorbereitung in einer Endkonzentration von 2,5 µM verwendet.

Liposomen, die Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), Dimyristoylphosphatidylglycerin (DMPG), Cholesterin und DNP-cap-PE (44:5:50:1 Mol-%) enthalten, wurden wie bereits 2019 von Lubbers et al. beschrieben hergestellt. 38. Lipide (Avanti Polar Lipids, AL, USA) wurden in Chloroform-Methanol (9:1 v/v) gelöst und über Nacht unter einem Stickstoffgasstrom getrocknet. Durch Rehydratisieren des Lipidfilms in 20 mM Sulforhodamin B (S1402; Sigma Aldrich, Missouri, USA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, bei 37 °C für 30 Minuten wurde eine endgültige Lipidkonzentration von 0,8 mg/ml erhalten . Die rehydratisierte Lipidmischung wurde 5 Minuten lang bei 37 °C beschallt, um Liposomen zu bilden, die mittels Größenausschlusschromatographie unter Verwendung einer vorgepackten NAP-25-Säule (17-0852-01; GE Healthcare, Little Chalfont, UK) gereinigt wurden. Liposomen wurden mit 5 µg/ml monoklonalen IgG1-DNP-Antikörpern gemischt39.

Liposomales Amphotericin B (Ambisome®) wurde in den zuvor beschriebenen Formulierungen40,41 nach 10-facher Verdünnung in Wasser verwendet.

DNA-Origami-Würfel wurden mit TALOS42 unter Verwendung der Standardwürfelvoreinstellungen mit einer Kantenlänge von 84 Nukleotiden entworfen. Faltungslösungen wurden in PCR-Röhrchen durch Mischen von M13mp18-ssDNA (20 nM, Bayou Biolabs) mit den entsprechenden ssDNA-Klammern (200 nM jeder Klammer, Integrated DNA Technologies; siehe Ergänzende Daten 1), ergänzt mit 20 mM MgCl2, in einem Gesamtvolumen von 50 hergestellt μL. DNA-Origami-Würfel wurden in einem Bio-Rad C1000 Touch™ Thermal Cycler unter Verwendung des folgenden Protokolls thermisch getempert: 80 °C bis 76 °C mit einer Geschwindigkeit von 5 Min./°C, 75 °C bis 30 °C mit einer Geschwindigkeit von 13,75 Min./0,5 °C, 29 °C bis auf 20 °C mit einer Geschwindigkeit von 10 Min./°C. Zehn 50-μl-Faltungslösungen wurden gepoolt und anschließend unter Verwendung von Amicon® ultra 0,5-ml-Zentrifugalfiltern (MWCO: 100 kDa) gereinigt und konzentriert.

17Clone1-Mauszellen wurden wie zuvor beschrieben43 hergestellt und 1 Stunde lang mit MitoTracker™ (M7514, Invitrogen) in einer Endkonzentration von 0,5 µM aus einer 1 mM Stammlösung in DMSO fluoreszierend markiert. Alle Proben wurden auf Quantifoil 300-Mesh-Kupfergittern mit R2/2-Kohlenstofffilm vorbereitet.

Die Gitter wurden in einen Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) geladen, der bei 300 kV betrieben wurde und mit einem Gatan K3 BioQuantum-Direktelektronendetektor ausgestattet war. Filme mit 50 Bildern und einer akkumulierten Dosis von 65 e/Å2 wurden im Zählmodus mit der EPU-Software (Thermo Fisher Scientific) bei einer Vergrößerung von ×105.000 aufgenommen, was einer kalibrierten Pixelgröße von 0,836 Å/Pixel mit einem Defokussbereich von − entspricht 0,6 bis −2,5 µm. Insgesamt 2348 Filme wurden in zwei Mikroskopiesitzungen am Niederländischen Zentrum für Elektronennanoskopie (NeCEN) gesammelt. Detaillierte Datenerfassungsparameter sind in der ergänzenden Abbildung 1 und der ergänzenden Tabelle 1 zusammengefasst.

