Indolethylamin N

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 280 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Indolethylamin-N-Methyltransferase (INMT) ist ein Transmethylierungsenzym, das den Methyldonor S-Adenosyl-L-Methionin nutzt, um Methylgruppen auf Aminogruppen von niedermolekularen Akzeptorverbindungen zu übertragen. INMT ist vor allem für seine Rolle bei der Biosynthese von N,N-Dimethyltryptamin (DMT) bekannt, einer psychedelischen Verbindung, die im Gehirn und anderen Geweben von Säugetieren vorkommt. Es wird angenommen, dass die Biosynthese von DMT bei Säugetieren über die doppelte Methylierung von Tryptamin erfolgt, wobei INMT zunächst die Biosynthese von N-Methyltryptamin (NMT) und dann DMT katalysiert. Es ist jedoch nicht bekannt, ob INMT für die Biosynthese von endogenem DMT notwendig ist. Um dies zu testen, haben wir ein neuartiges INMT-Knockout-Rattenmodell erstellt und die Tryptaminmethylierung mithilfe radiometrischer Enzymtests, Dünnschichtchromatographie und Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie untersucht. Wir untersuchten auch die Tryptaminmethylierung in rekombinantem INMT von Ratten, Kaninchen und Menschen. Wir berichten, dass Gehirn- und Lungengewebe sowohl von Wildtyp- als auch von INMT-Knockout-Ratten gleiche Werte an Tryptamin-abhängiger Aktivität aufweisen, dass die enzymatischen Produkte jedoch weder NMT noch DMT sind. Darüber hinaus reichte Ratten-INMT nicht für die NMT- oder DMT-Biosynthese aus. Diese Ergebnisse legen einen alternativen enzymatischen Weg für die DMT-Biosynthese bei Ratten nahe. Diese Arbeit motiviert die Untersuchung neuer Wege für die endogene DMT-Biosynthese in Säugetieren.

Indolethylamin-N-Methyltransferase (INMT) ist ein Transmethylierungsenzym, das die Übertragung von Methylgruppen vom Cofaktor S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) auf Aminogruppen von Akzeptorsubstraten kleiner Moleküle katalysiert1. Das Enzym weist eine breite Substratspezifität für mehrere endogene Amine und andere kleine Moleküle auf, wobei Tryptamin und N-Methyltryptamin (NMT) typischerweise als die primären Substrate des Enzyms angesehen werden2,3. In einer zweistufigen Reaktion, die SAM als Methyldonor nutzt, katalysiert INMT die Übertragung einer Methylgruppe auf die Aminoseitenkette von Tryptamin, um zunächst NMT und dann N,N-Dimethyltryptamin (DMT) zu bilden (Abb. 1). Dieser Weg wurde erstmals 1961 von Axelrod4 beschrieben, der mithilfe eines radiometrischen Enzymtests und einer Dünnschichtchromatographie zeigte, dass mit Tryptamin und C14-SAM inkubierte Kaninchenlungenextrakte C14-NMT und C14-DMT produzierten. Diese Studie war eine der ersten, die zeigte, dass „psychotomimetische“ Metaboliten enzymatisch aus natürlich vorkommenden Verbindungen gebildet werden können.

Der DMT-Biosyntheseweg bei Säugetieren. Es wird angenommen, dass die Methylierung von Tryptamin zu N,N-Dimethyltryptamin über eine zweistufige Reaktion erfolgt, die durch das Enzym Indolethylamin-N-Methyltransferase (INMT) katalysiert wird, mit N-Methyltryptamin (NMT) als Zwischenprodukt. Der Cofaktor S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) dient als Methyldonor, wobei S-Adenosyl-L-Homocystein (SAH) ein Nebenprodukt dieses Methyltransfers ist.

Die INMT-mRNA-Expression wurde bei mehreren Säugetierarten untersucht und wurde im Gehirn, in der Leber und in der Lunge von Kaninchen1, in mehreren menschlichen Geweben, einschließlich Herz, Lunge, Leber und Nebenniere5, sowie im Gehirn, in der Leber, in der Lunge, in der Niere und im Herzen berichtet und Nebenniere der Ratte6. Darüber hinaus wurde die INMT-Proteinexpression in Geweben der Zirbeldrüse, des Rückenmarks und der Netzhaut von Rhesusaffen nachgewiesen7. Extrakte aus Lungengeweben – vor allem aus Kaninchengewebe – zeigten in der Vergangenheit im Vergleich zu anderen Geweben eine höhere Expression von INMT und eine größere Methylierungsaktivität gegenüber Tryptamin und NMT1,8,9. Infolgedessen war Kaninchen-INMT das erste INMT, das geklont und charakterisiert wurde, und menschliches INMT folgte bald darauf1,5. Bei der Expression in COS-1-Zellen zeigten beide rekombinanten Proteine ​​eine ausreichende Tryptaminmethylierung mit scheinbaren Km (mM)-Werten von (Mittelwert ± SEM) 0,27 ± 0,05 bzw. 2,92 ± 0,071,5.

Obwohl die endogene Rolle von INMT nicht vollständig geklärt ist, ist das Enzym vielleicht am besten für seine Funktion bei der Methylierung von endogenem Tryptamin zur Bildung der doppelt methylierten psychedelischen Verbindung DMT10 bekannt. DMT hat strukturelle Ähnlichkeit mit dem Neurotransmitter Serotonin (5-HT), erzeugt bei Verabreichung an Menschen psychedelische Wirkungen11 und kommt endogen in einer Vielzahl von Pflanzenarten sowie in Geweben und Körperflüssigkeiten von Säugetieren vor12. Das Vorhandensein von endogenem DMT wurde erstmals 1965 durch Blut- und Urinanalysen beim Menschen bestätigt13 und wurde anschließend in Blut, Urin und Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit von Menschen mit einer Vielzahl anspruchsvoller Analysetechniken, einschließlich Gaschromatographie (GC) und Hochleistungsanalysen, bestätigt Flüssigkeitschromatographie (HPLC) gekoppelt mit Massenspektrometrie (MS) (siehe Referenz 14 für eine ausführliche Übersicht). Die In-vivo-Probenahme von DMT im Gehirn war jedoch auf Nagetierstudien beschränkt, wobei Ratten die am häufigsten untersuchte Tierart für diesen Zweck waren. Mehrere Berichte haben das Vorhandensein von endogenem DMT im Rattenhirn und anderen Geweben bestätigt. Saavedra und Axelrod führten intrazisternale Injektionen von C14-Tryptamin bei Ratten durch und zeigten die Rückgewinnung von C14-NMT und C14-DMT im gesamten Gehirn mittels Dünnschichtchromatographie mit mehreren Lösungsmittelsystemen15. Beaton und Morris entdeckten und quantifizierten DMT aus Ganzhirnextrakten unbehandelter Ratten in verschiedenen Entwicklungsstadien mittels GC-MS16. Kärkkäinen et al. behandelten Ratten mit einem Monoaminoxidase-Hemmer (MAOI) vor und fanden mithilfe der HPLC-Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) DMT in Nieren-, Lungen-, Leber- und Gehirngeweben17. Barker et al. analysierten Perfusatproben, die mittels Mikrodialyse im okzipitalen Kortex von sich frei verhaltenden unbehandelten Ratten gesammelt wurden, und bestätigten das Vorhandensein von DMT mittels LC-MS/MS18. Schließlich haben Dean et al. verwendeten HPLC mit Fluoreszenzdetektion, um DMT in Perfusatproben zu quantifizieren, die aus dem okzipitalen Kortex von sich frei verhaltenden unbehandelten Ratten entnommen wurden, und zeigten, dass die endogenen DMT-Spiegel zwischen 0,05 und 2,2 nM6 lagen.

