Detaillierte Analyse der verzerrten Netzhaut und ihrer Wechselwirkung mit umgebenden Resten im K-Intermediat von Bakteriorhodopsin

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 190 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das K-Zwischenprodukt des protonenpumpenden Bakteriorhodopsins ist das erste Zwischenprodukt, das nach der Isomerisierung von Retinal zur 13-cis-Form entsteht. Obwohl bisher verschiedene Strukturen für das K-Intermediat beschrieben wurden, unterscheiden sich diese voneinander, insbesondere hinsichtlich der Konformation des retinalen Chromophors und seiner Wechselwirkung mit umgebenden Resten. Wir berichten hier über eine genaue röntgenkristallographische Analyse der K-Struktur. Es wird beobachtet, dass die Polyenkette von 13-cis-Retinal S-förmig ist. Die Seitenkette von Lys216, die über die Schiff-Base-Bindung kovalent an Retinal gebunden ist, interagiert mit den Resten Asp85 und Thr89. Darüber hinaus interagiert das Nζ-H der protonierten Schiff-Base-Bindung mit einem Rest, Asp212, und einem Wassermolekül, W402. Basierend auf quantenchemischen Berechnungen für diese K-Struktur untersuchen wir die stabilisierenden Faktoren der verzerrten Konformation von Retinal und schlagen einen Relaxationsweg zum nächsten L-Zwischenprodukt vor.

Bacteriorhodopsin (bR) ist eine lichtbetriebene Protonenpumpe, die in der Plasmamembran eines Archaeons, Halobacterium salinarum1,2, vorkommt und derzeit eines der am intensivsten untersuchten Membranproteine3,4 ist. Ähnliche mikrobielle Rhodopsine, die als Ionenpumpen, Kanäle und Sensoren fungieren, wurden nicht nur in Archaeen, sondern auch in Bakterien, Pilzen und sogar Viren entdeckt5,6,7. Alle diese Proteine, wie bR8, haben sieben Transmembranhelices und ein zentrales retinales Chromophor. Retinal hat ein Polyen-Rückgrat mit langen konjugierten Doppelbindungen. Im Fall von bR bildet der retinale Chromophor eine Schiff-Base (SB)-Bindung mit einem Lysinrest an Position 216 (Lys216). Retinal nimmt im lichtadaptierten Ruhezustand eine all-trans-Konformation ein. Die Lichtabsorption bewirkt die Isomerisierung einer Doppelbindung an C13–C14 von Retinal von einer trans- in eine cis-Konformation. Die strukturellen Veränderungen werden auf den Proteinanteil übertragen und die entsprechenden Funktionen werden ausgedrückt.

Im Fall von bR findet ein Reaktionszyklus statt, in dem nacheinander eine Reihe von Zwischenprodukten (I, J, K, L, M, N, O) erzeugt werden. Im Reaktionszyklus von bR wird ein einzelnes Proton von der Innenseite zur Außenseite der Plasmamembran transportiert. Das K-Zwischenprodukt, das durch einen Absorptionspeak bei 590 nm bei Raumtemperatur gekennzeichnet ist9, ist das erste Zwischenprodukt, das nach der Isomerisierung von Retinal zur 13-cis-Form entsteht. Das K-Zwischenprodukt kann durch die Lichtbestrahlung bei kryogenen Temperaturen eingefangen werden10. Es wurde gezeigt, dass das bei kryogenen Temperaturen erzeugte K-Zwischenprodukt nahezu die gleichen Eigenschaften in den Schwingungsbändern aufweist wie diejenigen, die vorübergehend bei Raumtemperatur erzeugt werden11,12. Die Struktur des K-Zwischenprodukts wurde zunächst mithilfe der Kryo-Trapping-Technik in Kombination mit Röntgenkristallographie untersucht (Ergänzungstabelle 1). Die Struktur wurde auch mittels zeitaufgelöster serieller Femtosekunden-Kristallographiestudien (TR-SFX) untersucht17, 18, 19 (Ergänzungstabelle 1). Diese Untersuchungen ergaben, dass die strukturellen Veränderungen bei der Bildung des K-Intermediats gering sind und sich immer noch auf die Umgebung der Netzhaut beschränken. Daher ist das K-Intermediat ein interessantes Forschungsthema mit dem Potenzial, Einblicke in die Speicherung und Ausbreitung von Energie in Proteinen zu liefern. Es lassen sich jedoch viele Inkonsistenzen zwischen den zuvor berichteten K-Strukturen in der Konformation von Retinal und den Details seiner Wechselwirkung mit umgebenden Resten feststellen. Aus diesem Grund sind die entscheidenden Punkte bei der Speicherung und Ausbreitung von Energie innerhalb von Proteinen noch immer kaum verstanden, obwohl eine Schätzung der gespeicherten Energie von ~50 kJ/mol20 vorgenommen wurde.

Die Fähigkeit, Zellen durch Licht zu manipulieren, hat kürzlich zur Verwendung lichtgesteuerter Rhodopsine für die gezielte Aktivierung von Neuronen und anderen Zellen durch Optogenetik geführt21,22. Darüber hinaus wurden umfangreiche Studien zur Verwendung von bR in Fotomaterialien durchgeführt23,24. Im Hinblick auf die Entwicklung von Anwendungen mit Rhodopsinen und anderen photoaktiven Proteinen ist es wichtig, den Mechanismus aufzuklären, durch den die Photoisomerisierung des Chromophors in funktionelle Bewegungen in Proteinen umgesetzt wird. Daher haben wir uns in dieser Studie auf bR konzentriert, eines der am besten untersuchten photoaktiven Proteine, und eine hochauflösende Strukturanalyse durchgeführt, um die Konformation seines retinalen Chromophors und die Wechselwirkungen mit der Proteinumgebung im K-Intermediat genau zu bestimmen.

Um das K-Zwischenprodukt anzusammeln, verwendeten wir ein Kryo-Einfangverfahren, bei dem ein lichtadaptierter bR-Kristall mit grünem Licht bei 100 K bestrahlt wurde (Abb. 1a). Beugungsdaten eines Kristalls, der das K-Zwischenprodukt bei ~1,3 Å enthielt, wurden bei 15 K mit einer absorbierten Dosis von 0,05 MGy gesammelt. Dieser Absorptionsdosiswert betrug ein Drittel des Grenzwertes bei 15 K25. Anschließend wurden Beugungsdaten des Grundzustands desselben Kristalls nach Bestrahlung mit rotem Licht gesammelt. Der durchschnittliche I/σ(I)-Wert für die höchste Schale (1,42–1,33 Å) war ein ausreichend hoher Wert von ~1,4, wenn die Auflösungsgrenze als Schale mit CC1/2 von ~0,5 bestimmt wurde (Tabelle 1). Wie in früheren Studien wurden in der Differenz-Fourier-Karte signifikante Dichten nur um die Netzhaut herum beobachtet (Abb. 1b). Andererseits wurden in den von der Netzhaut entfernten Regionen, wie der Protonenaufnahmestelle, der Protonenfreisetzungsstelle oder der Oberfläche des Proteins, keine unterschiedlichen Elektronendichten beobachtet. Die stärksten positiven und negativen Dichten wurden um die SB-Bindung und das C20-Atom von Retinal beobachtet (Abb. 1c). Darüber hinaus wurden Paare relativ starker Dichten an den C14- und C15-Atomen beobachtet. Es wurden auch relativ hohe Dichten beobachtet, die Veränderungen in einzelnen Atomen der anderen Teile des Retinals, der Seitenkette von Lys216 und den umgebenden Resten entsprachen. Daher war es möglich, die Struktur des K-Zwischenprodukts eindeutig zu bestimmen (ergänzende Abbildung 1).

a Photoisomerisierung von Retinal. All-trans-Retinal, das über die SB-Bindung mit Lys216 von bR verbunden ist, isomerisiert durch Absorption von grünem Licht zu 13-cis-Retinal. Eine Rückreaktion wird durch die Absorption von rotem Licht verursacht. b Eine Gesamtansicht der Differenzkarte F(K + bR) − F(bR). Die unterschiedlichen Elektronendichten auf den Niveaus +4σ und −4σ werden als grüne bzw. rote Netze dargestellt. Die Struktur von bR wird als Röhre in Grau dargestellt, während Netzhaut als Stäbchen in Dunkelgrau dargestellt wird. c Eine Nahaufnahme des retinalen Chromophors. Die K-Struktur wird als farbige Stäbchen dargestellt, während die Grundzustandsstruktur als graue Stäbchen dargestellt wird. Die F(K + bR) − F(bR)-Differenzkarte wird als grüne und rote Netze bei Konturniveaus von ±3σ angezeigt. Die aus den extrapolierten Daten berechnete Auslassungskarte für Netzhaut und die Lys216-Seitenkette wird als graue Netze auf einer Konturebene von +3σ überlagert.