Für die gesamte Bildverarbeitung wurde die Beta-Software RELION-3.144,45 verwendet. Kurz gesagt, die gesammelten Filme wurden einer strahlinduzierten Driftkorrektur mit MotionCor246 unterzogen, die Kontrastübertragungsfunktion wurde mit CTFFIND-4.1.1847 geschätzt. Mit dem Gauss-Picker von RELION wurden automatisch 689.633 Partikel ausgewählt. Nach zwei Runden der 2D-Klassifizierung wurden falsch positive Ergebnisse und kontaminierende Merkmale verworfen, was zu einem Datensatz mit 91.000 Partikeln führte. Als Referenz für die 3D-Verfeinerung wurde eine zuvor ermittelte, auf 40 Å gefilterte Apoferritin-Karte verwendet. Der endgültige Satz von 91.000 Partikeln wurde einer CTF-Verfeinerung für optische und Strahlneigungs-Aberrationskorrekturen sowie einer Defokussierung pro Partikel und einer Astigmatismuskorrektur pro Mikrograph unterzogen, gefolgt von einer Bayes'schen Politur45,48. Anschließend wurde eine zweite 3D-Verfeinerung durchgeführt, die eine 2,4 Å-Karte ergab. Die Kartenauflösungen wurden anhand des 0,143-Kriteriums der phasenrandomisierungskorrigierten FSC-Kurve geschätzt, die zwischen zwei unabhängig verfeinerten Halbkarten multipliziert mit einer Lösungsmittelmaske mit weichen Kanten berechnet wurde. Die endgültigen Rekonstruktionen wurden in der RELION-Nachbearbeitung geschärft und lokal gefiltert. Das Röntgenmodell von Pferdemilz-Apoferritin (PDB-Eintrag 6RJH49) wurde mithilfe der Funktion „In Karte anpassen“ in UCSF Chimera50 Version 1.13.1 in die EM-Dichte eingepasst, nachdem die Pixelgröße der EM-Karte von 0,836 auf 0,82 Å/Pixel verringert wurde für eine bessere Passform. Karten wurden mit UCSF 1.13 und ChimeraX51 angezeigt.

Kryo-EM-Bilder wurden auf einem FEI Tecnai T12 Biotwin mit LaB6-Quelle, betrieben bei 120 keV, auf einer FEI Eagle 4k × 4k CCD-Kamera und unter Verwendung eines Gatan 626-Kryohalters mit seitlichem Eingang aufgezeichnet. Zur Korrelation mit dem zuletzt aufgezeichneten LM-Bild vor der Vitrifizierung wurden Bilder mit geringer Vergrößerung (<×200) von Hand aufgenommen, die das gesamte Gitter abdeckten. Zusammengesetzte Bildübersichten des gesamten Rasters und Überlagerungen mit den LM-Bildern wurden in Adobe Photoshop erstellt.

Kryo-ET wurde auf einem Titan Krios (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt, der bei 300 kV betrieben und mit einem Gatan K3 BioQuantum-Direktelektronendetektor ausgestattet war. Neigungsserien wurden mit der TOMO 4-Software (Thermo Fisher Scientific) zwischen –56° und +56° mit einem Neigungsschritt von 2°, beginnend bei 0°, mit einer Gesamtdosis von 100 e/Å2 und 16 Bildern pro Bild bei a aufgezeichnet Nennvergrößerung von ×19.500, entsprechend einer kalibrierten Pixelgröße von 4,4 Å/Pixel mit einer Defokussierung von –7 µm. Kryo-Elektronentomographie-Neigungsserien wurden mit der IMOD-Software rekonstruiert52,53. Oberflächenrenderings wurden von Hand mit der Amira-Software (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt.