Es gibt bestimmte Aspekte der INMT-Biochemie, die ein klares Verständnis ihrer Funktionen und Rolle bei der Tryptaminmethylierung verhindert haben. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass viele frühe Studien zur Untersuchung der INMT-Funktion auf Ex-vivo-Assays beruhten, bei denen rohe oder teilweise gereinigte Proteinextrakte verwendet wurden. Diese Techniken sind nützlich, um die umfassende enzymatische Aktivität von Geweben zu verstehen, reichen jedoch nicht aus, um die Aktivität eines einzelnen Enzyms zu charakterisieren. Ein Indikator für diese Einschränkung ist die berichtete Promiskuität der enzymatischen Aktivität von Proteinextrakten. Tatsächlich berichteten mehrere Studien, die Extrakte aus verschiedenen Gewebequellen verwendeten, dass Enzyme aus diesen Geweben mit bis zu drei Dutzend verschiedenen Substraten interagieren, darunter endogene Verbindungen und Xenobiotika2,3,19. Diese Ergebnisse wurden oft allgemein als Ergebnis der „INMT-Aktivität“ charakterisiert, die Methoden reichten für diese Charakterisierung jedoch nicht aus. Ein weiterer Indikator für die Grenzen dieser Techniken ist, dass Proteinextrakte offenbar inkonsistente Aktivitäts- und Affinitätsniveaus gegenüber Substraten aufweisen, wenn die Testbedingungen variiert werden oder wenn sie aus verschiedenen Geweben derselben Spezies stammen10. Mithilfe von Enzymen aus rohen Kaninchenlungenextrakten identifizierte Axelrod beispielsweise 5-HT als bevorzugtes Substrat, wobei Tryptamin und NMT 81 % bzw. 39 % der Aktivität von 5-HT zeigten3. Andere Studien mit Enzymen aus derselben Quelle ergaben jedoch, dass NMT mit einem Km-Wert von 50 µM das bevorzugte Substrat ist, gefolgt von Tryptamin mit einem Km-Wert von 330 µM8,9,20. Die Analyse der Enzymaktivität von rohem Hühnerhirnextrakt zeigte, dass 5-HT das bevorzugte Substrat ist, wobei Tryptamin und NMT eine relative Aktivität von 60 % bzw. 47 % aufwiesen21, und eine Studie mit menschlichen Gehirnextrakten zeigte, dass Tryptamin das bevorzugte Substrat ist (111 %). ), im Vergleich zu 5-HT (100 %) und NMT (55 %)2. Schließlich zeigte die Enzymaktivität aus rohen Rattenhirnextrakten zusätzliche Inkonsistenzen, wobei Tryptamin das bevorzugte Substrat war (Km = 27,8 µM), gefolgt von NMT (Km = 36,8 µM)22.

Ein direkterer Ansatz zur Untersuchung der Aktivität eines bestimmten Enzyms von Interesse ist die Verwendung gereinigter rekombinanter Proteine. Thompson und Kollegen waren die ersten, die diesen Ansatz verfolgten, indem sie sowohl Kaninchen- als auch menschliche INMT klonten, exprimierten und charakterisierten und bestätigten, dass beide Enzyme tatsächlich Tryptamin methylieren1,5. Obwohl Ratten als Modellspezies für den endogenen DMT-Nachweis im Gehirn dienten, wurde bisher in keiner Studie versucht, die Aktivität von rekombinantem Ratten-INMT zu charakterisieren oder Ratten-INMT mit modernen transgenen Ansätzen zu untersuchen.

Um die Rolle von INMT bei der Biosynthese von endogenem DMT besser zu verstehen, haben wir mithilfe von CRISPR/Cas9 ein neuartiges Rattenmodell mit INMT-Mangel entwickelt. Ratten wurden ausgewählt, da sie bislang die Modellspezies für den In-vivo-Nachweis von DMT waren. Da lange angenommen wurde, dass eine Hauptfunktion von INMT die Methylierung von Tryptamin zur Bildung von NMT und DMT ist, stellten wir die Hypothese auf, dass Geweben von Ratten mit INMT-Mangel diese Funktionen fehlen würden. Um diese Hypothese zu testen, verwendeten wir Wurfgeschwisterpaare aus INMT+/−-Kreuzungen, um die Tryptamin-Methylierungsaktivität in Gehirn- und Lungengewebe zwischen INMT +/+ (WT) und INMT −/− (KO) Ratten zu vergleichen. Vor dieser Studie war die Untersuchung rekombinanter INMT nur auf INMTs von Kaninchen und Menschen beschränkt. Daher verglichen wir auch die Tryptamin-Methylierungsaktivität von rekombinanten INMTs von Ratten, Kaninchen und Menschen, die in E. coli exprimiert wurden. Um die Enzymaktivität zu untersuchen, einschließlich der Identifizierung und Quantifizierung von Reaktionsprodukten von Enzymtests, verwendeten wir eine Reihe experimenteller Techniken und Analysewerkzeuge, darunter radiometrische Enzymtests mit Szintillationszählung, Dünnschichtchromatographie mit Phosphor-Bildgebung und Ultrahochleistungsflüssigkeit Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (uHPLC-MS/MS).