Wir konnten Daten mit der gleichen Auflösung von einem anderen Kristall sammeln (Ergänzungstabelle 2). Mithilfe der Daten haben wir eine nahezu identische Differenz-Fourier-Karte erhalten (ergänzende Abbildung 2a, b). Darüber hinaus zeigte die Differenz-Fourier-Karte bei der ersten Erfassung der Grundzustandsdaten vor den K-Zustandsdaten nahezu die gleichen Dichten wie in den obigen Fällen (ergänzende Abbildungen 2c, d). Diese Tatsache weist darauf hin, dass die Abhängigkeit von der Messreihenfolge für die Strukturänderungen zwischen bR und K nicht so groß ist, wie aus spektroskopischen Messungen hervorgeht26. Es zeigt auch, dass die Röntgenstrahlen bei einer Gesamtdosis von ~0,1 MGy keine schädlichen Auswirkungen hatten. Die drei K-Strukturen sollen gemäß der Überlagerung tatsächlich nahezu identisch sein (Ergänzende Abbildung 3), obwohl sich nur die Form der EF-Schleife in Kristall II von den beiden anderen unterscheidet. Dies kann auf den Unterschied in der Gitterkonstante der c-Achse zurückzuführen sein (Ergänzungstabelle 2). Tatsächlich beträgt die mittlere quadratische Abweichung (rmsd) zwischen K in Kristall II und K in Kristall I 0,9 Å und ist damit größer als 0,4 Å des rmsd zwischen K in Kristall III und K in Kristall I.

Was den Grundzustand betrifft, wurden Röntgenbeugungsdaten von Kristall I und II nach der Aktivierung mit grünem Laser und anschließender Wiederherstellung mit rotem Laser gemessen, während Daten von Kristall III vor der Aktivierung gemessen wurden. Dennoch sind auch drei Strukturen nahezu identisch wie im Fall der K-Strukturen (Ergänzende Abbildung 4a – c). Dies bedeutet, dass der Aktivierungsprozess keinen Einfluss auf die Grundzustandsstruktur hat. Diese Implikation wird auch durch die Tatsache gestützt, dass die Differenz-Fourier-Karte zwischen den Daten von Kristall I und Kristall III keine signifikanten Dichten um die Netzhaut und den Protonenkanal zeigt (ergänzende Abbildung 4d-f).

Durch die Anpassung der Struktur des Retinals an die Elektronendichte mit hoher Auflösung war es möglich, die Konformation des Retinals mit hoher Genauigkeit zu bestimmen. Die Standardabweichungen der Diederwinkel der Polyenkette betrugen in der K-Struktur ~10°. Die Polyenkette biegt sich weitgehend zur Helix-F-Seite in der Nähe des C14-Atoms, und die C13-C20-Bindung neigt sich zur Tyr185-Seite der Helix F (Abb. 2a). Andererseits biegt sich die Polyenkette gegen die Helix B in der Nähe des C9-Atoms. Infolgedessen ist das 13-cis-Retinal im K-Intermediat von der zytoplasmatischen Seite aus gesehen S-förmig gekrümmt. Diese Netzhautkonformation könnte eine sehr gute Erklärung für die unterschiedlichen Elektronendichten auf der Differenz-Fourier-Karte liefern. Beim Vergleich der Torsionswinkel zwischen bR und K wurde der signifikanteste Unterschied in der C13-C14-Bindung festgestellt, die bei der trans-cis-Isomerisierung auftritt (Abb. 2b). Allerdings betrug der Unterschied ~120°, nicht 180°. Aufgrund von Änderungen in anderen Bindungen ändert sich die Ausrichtung der Nζ-H-Bindung in K letztendlich nur um 24° gegenüber der im Grundzustand. Diese kleine relative Änderung stimmte mit einem früheren polarisierten FTIR-Ergebnis von ~25° überein, wohingegen die absoluten Winkel von der Membrannormalen nicht übereinstimmten27. Der nächstgrößte Unterschied in der Polyenkette wurde im Torsionswinkel der C15-Nς-Bindung gefunden. Darüber hinaus wurden kleine signifikante Veränderungen bei den meisten anderen Torsionswinkeln in der Polyenkette der Netzhaut festgestellt. Die Differenz-Fourier-Karte zeigte, dass sich die Position des β-Iononrings aufgrund der S-förmigen Kurve des Polyens leicht in Richtung SB verschiebt (Abb. 1c). Was die Seitenkette von Lys216 betrifft, die die SB-Bindung mit Retinal bildet, zeigten die Torsionswinkel für die Cε-Nζ- und Cδ-Cε-Bindungen trotz der Einfachbindung keine signifikanten Abweichungen vom Grundzustand, was auf eine Stabilisierung durch Wechselwirkungen mit der Umgebung hinweist Rückstände.

ein S-förmiges Polyen-Rückgrat aus Netzhaut, gesehen vom oberen Teil von Abb. 1b. Die Karten werden auf die gleiche Weise wie in Abb. 1b dargestellt. b Torsionswinkel entlang der retinalen Polyenkette in der K-Struktur (7XJC) sind in Magenta aufgetragen. Die Standardabweichungen, die aus drei Strukturen berechnet wurden, sind als Fehlerbalken auf den als Hohlkreise dargestellten Mittelwerten angegeben. Die Werte für die jeweiligen Strukturen werden als Kreuze dargestellt. Die Werte sind in der Ergänzungstabelle 4 zu finden. Die Werte für die Grundzustandsstruktur in dieser Arbeit (7XJD) und eine aktuelle L-Struktur16 sind in Grau bzw. Schwarz dargestellt. Die schwarzen horizontalen Linien geben Winkel mit lokalen minimalen Energien für die jeweiligen Torsionen an.

Obwohl sich die Strukturveränderungen auf die Umgebung von Retinal beschränken, konnten atomare Details der Strukturveränderung bei der Bildung des K-Intermediats deutlich in den umgebenden Resten beobachtet werden. Für die Seitenkette von Lys216 bewegen sich Cε und Cδ zusätzlich zu Nς von SB in Richtung Helix G (Abb. 3a). Entlang der Hauptkette der Reste in Helix G von Phe208 bis Gly218 wurden schwache Differenzdichten beobachtet. Durch die Kippung der C13-C20-Bindung bewegt sich Tyr185 in Richtung Leu211 und induziert die Bewegung von Leu211 (Abb. 2a und Abb. 3b). Die Seitenkette von Trp86 dreht sich um die Cα-Cβ-Achse und füllt den konkaven Teil des Retinals, der durch die trans-cis-Isomerisierung entsteht (Abb. 3b). Auch die Seitenketten von Arg82 und Phe208 werden durch die Bewegung verschoben. Ser141 in Helix E und Pro186 in Helix F bewegen sich in Richtung des Iononrings von Retinal (Abb. 3c). Darüber hinaus bewegen sich auch mehrere Reste, die zu Helix E (Ala139–Thr142) und Helix F (Leu181–Val187) gehören, leicht mit. Die strukturellen Veränderungen in den Hauptketten der Helices E, F und G können mit Peptidbanden zusammenhängen, die gegenüber dem in den Differenz-FTIR-Spektren beobachteten H/D-Austausch unempfindlich sind28.

a Ein Querschnitt der Netzhaut an der SB-Verbindung. Die F(K + bR) − F(bR)-Differenzkarte wird als grüne und rote Netze bei Konturniveaus von ±3σ angezeigt. Die K-Strukturen werden als farbige Stäbchen dargestellt. Die Grundzustandsstruktur ist als graue Stäbchen überlagert. b Ein Querschnitt der Netzhaut in der Mitte des Polyen-Rückgrats. c Ein Querschnitt der Netzhaut am β-Ionon-Ring. d Die Karte um Asp85. e Die Karte um Asp212. f Die Karte um Asp115.