Cryo-LM wurde auf einem Zeiss Axioimager M2 durchgeführt, der mit einem Linkam CMS196M ausgestattet war. Transparente Licht- und Fluoreszenzbildstapel (21 Schichten alle 75 µm), die wir mit einem EC PlanNeofluor ×10/0,30 Ph1-Objektiv auf einer AxioCam MR R3 bei einer Pixelgröße auf Probenebene von 1 µm × 1 µm aufgenommen haben. Hellfeldbilder wurden mit einer LED-Lichtquelle und Fluoreszenzbilder mit einer HXP 120 V-Lichtquelle und einem 38 HE-Filtersatz aufgenommen. Maximalintensitätsprojektionen für beide Bildstapel wurden mit der Zeiss ZEN 3.4-Software erstellt und Überlagerungen wurden in Adobe Photoshop 2021 erstellt. Cryo-CLEM wurde auf einer Talos Arctica (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt, die bei 200 keV betrieben wurde und mit einem Gatan K3 BioQuantum-Direktelektronengerät ausgestattet war Detektor. Korrelationen wurden durchgeführt und Bilder wurden mit der MAPS-Software (Thermo Fisher Scientific) aufgezeichnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in dieser Studie erstellte Apoferritin-Kryo-EM-Karte wurde in der EMDB unter dem Zugangscode EMD-13738 hinterlegt. Videovisualisierungen wurden mit Adobe Premiere Pro, Maxon Cinema 4D und Maxon Redshift erstellt und sind als Ergänzungsfilme 1 und 2 verfügbar. Die Daten, die diese Studie unterstützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Meindert Lamers, Willem Noteborn, Leoni Abendstein und Georg Wolff (CCB, LUMC) für die Vorbereitung der Proben. Diese Arbeit profitierte vom Zugang zum Niederländischen Zentrum für Elektronennanoskopie (NeCEN) an der Universität Leiden, einem Instruct-ERIC-Zentrum. Die Elektronenmikroskopie in dieser Arbeit ist Teil des Forschungsprogramms National Roadmap for Large‐Scale Research Infrastructure (NEMI), Projektnummer 184.034.014, das vom niederländischen Forschungsrat (NWO) finanziert wird.

Elektronenmikroskopie, Zell- und chemische Biologie, Medizinisches Zentrum der Universität Leiden, Postfach 9600, 2300, RC, Leiden, Niederlande

Roman I. Koning & Abraham J. Koster

Linkam Scientific Instruments Ltd, Tadworth, Surrey, KT20 5LR, Großbritannien

Hildo Vader, Martijn van Nugteren, Peter A. Grocutt, Arnold CF Kamp & Michael Schwertner

NeCEN, Institut für Biologie Leiden, Universität Leiden, Gorlaeus-Gebäude, Einsteinweg 55, 2333, CC, Leiden, Niederlande

Wen Yang & Ludovic LR Renault

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RIK: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, Untersuchung, Schreiben – Originalentwurf, Visualisierung, Überwachung. MvN: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, Untersuchung. HV: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, Untersuchung. PAG: Software. AJK: Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Finanzierungsbeschaffung. AK: Konzeption, Methodik, Betreuung, Fördermittelakquise. WJ: SPA-Datenerfassung. LLRR: Datenanalyse. MS: Konzeptualisierung, Methodik, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Supervision.

Korrespondenz mit Roman I. Koning.

Linkam Scientific Instruments Ltd. erhielt das europäische Patent EP3018467 A1 „Mikroskopische Probenvorbereitung“ (Erfinder ACFK, MvN, HV, RIK und MS); PAG ist Mitarbeiter von Linkam Scientific Instruments; ACFK ist Eigentümer von Linkam Scientific Instruments Ltd., Großbritannien. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt Radostin Danev und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Koning, RI, Vader, H., van Nugteren, M. et al. Automatisierte Vitrifizierung von Kryo-EM-Proben mit kontrollierbarer Probendicke mittels Absaugung und optischer Echtzeitprüfung. Nat Commun 13, 2985 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30562-7

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Eingegangen: 02. Dezember 2021

Angenommen: 26. April 2022

Veröffentlicht: 27. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30562-7

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