Mithilfe von CRISPR/Cas9 wurde eine 2-Nukleotid-Deletion in Exon 1 des INMT-Gens der Ratte eingeführt (Abb. 2a), was zu einer Frameshift-Mutation (Abb. 2b) und dem Fehlen einer INMT-Proteinexpression in der Ratte führte (Abb. 2c). . Das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein einer INMT-Expression bei Ratten wurde mit PCR-Produkten aus Schwanzstücken und Western Blots unter Verwendung von Lungengewebehomogenaten bestätigt. Die Löschung von INMT führte nicht zu offensichtlichen Verhaltens- oder physiologischen Anomalien und die Ratten waren fortpflanzungsfähig. Um den Einfluss der INMT-Deletion auf die Tryptamin-abhängige Enzymaktivität zu bestimmen, führten wir radiometrische Enzymtests mit Gehirn- und Lungengewebe von WT- und KO-Ratten durch; Als Positivkontrolle wurden Kaninchenlungengewebeextrakte verwendet (Abb. 2d). Diese hochempfindlichen Tests basieren auf der Übertragung einer radioaktiv markierten (C14)-Methylgruppe von C14-SAM auf ein Substrat, wo die Aktivität mittels Flüssigszintillationszählung gemessen wird. Die Daten deuten darauf hin, dass die Deletion von Ratten-INMT keinen erkennbaren Einfluss auf die Fähigkeit von Gehirn- oder Lungenextrakten hatte, Tryptamin zu methylieren.

Die enzymatische Methylierung von Tryptamin unterscheidet sich nicht zwischen WT- und INMT-KO-Ratten (a) Die Genstruktur von Ratten-INMT mit in schwarzen Kästchen dargestellten Exons. Die Position und Sequenz der INMT-Guide-RNA (gRNA) wird mit einem roten Dreieck angezeigt. (b) Die 2-Basenpaar-Deletion, die für die Erzeugung des KO verantwortlich ist, ist unter der Wildtyp-Sequenz (WT) dargestellt, wobei die Position der gRNA unterstrichen ist. (c) Western-Blot, der das Vorhandensein von INMT (grüne Banden) in WT-, aber nicht in KO-Rattenlungengeweben zeigt. Das Originalbild einschließlich aller Spuren im Molekulargewichtsmarker ist als ergänzende Abbildung S1 enthalten. (d) Radiometrische Enzymtests mit Gewebeextrakten aus Kaninchenlunge sowie Rattenhirn und Rattenlunge von WT- und INMT-KO-Ratten. Jeder Punkt repräsentiert den Durchschnitt von 3 dreifachen Experimenten mit einem einzelnen Tier für Kaninchen (n = 3) und Ratten (n = 6) für jeden Genotyp. Diagramme zeigen Durchschnittswerte mit Fehlerbalken, die Standardabweichungen angeben. CPM: Zählungen pro Minute. Kaninchenlungengewebeextrakte (n = 3) zeigten eine Tryptamin-abhängige Aktivität, die > 20-fach höher war als Rattengewebe (durchschnittliche spezifische Aktivität [SA] = 322,2 ± 8,81, 95 %-Konfidenzintervall [KI] des Mittelwerts = 300,3–344,0). Die Tryptamin-abhängige Aktivität unterschied sich zwischen WT- und KO-Ratten nicht im Gehirn (t = 0,30, mittlerer Unterschied = – 0,36, 95 %-KI = – 3,05–2,33, p = 0,77) oder im Lungengewebe (t = 0,52, mittlerer Unterschied = –). 0,25, 95 %-KI = − 1,33–0,84, p = 0,62). Im Gehirn betrug die durchschnittliche SA 14,68 ± 2,34, 95 %-KI des Mittelwerts = 12,22–17,13 bei WT und 14,32 ± 1,76, 95 %-KI des Mittelwerts = 12,47–16,16 bei KO. In der Lunge betrug die durchschnittliche SA 6,36 ± 0,66, 95 %-KI des Mittelwerts = 5,66–7,05 im WT und 6,11 ± 0,96, 95 %-KI des Mittelwerts = 5,10–7,12 im KO. Die Tryptamin-abhängige Aktivität war im Gehirngewebe im Vergleich zur Lunge signifikant höher (t = 8,38, mittlere Differenz = 8,32, 95 %-KI = 5,87–10,77, p = 0,0002 für WT und t = 10,04, mittlere Differenz = 8,21, 95 %-KI =). 6,31–10,11, p < 0,0001 für KO).

Um die Tryptamin-Methylierungsaktivität aus Gehirn- und Lungengewebe von WT- und KO-Ratten zu charakterisieren, wurde zunächst Dünnschichtchromatographie zur Beurteilung der Reaktionsprodukte eingesetzt und uHPLC-MS/MS wurde implementiert, um eine zusätzliche Validierung und Quantifizierung zu ermöglichen. Bei der Dünnschichtchromatographie ergaben Tryptamin-, NMT- und DMT-Standards Verzögerungsfaktorwerte (RF) von 0,65, 0,55 bzw. 0,47 (Abb. 3, links). Extrakte aus Kaninchen-Glutathion-S-Transferase-INMT-Fusionsproteinen (GST-INMT), exprimiert in E. coli (Positivkontrolle), erzeugten zwei deutliche Flecken, die sowohl mit NMT (RF = 0,53) als auch mit DMT (RF = 0,46) isographisch waren. Rattengewebe, einschließlich Gehirn und Lunge von WT- und KO-Ratten, erzeugten weder mit NMT noch mit DMT isographische Flecken, erzeugten jedoch zwei charakteristische Flecken mit RF-Werten von 0,67 (oben) und 0,37 (unten). Alle Bedingungen, bei denen Tryptamin weggelassen wurde, zeigten keine nachweisbare methylierende Aktivität.

Gehirn- und Lungengewebe von WT- und KO-Ratten produzieren Produkte, die nicht mit NMT oder DMT isografisch sind. Phosphor-Bildgebungsscan radiometrischer Enzymtestprodukte unter Verwendung von Extrakten aus Gehirn- und Lungengewebe von WT- und KO-Ratten nach Trennung auf Kieselgelplatten unter Verwendung einer mobilen Phase aus N-Butanol:Essigsäure:Wasser (12:3:5). Eine Standardmischung (Std), die Tryptamin, NMT und DMT enthielt, wurde mit diesen Chromatographiemethoden klar getrennt (Spur ganz links). Der unbeschnittene und unverarbeitete Phosphor-Imaging-Scan des Diagramms ist als ergänzende Abbildung S2 enthalten.

Für die uHPLC-MS/MS-Analyse von Reaktionsprodukten aus Gewebeextrakttests (Tabelle 1) wurde Tryptamin aus dem entsprechenden Gewebe für jede Bedingung weggelassen, um als Hintergrundkontrolle für die NMT-Spiegel zu dienen.

Als Positivkontrolle wurden Kaninchenlungengewebeextrakte verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Extrakte NMT in einer Konzentration erzeugten, die fast dem 300-fachen der Hintergrundkonzentration entsprach, und DMT in einer Konzentration von (Mittelwert ± Standardabweichung) 0,57 ± 0,18 nM. Diese Aktivität hing von der Zugabe von Tryptamin zur Reaktionsmischung ab. Gehirn- und Lungengewebe von WT- und KO-Ratten zeigten jedoch keine Tryptamin-abhängige Produktion von NMT oder DMT. Diese Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen der Dünnschichtchromatographie überein und bestätigen, dass NMT und DMT unter diesen Testbedingungen nicht durch Enzyme produziert werden, die im Gehirn- oder Lungengewebe von Ratten vorhanden sind.