Der Wasserstoffbrückenabstand zwischen Asp85 und Thr89 wird selbst durch die Bewegung der Seitenkette von Thr89 in Richtung Netzhaut bei der Bildung des K-Zwischenprodukts nur geringfügig verkürzt (Abb. 3d). Der Wasserstoffbrückenabstand zwischen Asp85 und W402 nimmt im Vergleich zur Grundzustandsstruktur zu. Andererseits verkürzt sich der Abstand zwischen Asp212 und W402 auf 3,08 Å, obwohl der Abstand im Grundzustand 3,40 Å beträgt (Abb. 3e). Der Abstand zwischen Lys216 und Asp212 wird zusätzlich zur Isomerisierung von Retinal auch durch die Rotation um die Cβ-Cγ-Bindung von Asp212 von 3,93 Å für den Grundzustand auf 3,27 Å für K verkürzt. Es ist zu beachten, dass in einer TR-SFX-Studie eine ähnliche Rotation bei Asp212 bei früheren I- und J-Intermediaten, jedoch nicht bei K, beobachtet wurde18. Ein protoniertes Aspartat, Asp115, in der Nähe der Netzhaut scheint keine direkte Beteiligung am Protonenpumpen zu haben. Asp115 bildet mit Thr90 zwei Wasserstoffbrückenbindungen, sowohl im Grundzustand als auch im K-Intermediat (Abb. 3f). Die Art der Wasserstoffbrückenbindung ändert sich jedoch geringfügig durch die Bewegung von Asp115. Dies könnte einer Änderung in der Umgebung von Asp115 entsprechen, die durch ein früheres FTIR-Ergebnis29 nahegelegt wurde.

Aufgrund der großen Positionsänderungen von C20 durch die Isomerisierung von Retinal verringert sich der Abstand zwischen C20 und Cε1 von Tyr185 in Helix F von 4,25 Å im Grundzustand auf 3,45 Å (Abb. 4a und ergänzende Abb. 5a). Allerdings ändern sich die Abstände zwischen C13 und den Atomen von Tyr185 nicht wesentlich. Was die Art der Wechselwirkung zwischen C20 und Trp182 auf der zytoplasmatischen Seite der Netzhaut betrifft, so ist der Abstand zu Cδ1 von Trp182 von 3,76 Å auf 3,22 Å verringert, während der Abstand zwischen C20 und Nε1 von Trp182 nahezu unverändert bleibt. Energetisch ungünstige Wechselwirkungen mit kurzen Abständen werden in unserer K-Struktur nicht beobachtet. Daher kann davon ausgegangen werden, dass die zwischen Retinal und diesen umgebenden Resten beobachteten CH∙∙∙π- und π∙∙∙π-Wechselwirkungen attraktive Wechselwirkungen sind.

a Interatomare Abstände von <3,5 Å zwischen Retinal und den umgebenden Resten sind dargestellt, während die für den Grundzustand in Klammern stehen. Die gestrichelten Linien sind entsprechend den Abstandsänderungen bei der K-Bildung gefärbt, wobei Rot und Blau eine große (>0,2 Å) Abnahme bzw. große Zunahme anzeigen. b Wasserstoffbrückenbindungen mit Abständen <3.5 Å auf der EC-Seite der SB-Verknüpfung sind dargestellt, während diejenigen für den Grundzustand in Klammern stehen.

Bei der Wasserstoffbindung auf der EC-Seite der SB-Bindung zeigt nur Nζ von Lys216 signifikante Veränderungen bei der K-Bildung (Abb. 4b und ergänzende Abb. 5b). Obwohl der Abstand zwischen Nζ von Lys216 und Oδ1 von Asp212 im Grundzustand 3,93 Å beträgt, was auf keine signifikante Wechselwirkung hinweist, verringert er sich im K-Intermediat auf 3,27 Å. Der Abstand zwischen Nζ von Lys216 und W402 vergrößert sich um 0,28 Å auf 3,07 Å. Die σ-Werte der Unterschiede für diese beiden Abstände waren größer als 6. Andererseits waren die Werte für die anderen Wasserstoffbrückenbindungen kleiner als 3, was darauf hinweist, dass die Abstandsänderungen in diesen Wasserstoffbrücken vernachlässigbare Werte haben (Ergänzungstabelle 3). .

Bisher wurden für das K-Intermediat drei bzw. zwei Röntgenstrukturen beschrieben, die mit der Kryo-Trapping- bzw. TR-SFX-Technik bestimmt wurden13,14,15,16,17,18,19. Obwohl die Netzhautkonformation in den meisten Strukturen verzerrte Konformationen annahm, wie durch die spektroskopischen Daten vorhergesagt, zeigten diese Daten eine große Variation in den kristallographischen Strukturen (Abb. 5a). Der Grad des Unterschieds schien nicht von der Methode abzuhängen, die zur Herstellung des K-Zwischenprodukts verwendet wurde. Die größten Unterschiede wurden bei den Positionen der C13-, C14- und C20-Atome von Retinal gefunden. Infolgedessen betrug die Variation zwischen den verschiedenen Strukturen ~60° für C13-C14 und C15-Nζ, während die Variationen für die anderen Torsionswinkel ~40° für die Torsionswinkel der retinalen Polyenkette betrugen (ergänzende Abbildung 6). ). Diese Variationen waren deutlich größer als die für den Grundzustand, was auf das Fehlen zuverlässiger Strukturparameter für das K-Intermediat hinweist (Abb. 5b). In unserer Struktur betrugen die Torsionswinkel von C13–C14 und C15–Nζ –38° bzw. 143°, und die aus drei Strukturen (Kristalle I–III) berechneten Standardabweichungen betrugen 14° bzw. 11° (Ergänzungstabelle 4). ). Diese Werte standen im Mittelpunkt anderer Ergebnisse im Diagramm (Abb. 5b). Die nächstgelegenen Strukturen im Torsionswinkeldiagramm waren 6G7K18 und 1M0K14. Obwohl die Positionen der C13-, C14- und C20-Atome in 6G7K18 denen in unseren Ergebnissen nahe kamen, waren die in 1M0K14 ganz anders. Dieser Unterschied wurde durch die Planarität der Polyenkette zwischen C9 und C13 verursacht. Diese Abweichungen von 180° trugen auch zur Krümmung der Polyenkette bei, was zu der S-förmigen Konformation führte.

a Überlagerung verschiedener K-Strukturen. Kohlenstoffatome in 1QK0, berichtet von Edman et al.13, 1M0K von Schobert et al.14, 1IXF von Matsui et al.15, 6G7K von Nogly et al.18 und 6GA6 von Nass Kovacs et al.19, 7Z0C von Borshchevskiy et al al.16 und 7XJC, über die in dieser Arbeit berichtet wird, sind in Grün, Gelb, Cyan, Marineorange bzw. Magenta gefärbt, während Stickstoffatome (blau) gemeinsam sind. b Verteilung der Torsionswinkel konjugierter Doppelbindungen (C13−C14 und C15−Nς) im Netzhautgewebe. Die Torsionswinkel für die K-Strukturen sind als ausgefüllte Kreise in den gleichen Farben dargestellt, die auch für die Kohlenstoffatome in Tafel a verwendet werden, während die für die entsprechenden Grundzustandsstrukturen (1QKP13, 1M0L14, 1IW615, 6G7H18, 6RMK19, 7Z0916 und 7XJD) es sind als gefüllte Rauten dargestellt. Für die K- und Grundzustandsstrukturen in dieser Studie werden die aus jeweils drei Strukturen berechneten Standardabweichungen als Fehlerbalken auf den als Hohlkreise dargestellten Mittelwerten angezeigt. Datenpunkte für die jeweiligen Strukturen in dieser Studie werden als Kreuze dargestellt.

Aufgrund der unterschiedlichen Konformation von Retinal wurden auch signifikante Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen Retinal und den umgebenden Resten wie Trp182 und Tyr185 beobachtet (ergänzende Abbildung 7). Eine der K-Strukturen (1QK0)13 zeigte im Vergleich zu unserer Struktur die unterschiedlichste Wechselwirkungsweise (ergänzende Abbildung 7a). Andererseits schien eine andere K-Struktur (6G7K)18 unserer hinsichtlich der Wechselwirkungen um die Netzhaut am ähnlichsten zu sein, während zwischen Netzhaut und Tyr185 einige ungewöhnlich geringe Abstände gefunden wurden (ergänzende Abbildung 7d). Darüber hinaus wurde auch ein kurzer Abstand von 2,28 Å in der Wasserstoffbrücke zwischen Tyr185 und Asp212 beobachtet. Da die Positionen der Atome in der Netzhaut sehr ähnlich waren, war der Unterschied zu unserer K-Struktur auf den Grad der Strukturveränderungen in Tyr185 zurückzuführen (Abb. 4a und ergänzende Abb. 7d). Was 7Z0C16 betrifft, sind die Kristallgröße, die experimentellen Bedingungen und das Alter der Messung denen von 7XJC in dieser Studie sehr ähnlich. Dennoch gibt es nicht zu vernachlässigende Unterschiede an den Positionen der C13-, C14- und C20-Atome im Netzhautgewebe (Abb. 5a). Dies ist wahrscheinlich eher auf den Unterschied im Torsionswinkel der einzelnen Cε-Nζ-Bindung als auf den Unterschied in den Torsionswinkeln der konjugierten Doppelbindungen in der Polyenkette von Retinal zurückzuführen. Folglich ergab sich ein deutlicher Unterschied in der Ausrichtung des Nζ-H. Dies kann auch ein Grund für signifikante Unterschiede in der Interaktion mit Tyr185 sein (Abb. 4a und ergänzende Abb. 7f). Ein möglicher Grund für den Unterschied könnte die Anzahl der Wiederholungen der bR↔K-Änderung während der Messung der Beugungsdaten sein. Bei der Beugungsdatensammlung von 7XJC wurden zunächst die Beugungsdaten von mit grünem Licht bestrahltem K + bR gemessen, um die K-Struktur wie oben beschrieben möglichst frei von Röntgenschäden zu erhalten. Andererseits wurde in der Datenerfassung von 7Z0C das bR↔K viele Male mit wechselnden Winkeln wiederholt19.

Die Wasserstoffatom-komplementierte Struktur wurde mithilfe von QM/MM-Rechnungen ausgehend von unserer K-Struktur erhalten, um detaillierte Untersuchungen der Wechselwirkungen rund um die SB-Verknüpfung durchzuführen. Die optimierte Struktur wurde anhand des Diagramms der nichtkovalenten Wechselwirkung (NCI) untersucht, bei dem es sich um eine Isofläche des reduzierten Dichtegradienten handelt, der aus einer Elektronendichte ρ31,32 berechnet wurde. Im NCI-Diagramm gab es eine bläulich-grüne Oberfläche zwischen dem Amid-Proton auf Nζ von Lys216, das die SB-Bindung bildet, und Oδ1 von Asp212, was auf das Vorhandensein einer relativ starken Wechselwirkung hinweist (Abb. 6a). Diese Wechselwirkung könnte durch die elektrostatische Anziehung zwischen der positiven Ladung bei Nζ von Lys216 und der negativen Ladung bei Oδ1 von Asp212 noch verstärkt worden sein. Darüber hinaus wurde auch die Wechselwirkung zwischen Nζ von Lys216 und W402 als bläulich-grüne Oberfläche beobachtet. Andererseits gab es grüne Oberflächen zwischen den Methylenwasserstoffatomen der Cε von Lys216 und den Sauerstoff- und Wasserstoffatomen von Thr89, was auf das Vorhandensein attraktiver Van-der-Waals-Wechselwirkungen hinweist. Darüber hinaus wurde eine grüne NCI-Oberfläche zwischen dem Cε von Lys216 und dem Oδ1 von Asp85 beobachtet, was auf eine Wasserstoffbindung vom Typ CH∙∙∙O schließen lässt33. Daher wurde vermutet, dass die Rotation der Cε-Nζ- und Cδ-Cε-Bindungen durch diese Wechselwirkungen zwischen Cε und Nζ von Lys216 und den umgebenden Resten gehemmt wird (Abb. 6b). Tatsächlich zeigte der Polyenkettenteil des Retinals im K-Intermediat Abweichungen von 180° oder 0°, die trotz der Doppelbindung auftreten sollten, während die Seitenkette von Lys216 trotz der Einfachbindungen nur geringe Abweichungen aufwies (Abb. 2b).

a Das NCI-Diagramm für die EC-Seite der SB-Verknüpfung. Wasserstoffatome werden entsprechend der Optimierung mit der QM/MM-Berechnung hinzugefügt. Die Isofläche mit reduziertem Dichtegradienten bei s(ρ) = 0,5 wird als farbige Flächen hinzugefügt. Die Art der Wechselwirkung kann durch die Farbe entsprechend dem Wert von sign(λ2)ρ in einer atomaren Einheit (ea0−3) visualisiert werden, wobei λ2 und sign(λ2) der zweite Eigenwert der Hesse-Matrix von ρ und sind sein Vorzeichen bzw. Die Farbskala ist rechts unten im Panel angegeben. Blau, Grün und Rot entsprechen Anziehung, schwacher Anziehung bzw. Abstoßung. Die blauen Pfeile zeigen die Wechselwirkung zwischen H-Atomen von Cε in Lys216 und Thr89. Der grüne Pfeil zeigt die Wechselwirkung zwischen H von Cε in Lys216 und Asp85. Der orangefarbene Pfeil zeigt die Wechselwirkung zwischen H von Nς in Lys216 und W402. Der violette Pfeil zeigt die Wechselwirkung zwischen H von Nς in Lys216 und Asp212. b Wechselwirkungen mit umgebenden Resten (Asp85, Thr89 und Asp212) und Water402 verhindern eine Torsionsrotation an Nς-Cε- und Cε-Cδ-Bindungen in Lys216. c Die Torsionspotentialenergiekurve für die Nς-Cε-Bindung. Die Torsionswinkel in K/bR und L betragen ~+240° bzw. +120°. d Die Torsionspotentialenergiekurve für die Cε-Cδ-Bindung. Die Torsionswinkel in K/bR und L betragen ungefähr +60° bzw. –60°.