Extrakte aus E. coli-Zellen, die rekombinante Ratten-, Kaninchen- und menschliche GST-INMT-Fusionsproteine ​​exprimieren, wurden zur radiometrischen Quantifizierung der Tryptamin-abhängigen Aktivität jedes dieser Enzyme verwendet (Abb. 4). Diese Daten belegen eine robuste Tryptamin-abhängige Aktivität sowohl von Kaninchen- als auch von Menschen-INMT und weisen darauf hin, dass Ratten-INMT für die Tryptamin-Methylierung nicht ausreicht.

Ratten-INMT reicht für die Tryptaminmethylierung nicht aus. (a) Western-Blot, der die Expression von GST-INMT-Fusionsproteinen von Ratten-, Kaninchen- und menschlichen INMTs in E. coli zeigt. Die Kontrollspur zeigt die Expression eines leeren Vektors GST, in dem INMT fehlt. Das unbeschnittene Bild des Western Blots ist als ergänzende Abbildung S3 enthalten. (b) Radiometrische Enzymtests mit Extrakten aus E. coli, die GST-Fusions-rekombinante Ratten-, Kaninchen- und menschliche INMT-Proteine ​​exprimieren. Diagramme zeigen den Durchschnitt von 6 einzelnen Experimenten pro Bedingung, wobei Fehlerbalken die Standardabweichungen angeben. CPM = Zählungen pro Minute. Der Assay ergab eine Tryptamin-abhängige Aktivität sowohl von Kaninchen-INMT (durchschnittliche SA = 350,9 ± 23,08, 95 %-KI des Mittelwerts = 326,7–375,1) als auch von menschlichem INMT (durchschnittliche SA = 171,8 ± 12,38, 95 %-KI des Mittelwerts = 158,8–184,8). . Die Aktivität war bei Kaninchen-INMT im Vergleich zu menschlicher INMT signifikant höher (t = 16,75, mittlere Differenz = 179,1, 95 %-KI = 154,3–204, p < 0,0001). Die Aktivität von Ratten-INMT (durchschnittliche SA = 0,64 ± 0,21, 95 %-KI des Mittelwerts = 0,42–0,85) war signifikant niedriger (t = 3,68, mittlere Differenz = – 0,48, 95 %-KI = – 0,77 bis – 0,19, p = 0,004). ) als leere Vektor-GST-Extrakte (durchschnittliche SA = 1,12 ± 0,24, 95 %-KI des Mittelwerts = 0,86–1,37).

Um die Möglichkeit auszuschließen, dass ein Hemmfaktor in den E. coli-Extrakten zum Mangel an Enzymaktivität von Ratten-INMT beiträgt, führten wir identische Experimente mit Flag-markierten rekombinanten Ratten-, Kaninchen- und menschlichen INMT-Proteinen durch, die in menschlichen embryonalen Nieren exprimiert wurden ( HEK) 293 Zellen (Ergänzende Abbildung S4). Um zu bestimmen, ob Ratten-INMT die Fähigkeit besitzt, NMT zu methylieren, wurden die Tests unter Verwendung von GST-INMT-Fusionsproteinen und NMT als Substrat durchgeführt und ähnliche Ergebnisse beobachtet (ergänzende Abbildung S5). Ratten-INMT zeigte keine enzymatische Aktivität gegenüber NMT, Kaninchen- und Human-INMTs waren jedoch beide hoch aktiv.

Zur Identifizierung der Tryptamin-abhängigen Reaktionsprodukte der oben beschriebenen radiometrischen rekombinanten Enzymtests wurde eine mit Phosphor-Bildgebung gekoppelte Dünnschichtchromatographie verwendet. Reine Lösungen von unmarkiertem Tryptamin, NMT- und DMT-Standards wurden mit diesem Lösungsmittelsystem klar getrennt (Abb. 5, links).

Kaninchen und Menschen, aber nicht Ratten INMT methylieren Tryptamin, um NMT und DMT zu produzieren. Phosphor-Imaging-Scan radiometrischer Enzymtestprodukte unter Verwendung rekombinanter GST-INMT-Fusionsproteine ​​nach der Trennung auf Kieselgelplatten unter Verwendung einer mobilen Phase aus N-Butanol:Essigsäure:Wasser (12:3:5). Eine Standardmischung (Std), die Tryptamin, NMT und DMT enthielt, wurde mit diesen Chromatographiemethoden klar getrennt (Spur ganz links). Die Standards zeigten entsprechende RF-Werte von 0,58, 0,49 und 0,39. Kaninchen-INMT, menschliches INMT und Kaninchenlunge zeigten jeweils zwei isografische Punkte sowohl mit NMT als auch mit DMT. Für Kaninchen-INMT, NMT RF = 0,48 DMT RF = 0,41. Für menschliche INMT beträgt NMT RF = 0,48 und DMT RF = 0,41. Für Kaninchenlunge (Positivkontrolle) NMT RF = 0,50 und DMT RF = 0,41. Weder leere Vektor-GST-Präparate noch Ratten-GST-INMT zeigten nachweisbare Produkte, was auf einen Mangel an Methylierungsaktivität hinweist. Ein unbeschnittener, unverarbeiteter Phosphor-Imaging-Scan desselben Diagramms ist als ergänzende Abbildung S6 enthalten.

Rekombinante INMT-Proteine ​​von Kaninchen und Menschen zeigten eine starke Tryptamin-abhängige Methylierungsaktivität, während rekombinantes INMT-Protein von Ratten keine nachweisbare Aktivität gegenüber Tryptamin aufwies.

Wenn NMT anstelle von Tryptamin als Substrat verwendet wurde, wurden ähnliche Ergebnisse beobachtet (ergänzende Abbildung S7): Ratten-INMT produzierte keine methylierten Produkte, Kaninchen- und menschliche INMTs produzierten jedoch DMT, was durch das Vorhandensein von Flecken angezeigt wurde, die mit einem DMT isografisch waren Referenzstandard. Darüber hinaus zeigten alle Bedingungen, unter denen Tryptamin (Abb. 5) oder NMT (Ergänzende Abbildung S7) weggelassen wurde, keine nachweisbare Methylierung, was bestätigt, dass die Reaktionen substratabhängig sind.