Obwohl kürzlich über hochauflösende Strukturen anderer bR-Zustände berichtet wurde16,25, blieb die von K trotz der Bedeutung der verzerrten Struktur im Protonentransportmechanismus unklar. Basierend auf der Strukturanalyse des K-Intermediats bei ~1,3 Å in dieser Studie konnten wir jedoch die genauen Wechselwirkungsarten sowie die Konformation des verzerrten 13-cis-Retinals ermitteln. Durch den Vergleich der Netzhautkonformation in K in dieser Studie mit der in einer aktuellen L-Struktur16 wurden signifikante Änderungen in den Torsionswinkeln der C13-C14-, C14-C15- und C15-Nζ-Bindungen beobachtet. Diese Tatsache weist darauf hin, dass die Verdrehung der Polyenkette des Retinals im K-Intermediat im L-Intermediat gelockert wurde. Zusätzlich zu diesen Änderungen drehten sich die Cε-Nζ- und Cδ-Cε-Bindungen um etwa 120°, um ein weiteres Rotationsisomer zu bilden. Somit wurde festgestellt, dass das K-Intermediat durch die Wechselwirkungen zwischen Cε/Nζ und den umgebenden Resten stabilisiert wird. Dies lieferte Erkenntnisse darüber, wie die Rotationen um die Cε-Nζ- und Cδ-Cε-Bindungen während des Übergangs zum L-Intermediat ablaufen. Wir könnten daher interpretieren, dass die vermuteten Unterzustände des K-Intermediats aufgrund von Änderungen im Diederwinkel der Polyenkette des Retinals und der Seitenkette von Lys216 erzeugt werden. Einige Unterzustände wie K0, KE und KL wurden im K-Intermediat34,35,36 vorgeschlagen. Einige der verschiedenen kristallographischen K-Strukturen, die sich wie oben beschrieben voneinander unterscheiden, können solche Unterzustände sein, die durch leicht unterschiedliche experimentelle Bedingungen erfasst werden (Ergänzungstabelle 1). Daher kann eine Untersuchung der Unterschiede in jeder Struktur Informationen über die Unterzustände im K-Zwischenprodukt liefern. Basierend nur auf Unterschieden in der Wechselwirkung zwischen Nζ-H und W402 und/oder Asp212 (ergänzende Abbildung 8) kann die Änderung in der Nähe des SB als J → 7XJC (diese Arbeit) → 1M0K14 → 6GA619 → 1IXF15 → 6G7K18 → 7Z0C16 vorgeschlagen werden → 1QK013 → L. Die Übereinstimmung zwischen diesen und den bisher vorgeschlagenen Unterzuständen lässt sich jedoch nicht eindeutig feststellen. Darüber hinaus kann die Reihenfolge die Veränderungen in der Netzhautverzerrung und der Bewegung von Tyr185 nicht erklären. Darüber hinaus sind in der Diskussion einige Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. 1QK013 und 1M0K14 wurden in Analysen ermittelt, bei denen die Einflüsse von Röntgenschäden nicht ausreichend berücksichtigt wurden. 1IXF15 hat eine geringere Auflösung als die anderen, obwohl Anstrengungen unternommen wurden, um die Auswirkungen von Röntgenschäden zu untersuchen und zu beseitigen. Für 1QK013 gibt es jedoch einen deutlichen Unterschied zu anderen K-Zwischenprodukten hinsichtlich des Rotationswinkels um die Cε-Nζ-Bindung (ergänzende Abbildung 6). Daher ist die Möglichkeit, dass es sich bei 1QK013 um eine experimentelle Erfassung eines Unterzustands (KL) handelt, der in einer Computerstudie37 vorgeschlagen wurde, selbst bei Vorliegen solcher Probleme höchst plausibel. Somit kann die Rotation der Cε-Nζ-Bindung vor der Rotation der Cδ-Cε-Bindung erfolgen. Dies könnte damit zusammenhängen, dass die Tiefe des Potentials um die Cε-Nζ-Bindung (~10 kJ/mol) nur etwa halb so groß ist wie das Potential um die Cδ-Cε-Bindung (~20 kJ/mol). Tatsache, dass Nζ nur ein Wasserstoffatom hat (Abb. 6c, d).

Es gibt zwei Szenarien für die Änderung der Wasserstoffbindung zwischen Nζ und W402 bei der Rotation der Cε-Nζ-Bindung. Im ersten Fall wird diese Wasserstoffbindung durch Rotation aufgebrochen. In diesem Fall kann das Wassermolekül W402 auch nach dem Aufbrechen der Wasserstoffbindung durch Wasserstoffbrückenbindungen mit Asp85 und Asp212 in der Nähe seiner ursprünglichen Position verbleiben. Im zweiten Fall hingegen wird die Wasserstoffbrücke zwischen Nζ und W402 nach der Rotation der Cε-Nζ-Bindung immer noch gebildet. W402 wird folglich durch die Wasserstoffbrücke auf die CP-Seite gezogen, wie von Kouyama et al.38 vorgeschlagen. In diesem Fall muss zu diesem Zeitpunkt die Spaltung starker Wasserstoffbrückenbindungen zwischen W402 und Asp212 oder Asp85 erfolgen. In Anbetracht der Rotation um die Cδ-Cε-Bindung, die unmittelbar auf die Rotation der Cε-Nζ-Bindung folgt, können die Methylenwasserstoffatome von Cε diese Wasserstoffbrückenbindungen stören. Die Migration von W402 während des Übergangs von K zu L sollte anhand unserer vorliegenden Erkenntnisse durch molekulardynamische Berechnungen weiter untersucht werden.

Es besteht kein Zweifel daran, dass TR-SFX einen großen Beitrag zur Untersuchung von Proteinkonformationsänderungen leistet. Allerdings wurden die intensiven Lichtimpulse von Pumplasern als Auslöser bei der Bestimmung von Reaktionszwischenprodukten in TR-SFX39 verwendet. Es wurde darauf hingewiesen, dass der Beitrag von Multiphotonenprozessen aufgrund hoher Photonendichten bei solchen Experimenten problematisch sein kann40. Im Fall von bR wurde der Einfluss der Multiphotonenabsorption durch Trp182 als Problem angesehen40. Die Bewegung von Wassermolekülen weit von der Netzhaut entfernt, wie z. B. W401 und W406 in K oder frühere Zwischenprodukte, die in den TR-SFX-Ergebnissen beobachtet wurden, kann durch diese Multiphotonenabsorption beeinflusst werden (ergänzende Abbildung 8d, e). Daher müssen im Gegensatz zu Photoreaktionszwischenprodukten, die nach langer Zeit auftreten, wie z. B. dem M-Zwischenprodukt, die Auswirkungen des hohen Photonenflusses von Pumplasern im Fall des K-Zwischenprodukts berücksichtigt werden, das unmittelbar nach der Photoisomerisierung auftritt. Andererseits wurde in der vorliegenden Studie die K-Zwischenstruktur durch die Kryo-Trapping-Methode unter Verwendung von Lasern (~0,1 W/cm2) mit einer Lichtintensität, die mit der des Sonnenlichts vergleichbar ist, bestimmt, sodass dieses Problem der Multiphotonenabsorption nicht bestand. Daher muss die Bedeutung des K-Zwischenprodukts sorgfältig untersucht werden, indem Strukturen sowohl aus der zeitaufgelösten als auch aus der Kryo-Trapping-Methode verwendet werden. Diese Studie könnte einen Ausgangspunkt für die Diskussion der Gültigkeit und Grenzen von TR-SFX-Ergebnissen mit hochintensiven Pumplasern bieten. Bevor wir den detaillierten Mechanismus der funktionellen Expression photoaktiver Proteine aufklären können, sind weitere umfassende Forschungen in Kombination mit rechnerischen Methoden41 auch für den Bereich der Strukturbiologie erforderlich.

bR wurde nach einem Standardprotokoll1 aus der violetten Membran des H. salinarum-Stammes R1 (JMC9409) gereinigt. Die in dieser Studie verwendeten bR-Kristalle wurden mit der LCP-Methode wie zuvor beschrieben hergestellt25. Kurz gesagt, 32 μl der LCP-Matrix auf Monooleinbasis, ergänzt mit 1,6 % Squalan (Sigma-Aldrich) und 8 % Trehalose C16 (Dojindo), wurden mit 20 μl einer 15 mg/ml bR-Lösung gemischt. Jeweils 2 μl der Mischung wurden in 40 μl 2,0 M Na/K-Phosphat (pH 5,6) auf einer Mikrobrücke (Hampton Research, Aliso Viejo, CA) eingetaucht und mit 500 μl 2,0–2,5 M Na/K-Phosphat in äquilibriert eine 24-Well-Kristallisationsplatte. Die Kristalle wurden nach 6–12 Monaten geerntet. Die überschüssige LCP-Matrix, die die bR-Kristalle umgibt, wurde mit Squalan42 entfernt. Unmittelbar (innerhalb von ca. 1 Minute) nach mehr als 5-minütiger Lichtadaption mit einer weißen Halogenlampe zusätzlich zum Licht eines Mikroskops wurden bR-Kristalle mit einem Stickstoffgasstrom von 100 K eingefroren und in einem Tank mit flüssigem Stickstoff gelagert.