Die Validierung dieser Ergebnisse erfolgte mittels uHPLC-MS/MS. Für rekombinante INMT-Studien dienten mit Tryptamin und SAM inkubierte leere Vektor-GST-transformierte E. coli-Extrakte als Hintergrundkontrollen, und der NMT-Wert aus diesen Tests wurde als Hintergrund definiert. Diese Tests zeigten, dass die Tryptamin-abhängige Produktion von NMT und DMT nur bei Kaninchen- und Human-INMT auftrat, wobei Kaninchen-INMT eine um > 50-fach höhere NMT-Produktion aufwies als die Hintergrundkontrollen und Human-INMT > 60-fach höher (Tabelle 2). Im Gegensatz zu Kaninchen- und Menschen-INMT zeigte Ratten-INMT keine nachweisbare Tryptamin-abhängige Produktion von NMT oder DMT. Die aus diesen Tests resultierenden Konzentrationen an enzymatisch hergestelltem DMT betrugen (Mittelwert ± Standardabweichung) 0,23 ± 0,03 bzw. 0,12 ± 0,06 für Kaninchen- bzw. menschliches INMT.

Wenn NMT anstelle von Tryptamin als Substrat verwendet wurde, wurde die Produktion von DMT nur aus INMTs von Kaninchen und Menschen bestätigt, und Ratten-INMT war inaktiv (Ergänzungstabelle S1). Unter allen Bedingungen führte das Weglassen von Tryptamin oder NMT-Substraten zu nicht nachweisbaren Mengen an NMT- und DMT-Produkten. Diese Ergebnisse liefern nicht nur eine präzise Quantifizierung der Analyten, sondern stimmen auch eng mit denen radiometrischer Enzymtests überein und ermöglichen eine Validierung der Ergebnisse der Dünnschichtchromatographie.

Wir berichten zum ersten Mal über die Entwicklung eines neuartigen transgenen INMT-KO-Rattenmodells sowie über eine umfassende Multispezies-Studie von INMT in Bezug auf Tryptamin-abhängige Aktivität und die Biosynthese von NMT und DMT. Darüber hinaus ist diese Studie die erste, die die Tryptamin-abhängige Aktivität von rekombinantem Ratten-INMT untersucht, was für das Fachgebiet relevant ist, da Ratten derzeit die Modellspezies für den In-vivo-DMT-Nachweis im Gehirn sind. Die Kombination traditioneller Techniken (radiometrische Enzymtests und Dünnschichtchromatographie) und moderner Techniken (mit CRISPR/Cas9 entwickelte INMT-KO-Ratten, rekombinante INMT-Vergleiche mehrerer Arten und uHPLC-MS/MS) führt zu einer informativen Charakterisierung der INMT-Funktion , Tryptaminmethylierung und die Biosynthese von endogenem DMT.

Das Hauptergebnis dieser Untersuchung ist, dass INMT für die Tryptaminmethylierung und Biosynthese von NMT und DMT im Gehirn- oder Lungengewebe von Ratten nicht notwendig ist. Mithilfe eines hochempfindlichen radiometrischen Enzymtests zeigen wir, dass Extrakte aus Gehirn- und Lungengewebe von WT- und KO-Ratten unter diesen Testbedingungen gleiche Werte an Tryptamin-abhängiger Aktivität aufweisen. Bei der Untersuchung rekombinanter INMT, die in E. coli-Zellen exprimiert wird, stellten wir fest, dass Ratten-INMT keine Tryptamin-abhängige Aktivität zeigt, während Kaninchen- und Human-INMT beide hoch aktiv sind. Dies ist wahrscheinlich auf den geringen Grad der Sequenzhomologie von INMT zwischen den Arten zurückzuführen. Obwohl die Sequenzen von Kaninchen- und Menschen-INMT nahezu identisch sind (89 %), ist Ratten-INMT mit beiden nur zu 57 % homolog. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass Rattengewebe ein Enzym besitzen, das eine Tryptamin-abhängige Methylierungsaktivität zeigt, dass das verantwortliche Enzym jedoch nicht INMT ist.

Eine mit Phosphor-Bildgebung gekoppelte Dünnschichtchromatographie ergab, dass die methylierten Produkte aus Kaninchenlungengewebe sowie aus rekombinantem Kaninchen- und menschlichem INMT mit NMT und DMT isografisch waren. Ratten-INMT führte jedoch nicht zur Biosynthese nachweisbarer methylierter Produkte, was darauf hindeutet, dass Ratten-INMT die Methylierung von Tryptamin nicht katalysiert. Interessanterweise zeigten Gewebeextrakte aus Gehirn und Lunge von WT- und KO-Ratten gleichzeitig mit den Ergebnissen radiometrischer Tests die gleiche Tryptamin-Methylierungsaktivität und erzeugten bei der Dünnschichtchromatographie zwei charakteristische Flecken. Allerdings war keiner dieser Punkte isografisch mit NMT oder DMT. Diese Ergebnisse stützen die Schlussfolgerung, dass es sich bei dem Enzym, das Tryptamin methyliert, nicht um INMT handelt, und zeigen außerdem, dass die Produkte dieser nicht identifizierten Enzymreaktion weder NMT noch DMT sind. Schließlich replizierten und validierten uHPLC-MS/MS-Experimente die Ergebnisse der Dünnschichtchromatographie – Kaninchenlunge sowie rekombinante INMT von Kaninchen und Menschen (jedoch nicht von Ratten) können unter diesen Testbedingungen NMT und DMT sowie Gewebeextrakte aus Gehirn und Lunge produzieren der WT- und KO-Ratten produzieren kein NMT oder DMT. Zusammengenommen und in Verbindung mit der Tatsache, dass DMT von mehreren Gruppen unabhängig voneinander im Gehirn von Ratten nachgewiesen wurde6,15,16,17,18, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ein alternativer Biosyntheseweg für NMT und DMT im Gehirn- und Lungengewebe von vorhanden ist Ratten. Es ist daher wahrscheinlich, dass eine charakteristische Säugetier-N-Methyltransferase existiert, die Tryptamin methylieren kann, um NMT und DMT zu produzieren.

Es gibt biochemische Beweise für die mögliche Existenz mehrerer Enzyme, die Tryptamin modifizieren. Die bahnbrechende Arbeit von Axelrod im Jahr 19614 nutzte Rohextrakte aus Kaninchenlungengewebe, um die Tryptamin-Methylierungsaktivität zu testen, eine relativ gängige Praxis in der Enzymassay-Methode. Die überwiegende Mehrheit der INMT-Studien in den folgenden drei Jahrzehnten nutzte ähnliche Strategien mit rohen oder teilweise gereinigten Gewebeextrakten als Proteinquellen für sogenannte INMT-Assays. Als immer ausgefeiltere Methoden zur Proteinreinigung verfügbar wurden, wurde in neueren Studien sogar auf die wahrscheinliche Existenz bestimmter Proteine ​​mit Tryptamin-methylierender Aktivität hingewiesen. Unter Verwendung teilweise gereinigter Kaninchenlungenextrakte haben Porta et al. beschrieben zwei charakteristische INMT-ähnliche Tryptamin-methylierende Proteine ​​mit ähnlicher Enzymkinetik, aber unterschiedlichen isoelektrischen Punkten und pH-Optima23. Darüber hinaus identifizierten Ansher und Jakoby aus gereinigten Kaninchenleberextrakten das, was sie als „Methyltransferase A“ und „Methyltransferase B“ bezeichneten19. Diese beiden Formen von INMT zeigten Tryptamin-methylierende Aktivität und hatten das gleiche Molekulargewicht, unterschieden sich jedoch in ihren isoelektrischen Punkten und Substratwechselwirkungen. Unsere Ergebnisse motivieren ähnliche Studien in Geweben von Ratten und Menschen, um festzustellen, ob alternative Tryptamin-methylierende Enzyme vorhanden sind.