Beugungsexperimente wurden an der Strahllinie BL41XU von SPring-8 durchgeführt. Das K-Zwischenprodukt von Kristall I (350 × 350 × 30 μm3) wurde durch Bestrahlung mit Licht eines grünen Lasers (532 nm, ~1 mW) für 5 Minuten bei 100 K akkumuliert. Der Kristall wurde während des Laserstrahls gelegentlich um 180° gedreht Bestrahlung. Unmittelbar nach der Laserbestrahlung wurde die Temperatur auf 15 K gesenkt. Beugungsdaten für das K-Zwischenprodukt wurden mit einem Eiger X 16 M-Detektor (Dectris) gesammelt. Der Detektorabstand, die Röntgenwellenlänge und die Strahlgröße wurden auf 135 mm, 0,80 Å bzw. 50 × 20 μm2 eingestellt. Beugungsdaten für 110° wurden mit der helikalen Datenerfassungsmethode gesammelt, bei der der Oszillationsbereich und die Belichtungszeit für ein Bild 0,2° bzw. 0,2 Sekunden betrugen. Beugungsdaten des Grundzustands wurden anschließend unter denselben Messbedingungen von identischen Kristallen bei 15 K nach Bestrahlung mit Licht eines roten Lasers (678 nm, ~1 mW) für 5 Minuten bei 100 K gesammelt. Die Daten für Kristall II wurden auf die gleiche Weise wie für Kristall I gesammelt. Lediglich für Kristall III wurden zunächst die Röntgenbeugungsdaten des Grundzustands vor den Daten des K-Intermediats gesammelt. Die Röntgenabsorptionsdosis wurde mit dem Programm RADDOSE43 geschätzt. Die Dosis wurde auf 0,05 MGy pro Datensatz und auf 0,1 MGy insgesamt für zwei Datensätze geschätzt. Die Gesamtdosis liegt unter dem in unserer vorherigen Studie geschätzten Dosisgrenzwert bei 15 K von 0,15 MGy25.

Alle Beugungsdaten wurden mit dem Programm XDS44 verarbeitet. Zu Beginn der Strukturanalyse wurde die Grundzustandsstruktur für jeden Kristall unter Verwendung von 5ZIL als Ausgangsmodell verfeinert25. Die Akkumulation des K-Zwischenprodukts wurde zunächst mit der Fo(K + bR) − Fo(bR)-Differenz-Fourier-Karte unter Verwendung der Phasen aus der Grundzustandsstruktur überprüft. F (K) und σ(F (K)) wurden mithilfe der Gleichungen45 extrapoliert

wobei f das Bruchteilsverhältnis des K-Zwischenprodukts ist. Der f-Wert wurde anhand der Formmerkmale des Netzhautanteils auf der Fo(K)-Fc(K)-Auslassungskarte und der Temperaturfaktoren der Netzhaut nach der Verfeinerung der extrapolierten Datensätze mit verschiedenen f-Werten unter Verwendung des Programms CNS46 bestimmt. Bei den Verfeinerungsberechnungen wurden nur die Koordinaten von Retinal und Resten mit Dichten auf der Fo(K + bR) − Fo(bR)-Differenz-Fourier-Karte verschoben. Die Strukturen wurden mit dem Programm COOT47 korrigiert. Die K-Struktur des plausibelsten f-Werts wurde anschließend anhand des extrapolierten Datensatzes mit dem Programm SHELX48 verfeinert. Die K-Struktur wurde in der anschließenden SHELX-Verfeinerung gegenüber F(K + bR) verwendet, wobei die K- und Grundzustände als Doppelkonformationen behandelt wurden. Für den Zwillingsanteil wurde der Anfangswert mit dem L-Test49 mit dem Programm CTRUNCATE in der CCP4-Programmsuite50 geschätzt. Die Zwillingsfraktion wurde durch die Verfeinerungsrechnungen für den Grundzustand und die extrapolierten K-Strukturen optimiert. Andererseits wurde die Zwillingsfraktion für die K + bR-Struktur erst in einigen letzten Schritten der SHELX-Verfeinerung optimiert. Gezwirnte Daten werden mit der Methode von Pratt et al. verarbeitet. und Jameson im SHELX-Programm51,52,53. Die verfeinerte Struktur wurde mit dem Programm MolProbity54 überprüft. Alle Molekülfiguren wurden mit dem Programm PyMOL55 erstellt.

Alle Rückstände, Netzhaut und 19 Wässer im Protonenkanal wurden als Ziele für QM/MM-Berechnungen ausgewählt. Die anfänglichen Koordinaten des K-Zustands wurden aus dem in dieser Studie ermittelten 7XJC extrapoliert, während die des bR-Zustands aus 5ZIL stammten. Die Protonierungszustände beim Kristallisations-pH (5,6) wurden mit dem Programm PROPKA56 geschätzt. Wasserstoffatome wurden mit den Programmen PDB2PQR57 und MAESTRO58 hinzugefügt. Die Koordinaten der H-Atome wurden nach dem QM/MM-Schema mit der Programmsuite GAMESS (US)59 optimiert. Die QM-Region umfasst Tyr57, Arg82, Asp85, Trp86, Thr89, Trp182, Tyr185, Pro186, Asp212, Lys216, Retinal, W401, W402 und W406 (ergänzende Abbildung 9a). Die QM-Berechnungen wurden auf dem M06-2X/6-31(d,p)-Niveau durchgeführt, wie für retinalhaltige Rhodopsine60 empfohlen. Die MM-Region wurde mit dem CHARMM36-Kraftfeld61 behandelt. Zunächst wurden die H-Atome von Wassermolekülen mit der reinen MM-Berechnung optimiert. Als nächstes wurden nur die H-Atome der QM-Region optimiert, indem die Nicht-H-Atome fixiert wurden. Schließlich wurden alle Atome der QM-Region optimiert. Die RMSD-Werte zwischen der Kristallstruktur und der optimierten Struktur betrugen 0, 13 Å für den K-Zustand bzw. 0, 07 Å für den Grundzustand für Nicht-H-Atome der QM-Region (ergänzende Abbildung 9b, c). Wie für alle Nicht-H-Atome der QM- und MM-Regionen betrugen diese Werte 0,33 Å und 0,27 Å. Die NCI-Diagramme des reduzierten Dichtegradienten wurden aus den DFT-Elektronendichten mit dem Programm NCIPLOT62 berechnet. Die Potentiale für Cε-Nζ- und Cδ-Cε-Bindungen wurden für freies CH2 = NH-CH2-CH2-CH3 mit Psi4 unter Verwendung von HF/6-31 G*63 berechnet.

Im Beugungsexperiment wurden mehr als 10 Kristalle getestet und Daten von drei Kristallen (Kristalle I–III) wurden für die Strukturanalysen basierend auf der Auflösung ausgewählt. Die K- und Grundzustandsstrukturen eines Kristalls mit den besten Auflösungen (Kristall I) wurden im Haupttext beschrieben, während die anderen beiden in den ergänzenden Materialien angegeben wurden. Die aus den drei Strukturen jeweils berechneten Mittelwerte und Standardabweichungen für die Torsionswinkel der Netzhaut sind als Hohlkreise und Fehlerbalken dargestellt (Abb. 2b, Abb. 5b und ergänzende Abb. 6).

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Koordinaten und Strukturfaktoren wurden in der Proteindatenbank unter den Zugangsnummern 7XJC (für bR+K), 7XJD (für bR) und 7XJE (für extrapoliertes K) hinterlegt. Quelldaten für die Abbildungen finden Sie unter „Supplementary Data“.