Es ist bekannt, dass das Verhalten einzelner Enzyme unter In-vitro-Bedingungen stark von einer Reihe experimenteller Variablen abhängt, darunter pH-Wert, Temperatur, Ionenstärke, Konzentration der Testkomponenten, Pufferzusammensetzung und Wechselwirkungen verschiedener Cofaktoren oder nicht direkter Komponenten an der Reaktion beteiligt24. Daraus kann man vernünftigerweise schließen, dass unter den aktuellen In-vitro-Bedingungen die Methylierung von Tryptamin zu NMT und DMT in Rohextrakten aus Rattengehirn und -lunge nicht möglich ist. Stattdessen begünstigten diese Bedingungen die Aktivität eines alternativen Enzyms, das zur Produktion der in Abb. 3 gezeigten nicht identifizierten Produkte beitrug. In mehreren Studien wurden In-vivo-Ansätze verwendet, um das Vorhandensein von endogenem DMT im Rattenhirn nachzuweisen6,15,17, 18,25, wobei die Bedeutung der physiologischen Bedingungen in vivo für die Methylierung von Tryptamin im Gehirngewebe von Ratten hervorgehoben wird. Wir spekulieren daher, dass eine Erforschung alternativer Testbedingungen oder ein gründlicheres Enzymscreening zur nachweisbaren Produktion von NMT und DMT in Rattengeweben führen würde. Diese Studien werden von entscheidender Bedeutung sein, um die Funktion, Regulation und Biosynthesewege von endogenem DMT besser zu verstehen.

Die Identität der Produkte, die aus Gehirn- und Lungenextrakten von WT- und KO-Rattengeweben hergestellt werden, ist derzeit unbekannt, wahrscheinliche Kandidaten für diese Verbindungen könnten die β-Carboline und die damit verbundenen Alkaloide sein. β-Carboline sind eine häufig vorkommende Klasse von Verbindungen, die als MAOIs dienen und durch ihr trizyklisches, Pyridin-kondensiertes Indolgerüst gekennzeichnet sind. Bisher wurden mehr als 500 trizyklische β-Carbolin-Alkaloidmonomere aus natürlichen Quellen isoliert26. Interessanterweise ist Tryptamin seit langem als Reaktant bei der Biosynthese verschiedener β-Carboline über die Pictet-Spengler-Reaktion bekannt, eine chemische Reaktion, die zur Kondensation von Tryptamin und anschließendem Ringschluss führt27. Diese Reaktion kann nicht-enzymatisch oder enzymatisch über das Enzym Strictosidin-Synthase28 erfolgen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass mehrere β-Carbolin-Alkaloide im Gehirngewebe von Säugetieren, einschließlich Ratten, vorhanden sind29, und andere Studien haben über die mögliche Bildung von β-Carbolin-Alkaloiden berichtet, die ähnliche Tests wie die aktuelle Studie verwendeten30,31. Unter Berücksichtigung dieses Mechanismus ist es daher sinnvoll, die Hypothese anzunehmen, dass es sich bei den Produkten, die aus der Inkubation von Gehirn- und Lungengewebe von Ratten mit Tryptamin resultieren, tatsächlich um β-Carbolinalkaloide handeln könnte. Unabhängig von der Identität der unbekannten Reaktionsprodukte ist die enzymatische Produktion dieser von Tryptamin abgeleiteten Verbindungen eindeutig unabhängig von INMT, was auf die Existenz eines alternativen Enzyms hinweist, das Tryptamin in Säugetieren modifiziert. Eine Untersuchung dieser Produkte und ihrer jeweiligen Biosynthesewege wird wahrscheinlich zu einem tieferen Verständnis der Tryptamin-Metaboliten in der Physiologie von Säugetieren führen. Die Verfügbarkeit von INMT-KO-Ratten sollte das weitere Verständnis der endogenen Funktion dieses Enzyms bei Ratten erleichtern.

Zusammenfassend bestätigen unsere Ergebnisse, dass Kaninchen-INMT, menschliches INMT und Kaninchen-Lungengewebeextrakte alle in der Lage sind, Tryptamin zu methylieren, um sowohl NMT als auch DMT zu bilden. Allerdings produzieren Ratten-INMT und Gewebeextrakte aus Rattengehirn und Rattenlunge unter den derzeit untersuchten Bedingungen weder NMT noch DMT. Rattengewebe interagieren vielmehr mit Tryptamin, um alternative Produkte zu produzieren, und INMT ist für diese Reaktion nicht erforderlich. Da die In-vivo-Präsenz von DMT im Gehirn von Ratten gut belegt ist, deuten diese Ergebnisse auf die mögliche Existenz eines alternativen Biosynthesewegs für DMT in der Physiologie von Säugetieren hin.

Alle Tiere wurden ab 7 Uhr morgens in einem Licht-Dunkel-Zyklus von 12:12 Uhr gehalten und hatten nach Belieben Zugang zu Futter und Wasser. Die Studie wurde vom Animal Care and Use Committee der University of Michigan in Ann Arbor genehmigt und alle Methoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Empfehlungen dieses Komitees durchgeführt. INMT-KO-Ratten wurden in einem F344-Hintergrund unter Verwendung von CRISPR/Cas9 am Transgenic Animal Model Core an der University of Michigan über eine 2-Basenpaar-Deletion in Exon 1 der INMT-Kodierungssequenz erzeugt. Am 21. postnatalen Tag wurden die Rattenjungen entwöhnt und 1-mm-Schwanzabschnitte zur Genotypisierung unter Verwendung eines Standard-DNA-Extraktionsverfahrens in sterilen Röhrchen gesammelt. Die Ratten wurden entweder als WT (INMT +/+) oder KO (INMT −/−) identifiziert. oder heterozygot (INMT + /−). Für Enzymtests zum Vergleich von WT- und KO-Ratten wurden heterozygote Ratten gezüchtet, um Würfe zu produzieren, die beide Genotypen enthielten, und Wurfgeschwister wurden für INMT-Testvergleiche zwischen WT- und KO-Ratten verwendet. Ausschlusskriterien für Ratten wurden a priori definiert und umfassten (1) einen heterozygoten Genotyp und (2) jede offensichtliche Verhaltens- oder physiologische Anomalie. Daher wurden in der Studie nur WT- und KO-Ratten verwendet und alle Ratten waren zum Zeitpunkt der Tötung gesund. Alle Verfahren entsprachen den empfohlenen ARRIVE-Richtlinien.

INMTs von Ratten (NM_001109022.1), Kaninchen (NM_001082043.1) und Menschen (NM_006774.5) wurden durch PCR unter Verwendung der folgenden Primersequenzen erzeugt: Die menschlichen Sense- und Antisense-Primer waren 5'-AAAAGGATCCATGAAGGGTGGCTTCACTGGG-3′ und 5′-AAAAGAATTCTCAGGGCCCAGGCTTCTTGCG-3′. Die Kaninchen-Sense- und Antisense-Primer waren 5'-AAAAGGATCCATGGAGGGCGGCTTCACGGG-3' bzw. 5'-AAAAGAATTCTCAGGACCCCGGCTTCTTGC-3'. Die Sense- und Antisense-Primer der Ratte waren 5'-AAAAGGATCCATGGCAGGCAAGGTATACATG-3' bzw. 5'-AAAAGAATTCTCAGGCACTGGGACCCTTTCG-3'. Jeder der Klone wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme BamH I und EcoR I in bakterielle pGEX-2TK-Expressionsvektoren eingebaut. Diese Vektoren enthielten Glutathion-S-Transferase (GST)-Gene, die dazu dienen, die Löslichkeit und Expression rekombinanter INMTs zu erhöhen. Klone wurden zur Expression in E. coli in BL21 (DE3) (Sigma Aldrich #CMC0015) transformiert. Den Kolonien wurden 15–18 Stunden lang bei 37 °C 25 ml LB-Ampicillin inokuliert. Anschließend wurden die Zellen geerntet, pelletiert, der Überstand verworfen und die Zellen vor der Zelllyse und Dialyse bei –20 °C eingefroren.

Für Gehirn- und Lungenextrakte wurden Ratten (10 Wochen alt) durch CO2-Inhalation eingeschläfert und enthauptet. Das gesamte Gehirn und die gesamte Lunge wurden schnell extrahiert, gewürfelt und sofort in Mikrozentrifugenröhrchen auf Trockeneis eingefroren. Gefrorenes Kaninchenlungengewebe wurde von Pel-Freez Biologicals bezogen. Gefrorene Gewebe (Rattenhirn oder -lunge oder Kaninchenlunge) und gefrorene GST-INMT-Pellets wurden in 5 Volumina 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,9) resuspendiert und mit drei Stößen bei 6000 U/min homogenisiert. Homogenate wurden 60 Minuten lang bei 4 °C und 100.000 g zentrifugiert. Überstände wurden über Nacht bei 4 ° C mit 100 Volumina Natriumphosphatpuffer mit 3 Pufferwechseln alle 4 Stunden unter Verwendung von Pur-A-Lyzer Maxi-Dialysekits (Sigma Aldrich) mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 12 kDa dialysiert. Die Proteinkonzentrationen der dialysierten Überstände wurden mittels Bradford Assay (Bio-Rad) bestimmt und die verbleibenden Fraktionen wurden aliquotiert und für Enzymtests bei –80 °C gelagert. Um die INMT-Expression zu bestätigen, wurden alle Gewebe- und GST-INMT-Extrakte per Western Blot analysiert. 30 µg jedes Proteins wurden in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die β-Mercaptoethanol enthielt, denaturiert und 5 Minuten lang bei 100 °C gekocht. Die Proben wurden auf Standard-SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und auf Nitrozellulose elektrogeblottet. Die Western-Blot-Analyse wurde mit Ratten-INMT-Antikörpern (polyklonaler Kaninchentyp, kundenspezifisch bei GenScript bestellt), Tubulin-Antikörpern (monoklonaler Maustyp von Developmental Studies Hybridoma Bank) und GST-Antikörpern (monoklonaler Maustyp von Fisher) durchgeführt, gefolgt von einer Inkubation mit mit Infrarot-Fluorophor markierten Sekundärantikörpern gegen Kaninchen und Maus (Li-COR). Die Banden wurden mit einem Infrarotscanner Li-COR Odyssey erkannt. Die resultierenden Western-Blot-Bilder (Abb. 2 und 4) werden als beschnittene Versionen der unverarbeiteten Rohdateien präsentiert. Nicht zugeschnittene Bilder finden Sie in den ergänzenden Materialien.

Zu den Proteinquellen für Enzymtests gehörten Gewebeextrakte (Kaninchenlunge, Rattenhirn, Rattenlunge) und rekombinante GST-INMTs (Ratte, Kaninchen und Mensch). Enzymtests wurden in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen durchgeführt und enthielten etwa 50 µg Protein (die Stammproteinkonzentrationen lagen zwischen 4,1 und 6,9 mg/ml für Rattenhirn, 10,6–14,6 mg/ml für Ratten- und Kaninchenlunge und 0,75–1,05 mg/ml). für rekombinante GST-INMTs). Radiometrische Enzymtests verwendeten 4 mM Tryptamin (Sigma Aldrich) oder NMT (Cayman Chemical) zusammen mit 2,3 nmol C14-SAM (spezifische Aktivität 52,6 mCi/mmol, PerkinElmer Inc.) in einem Endreaktionsvolumen von 150 µL mit Natriumphosphatpuffer. Die Testkomponenten wurden kombiniert und 60 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 ml eiskaltem 0,5 M Boratpuffer (pH 9,5) gestoppt. Um Reaktionsprodukte zu extrahieren, wurden die Reaktionsmischungen in 15-ml-Falcon-Röhrchen mit 6 ml einer 97:3 Toluol:Isoamylalkohol (T:IAA)-Lösung überführt und die Röhrchen drei Mal für jeweils 5 Sekunden gevortext und bei 1.650 g zentrifugiert 3 Minuten. Zur Quantifizierung wurden 4 ml der organischen T:IAA-Schicht in Szintillationsfläschchen gegeben, die 5 ml Szintillationscocktail (Ultima Gold; PerkinElmer Inc.) enthielten, und die Radioaktivität wurde 1 Minute lang auf einem Beckman LS Szintillationszähler gezählt. Röhrchen ohne Substrat (Tryptamin) dienten als Hintergrundkontrollen. Die spezifische Aktivität (SA) wurde berechnet, indem der durchschnittliche CPM von 3 Hintergrundkontrollen für jede Bedingung subtrahiert und der resultierende CPM-Wert durch die verwendete Proteinmenge (µg) dividiert wurde. Die Ergebnisse werden als Durchschnittswerte von Dreifachversuchen in Gehirn- und Lungengewebe für n = 6 Ratten pro Genotyp und als 6 Wiederholungsexperimente für jede GST-INMT-Bedingung dargestellt. Zur Analyse mittels uHPLC-MS/MS-Analyse wurden nichtradioaktive Tests durchgeführt. Bei diesen Tests wurde 1 mM Tryptamin oder NMT mit 33 µM SAM in einem Endreaktionsvolumen von 150 µL mit Natriumphosphatpuffer verwendet. Die Testkomponenten wurden kombiniert und 60 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Röhrchen ohne Substrat dienten als Hintergrundkontrollen. Reaktionsprodukte wurden sofort durch Zugabe von 1 ml T:IAA extrahiert und verwirbelt. 950 µL der organischen Phase wurden in ein neues 1,5-ml-Röhrchen überführt und das organische Lösungsmittel wurde auf einem VacuFuge™-Tischkonzentrator (Eppendorf) bei Raumtemperatur 2 Stunden lang verdampft. Die resultierenden Produkte wurden in 1 ml 30 % Methanol resuspendiert, 3 Minuten lang gevortext und mittels uHPLC-MS/MS analysiert (siehe unten für „Methoden“). Proben, die NMT als Substrat hatten, wurden in 30 % Methanol weiter um das Zehnfache verdünnt. Tests mit Gewebeextrakten wurden für jede Ratte doppelt durchgeführt (n = 6 pro Genotyp), und Tests mit GST-INMT-Extrakten wurden für jede Bedingung dreifach durchgeführt, wobei leere Vektor-GST-Transformationen als Hintergrundkontrollen dienten. Die Probenidentitäten wurden mittels LC für die von NGG durchgeführte uHPLC-MS/MS-Analyse verblindet