Oesterhelt, D. & Stoeckenius, W. Rhodopsin-ähnliches Protein aus der Purpurmembran von Halobacterium halobium. Nat. Neue Biol. 233, 149–152 (1971).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Oesterhelt, D. & Stoeckenius, W. Funktionen einer neuen Photorezeptormembran. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 70, 2853–2857 (1973).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Inoue, K. Diversität, Mechanismus und optogenetische Anwendung lichtgetriebener Ionenpumpen-Rhodopsine. Adv. Exp. Med. Biol. 1293, 89–126 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brown, LS Lichtgetriebene Protonentransfers und Protonentransport durch mikrobielle Rhodopsine – eine biophysikalische Perspektive. Biochim. Biophys. Acta Biomembr. 1864, 183867 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Grote, M., Engelhard, M. & Hegemann, P. Von Ionenpumpen, Sensoren und Kanälen – Perspektiven auf mikrobielle Rhodopsine zwischen Wissenschaft und Geschichte. Biochim. Biophys. Acta 1837, 533–545 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ernst, OP et al. Mikrobielle und tierische Rhodopsine: Strukturen, Funktionen und molekulare Mechanismen. Chem. Rev. 114, 126–163 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Philosof, A. & Béjà, O. Bakterielle, archaische und virale Rhodopsine aus dem Roten Meer. Umgebung. Mikrobiol. Rep. 5, 475–482 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Grigorieff, N., Ceska, TA, Downing, KH, Baldwin, JM & Henderson, R. Elektronenkristallographische Verfeinerung der Struktur von Bakteriorhodopsin. J. Mol. Biol. 259, 393–421 (1995).

Artikel Google Scholar

Lozier, RH, Bogomolni, RA & Stoeckenius, W. Bacteriorhodopsin: eine lichtgetriebene Protonenpumpe in Halobacterium Halobium. Biophys. J. 15, 955–962 (1975).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stoeckenius, W. & Lozier, RH Lichtenergieumwandlung in Halobacterium halobium. J. Supramol. Struktur. 2, 769–774 (1974).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Doig, SJ, Reid, PJ & Mathies, RA Zeitaufgelöste Pikosekunden-Resonanz-Raman-Spektroskopie der J-, K- und KL-Zwischenprodukte von Bakteriorhodopsin. J. Phys. Chem. 95, 6372–6379 (1991).

Artikel CAS Google Scholar

Sasaki, J., Yuzawa, T., Kandori, H., Maeda, A. & Hamaguchi, H. Zeitaufgelöste Nanosekunden-Infrarotspektroskopie unterscheidet zwei K-Spezies im Bakteriorhodopsin-Photozyklus. Biophys. J. 68, 2073–2080 (1995).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Edman, K. et al. Hochaufgelöste Röntgenstruktur und frühes Zwischenprodukt im Bakteriorhodopsin-Photozyklus. Nature 401, 822–826 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schobert, B., Cupp-Vickery, J., Hornak, V., Smith, SO & Lanyi, JK Kristallographische Struktur des K-Intermediats von Bakteriorhodopsin: Erhaltung der freien Energie nach Photoisomerisierung des Retinals. J. Mol. Biol. 321, 715–726 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Matsui, Y. et al. Spezifische Schäden durch Röntgenstrahlung und strukturelle Veränderungen bei der primären Photoreaktion von Bakteriorhodopsin. J. Mol. Biol. 324, 469–481 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Borshchevskiy, V. et al. Einblicke in echter atomarer Auflösung in die Struktur und funktionelle Rolle linearer Ketten und Wasserstoffbrückenbindungen mit niedriger Barriere in Proteinen. Nat. Struktur. Biol. 29, 440–450 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Nango, E. et al. Ein dreidimensionaler Film über strukturelle Veränderungen bei Bakteriorhodopsin. Wissenschaft 354, 1552–1557 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nogly, P. et al. Retinale Isomerisierung in Bakteriorhodopsin, aufgenommen mit einem Femtosekunden-Röntgenlaser. Wissenschaft 361, eaat0094 (2018).

Artikel PubMed Google Scholar

Nass Kovacs, G. et al. Dreidimensionale Ansicht der ultraschnellen Dynamik in photoangeregtem Bakteriorhodopsin. Nat. Komm. 10, 3177 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Birge, RR et al. Überarbeitete Zuordnung der Energiespeicherung beim primären photochemischen Ereignis in Bakteriorhodopsin. Marmelade. Chem. Soc. 113, 4327–4328 (1991).

Artikel CAS Google Scholar

Lindner, F. & Diepold, A. Optogenetik bei Bakterien – Anwendungen und Chancen. FEMS Mikrobiol. Rev. 46, fuab055 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kojima, K., Shibukawa, A. & Sudo, Y. Das unbegrenzte Potenzial mikrobieller Rhodopsine als optische Werkzeuge. Biochemie 59, 218–229 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, YT et al. Übersicht über bioelektronische Geräte auf Bakteriorhodopsin-Basis. Sensoren 18, 1368 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Oleinikov, VA, Solovyeva, DO & Zaitsev, SY Nanohybridstrukturen basierend auf plasmonischen oder fluoreszierenden Nanopartikeln und retinalhaltigen Proteinen. Biochem. (Moskau). 85, S196–S212 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Hasegawa, N., Jonotsuka, H., Miki, K. & Takeda, K. Röntgenstrukturanalyse von Bakteriorhodopsin bei 1,3 Å Auflösung. Wissenschaft. Rep. 8, 13123 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Balashov, SP, Imasheva, ES, Govindjee, R. & Ebrey, TG Quantenausbeuteverhältnis der Vorwärts- und Rücklichtreaktionen von Bakteriorhodopsin bei niedriger Temperatur und photostationäre Konzentration des Badeprodukts K*. Photochem. Photobiol. 54, 955–961 (1991).

Artikel CAS Google Scholar

Kandori, H., Belenky, M. & Herzfeld, J. Schwingungsfrequenz und dipolare Ausrichtung der protonierten Schiff-Base in Bakteriorhodopsin vor und nach der Photoisomerisierung. Biochemistry 41, 6026–6031 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kandori, H., Kinoshita, N., Shichida, Y. & Maeda, A. Proteinstrukturelle Veränderungen in Bakteriorhodopsin bei Photoisomerisierung, wie durch polarisierte FTIR-Spektroskopie nachgewiesen. J. Phys. Chem. B 102, 7899–7905 (1998).

Artikel CAS Google Scholar

Braiman, MS et al. Schwingungsspektroskopie von Bakteriorhodopsin-Mutanten: Der lichtgesteuerte Protonentransport beinhaltet Protonierungsänderungen der Asparaginsäurereste 85, 96 und 212. Biochemistry 27, 8516–8520 (1988).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Braiman, M. & Mathies, R. Resonanz-Raman-Spektren des primären Photoprodukts von Bakteriorhodopsin: Hinweise auf ein verzerrtes 13-cis-Retina-Chromophor. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 79, 403–407 (1982).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Johnson, ER et al. Aufdeckung nichtkovalenter Wechselwirkungen. Marmelade. Chem. Soc. 132, 6498–6506 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chaudret, R. et al. Aufklärung nichtkovalenter Wechselwirkungen innerhalb flexibler Biomoleküle: von der Elektronendichtetopologie bis zur Gasphasenspektroskopie. Physik. Chem. Chem. Physik. 16, 9876–9891 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Horowith, S. & Trievel, RC Kohlenstoff-Sauerstoff-Wasserstoffbrückenbindung in biologischer Struktur und Funktion. J. Biol. Chem. 287, 41576–41582 (2012).

Artikel Google Scholar

Rothschild, KJ, Roepe, P. & Gillespie, J. Fourier transformieren infrarotspektroskopische Beweise für die Existenz von zwei Konformationen des primären Photoprodukts Bakteriorhodopsin bei niedriger Temperatur. Biochim. Biophys. Acta 808, 140–148 (1985).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Milder, SJ & Kliger, DS Eine zeitaufgelöste Spektralstudie der K- und KL-Zwischenprodukte von Bakteriorhodopsin. Biophys. J. 53, 465–468 (1988).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dioumaev, AK, Wang, JM & Lanyi, JK Niedertemperatur-FTIR-Untersuchung mehrerer K-Intermediate in den Photozyklen von Bakteriorhodopsin und Xanthorhodopsin. J. Phys. Chem. B 114, 2920–2931 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hayashi, S., Tajkhorshid, E. & Schulten, K. Strukturelle Veränderungen während der Bildung früher Zwischenprodukte im Bakteriorhodopsin-Photozyklus. Biophys. J. 83, 1281–1297 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kouyama, T., Nishikawa, T., Tokuhisa, T. & Okumura, H. Kristallstruktur des L-Zwischenprodukts von Bakteriorhodopsin: Hinweise auf die vertikale Translokation eines Wassermoleküls während des Protonenpumpzyklus. J. Mol. Biol. 335, 531–546 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Poddar, H. et al. Ein Leitfaden zur zeitaufgelösten Strukturanalyse lichtaktivierter Proteine. FEBS J. 289, 576–595 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dwayne Miller, RJ, Paré-Labrosse, O., Antoine Sarracini, A. & Besaw, JE Dreidimensionale Ansicht der ultraschnellen Dynamik in photoangeregtem Bakteriorhodopsin im Multiphotonenregime und biologische Relevanz. Nat. Komm. 11, 1240 (2020).

Artikel Google Scholar

Mroginski, MA et al. Grenzen der Multiskalenmodellierung von Photorezeptorproteinen. Photochem Photobiol. 97, 243–269 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Niwa, S. & Takeda, K. Nützlichkeit von Ölen zur Reinigung der Wirtsmatrix und zum Kryoschutz von Kristallen der kubischen Lipidphase. J. Appl. Kristall. 52, 864–868 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Murray, JW, Garman, EF & Ravelli, RBG Röntgenabsorption durch makromolekulare Kristalle: die Auswirkungen von Wellenlänge und Kristallzusammensetzung auf die absorbierte Dosis. J. Appl. Kristall. 37, 513–522 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. D. 66, 125–132 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Genick, UK Strukturfaktor-Extrapolation mithilfe der Skalarnäherung: Theorie, Anwendungen und Einschränkungen. Acta Crystallogr. D. 63, 1029–1041 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Brünger, AT et al. Kristallographie- und NMR-System: eine neue Software-Suite zur Bestimmung der makromolekularen Struktur. Acta Crystallogr. D. 54, 905–921 (1998).

Artikel PubMed Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG & Cowtan, K. Merkmale und Entwicklung von COOT. Acta Crystallogr. D. 66, 486–501 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sheldrick, GM Verfeinerung der Kristallstruktur mit SHELXL. Acta Crystallogr. C. 71, 3–8 (2015).

Artikel Google Scholar

Padilla, JE & Yeates, TO Eine Statistik für lokale Intensitätsunterschiede: Robustheit gegenüber Anisotropie und Pseudozentrierung sowie Nützlichkeit zur Erkennung von Zwillingen. Acta Crystallogr. D. 59, 1124–1130 (2003).

Artikel PubMed Google Scholar

Collaborative Computational Project, Nummer 4. Die CCP4-Suite: Programme für die Proteinkristallographie. Acta Crystallogr. D 50, 760–763 (1994).

Google Scholar

Herbst-Irmer, R. & Sheldrick, GM Verfeinerung verzwillingter Strukturen mit SHELXL97. Acta Crystallogr. B 54, 443–449 (1998).

Artikel Google Scholar

Pratt, CS, Coyle, BA & Ibers, JA Neubestimmung der Struktur von Nitrosylpentaamminecobalt(III)-dichlorid. J. Chem. Soc. A 1971, 2146–2151 (1971).

Artikel Google Scholar

Jameson, GB Zur Strukturverfeinerung anhand von Daten eines Zwillingskristalls. Acta Crystallogr. A 38, 817–820 (1982).

Artikel Google Scholar

Chen, VB et al. Molprobity: Validierung der Gesamtatomstruktur für die makromolekulare Kristallographie. Acta Crystallogr. D. 66, 12–21 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Das PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.5.0.5 Schrödinger, LLC.

Søndergaard, CR, Olsson, MHM, Rostkowski, M. & Jensen, JH Verbesserte Behandlung von Liganden und Kopplungseffekten bei der empirischen Berechnung und Rationalisierung von pKa-Werten. J. Chem. Theorie Chem. 7, 2284–2295 (2011).

Artikel Google Scholar

Dolinsky, TJ et al. PDB2PQR: Erweiterung und Verbesserung der automatisierten Vorbereitung biomolekularer Strukturen für molekulare Simulationen. Nukleinsäuren Res. 35, W522–W525 (2007).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Master, Schrödinger, LLC, New York, NY, 2021.

Barca, GMJ et al. Aktuelle Entwicklungen im allgemeinen atomaren und molekularen elektronischen Struktursystem. J. Chem. Physik. 152, 154102 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Marín, MC et al. Bewertung der MC-PDFT-Anregungsenergien für eine Reihe von QM/MM-Modellen von Rhodopsinen. J. Chem. Theorieberechnung. 15, 1915–1923 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Best, RB et al. Optimierung des additiven CHARMM-Allatom-Protein-Kraftfelds mit dem Ziel einer verbesserten Abtastung der Rückgrat-Phi-, Psi- und Seitenketten-Chi1- und Chi2-Diederwinkel. J. Chem. Theorieberechnung. 8, 3257–3273 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Contreras-García, J. et al. NCIPLOT: ein Programm zum Plotten nichtkovalenter Interaktionsregionen. Chem. Theorieberechnung. 7, 625–632 (2011).

Artikel Google Scholar

Smith, DGA et al. Phi4 1.4: Open-Source-Software für Hochdurchsatz-Quantenchemie. J. Chem. Physik. 152, 184108 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir danken den Herren N. Hasegawa und Y. Imai für ihre Hilfe bei dieser Arbeit. Wir danken auch den Beamline-Mitarbeitern am BL41XU von SPring-8 für ihre Hilfe bei den Datenerfassungsexperimenten (Vorschlagsnr. 2018B2706, 2019B2718, 2021A2753 an KT). Diese Arbeit wurde von der Kyoto University Foundation (an KT), der Takeda Science Foundation (an KT) und JSPS KAKENHI (Nr. JP 20H05220 an KT) unterstützt. H. salinarum wurde von der RIKEN BRC Cell Bank bezogen.

Fachbereich Chemie, Graduate School of Science, Universität Kyoto, Kyoto, Sakyo-ku, 606-8502, Japan

Shoun Taguchi, Satomi Niwa, Hoang-Anh Dao, Yoshihiro Tanaka, Ryota Takeda, Shuya Fukai und Kazuki Takeda

Abteilung für Strukturbiologie, Japan Synchrotron Radiation Research Institute (JASRI), 1-1-1 Kouto, Sayo-cho, Sayo-gun, Hyogo, 679-5198, Japan

Kazuya Hasegawa

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KT betreute das Projekt. ST und KT haben die Experimente entworfen. ST-präparierte Kristalle. ST, SN, KH und KT führten Datenerfassungen durch. ST, SN, YT und KT führten kristallographische Analysen durch. H.-AD, RT und KT führten quantenchemische Analysen durch. ST, SN, H.-AD, SF, KH und KT diskutierten die Ergebnisse. ST und KT haben den ersten Entwurf verfasst und SN und H.-AD haben den Entwurf überarbeitet. Alle Autoren äußerten sich zum Entwurf und stimmten der Vorlage der endgültigen Fassung zu.

Korrespondenz mit Kazuki Takeda.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Michael F. Brown und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Janesh Kumar, Veronique van den Berghe und Gene Chong. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Taguchi, S., Niwa, S., Dao, HA. et al. Detaillierte Analyse der verzerrten Netzhaut und ihrer Wechselwirkung mit umgebenden Resten im K-Intermediat von Bakteriorhodopsin. Commun Biol 6, 190 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04554-2

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Eingegangen: 10. Juli 2022

Angenommen: 03. Februar 2023

Veröffentlicht: 17. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04554-2

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