Zur Produktanalyse wurden INMT-Tests für alle Gewebe und rekombinanten GST-INMTs unter Verwendung der oben für radiometrische Enzymtests beschriebenen Methoden wiederholt. Die Reaktionen wurden in vierfacher Ausfertigung mit oder ohne Tryptamin in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vorbereitet. Zur Produktextraktion wurde unmittelbar nach dem Test 1 ml T:IAA in die Reaktionsröhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden dreimal im Abstand von 5 Sekunden geschüttelt und 3 Minuten lang bei 13.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde dann in saubere Mikrozentrifugenröhrchen überführt und über Nacht bei 50 °C im Eppendorf Thermomixer eingedampft. Die resultierenden Produkte aus vier Wiederholungen für jede Bedingung wurden unter Verwendung von 100 µL T:IAA gepoolt. Vor dem Spotting wurden Silicagel-Dünnschichtchromatographieplatten 30 Minuten lang in einem Ofen bei 90 °C aktiviert und ein Dünnschichtchromatographie-Entwicklungstank aus Glas mit 50 ml mobiler Phase bestehend aus N-Butanol, Essigsäure usw. vorgefüllt Wasser (12:3:5). Die Platten wurden mit einer Mischung von Standards, darunter jeweils 0,5 µg Tryptamin, NMT und DMT in T:IAA, zusammen mit 50 µl gepoolten Enzymassay-Reaktionsprodukten im Abstand von 1,0 cm getupft. Die Platte wurde etwa 2 Stunden lang in den Entwicklungstank gelegt, dann herausgenommen und 1 Stunde lang an der Luft trocknen gelassen. Tryptamin-, NMT- und DMT-Standards (sichtbar unter ultraviolettem Licht) sowie die Produktursprünge und Lösungsmittelfronten wurden mit einer verdünnten Mischung aus C14-SAM überfleckt, um diese Stellen mit Phosphorbildgebung sichtbar zu machen. Zur Entwicklung wurde die Platte in Plastikfolie eingewickelt und 72 Stunden lang in einem Leuchtstoffschirm (Molecular Dynamics) gelagert. Die Abbildung des Bildschirms erfolgte mit einem Amersham Typhoon Phosphorimager mit Photomultiplier-Röhrenempfindlichkeit bei 1.000 V, normaler Scangeschwindigkeit und einer Pixelgröße von 100 µm. Die resultierenden Bilder (Abb. 3 und 5) wurden zugeschnitten, um Fleckenlinien und Lösungsmittelfronten auszuschließen, und mit der Bildgebungssoftware Amersham Typhoon global modifiziert, um die Sichtbarkeit der Reaktionsprodukte zu verbessern. Rohe, unbeschnittene und unbearbeitete Bilder finden Sie in den ergänzenden Materialien. Die Werte des Verzögerungsfaktors (RF) wurden bestimmt, indem die Wanderungsstrecke des gelösten Stoffes durch die Wanderungsstrecke der Lösungsmittelfront dividiert wurde.

Obwohl radiometrische Tests äußerst empfindlich sind und extrem niedrige Enzymaktivitätswerte nachweisen können, liefern sie keine Informationen über die Identität der Reaktionsprodukte. Die Dünnschichtchromatographie eignet sich zur Visualisierung einer Reihe von Reaktionsprodukten, der Technik mangelt es jedoch häufig an Auflösung. uHPLC-MS/MS bietet jedoch sowohl ein hohes Maß an Empfindlichkeit als auch Auflösung bei der Analytidentifizierung und stellt einen Goldstandard für die Analyttrennung, -detektion und -quantifizierung dar. Darüber hinaus nutzt unsere uHPLC-MS/MS-Methode mehrere Techniken zur definitiven Bestätigung der Analytidentifizierung, einschließlich Retentionszeit mittels uHPLC, Triple-Quadrupol-Mehrfachreaktionsüberwachung sowohl von Vorläufer- als auch Produkt-Ionen sowie versetzte deuterierte interne Referenzstandards für NMT und DMT.

Um die Konzentrationen von NMT und DMT zu bestimmen, wurden 10 µL der 30 %igen Methanol-Resuspension (siehe Abschnitt „Enzymtests“) mit 10 µL einer Mischung versetzt, die 100 nM d3-NMT und d6-DMT (Toronto Research Chemicals) in deuterierter Form enthielt Interne Standards zur Normalisierung der Extraktionseffizienz und der Massenspektrometrie-Ionisationseffizienz. Kalibrierungslösungen von NMT und DMT wurden in 30 % Methanol hergestellt, um einen Kalibrierungsbereich von 0,625–125 nM für NMT und 0,125–25 nM für DMT zu schaffen. Kalibrierungsstandards wurden wie oben beschrieben mit der internen Standardlösung versetzt und vor jedem Analysetag injiziert. 6-Punkt-Kalibrierungskurven wurden basierend auf dem Peakflächenverhältnis des Kalibrierstandards zum internen Standard durch lineare Regression ermittelt. Alle Proben und Standards wurden unter Verwendung einer Phenomenex Kinetex C18-Chromatographiesäule (100 × 2,1 mm, 1,7 μm, 100 Å) auf einem Vanquish uHPLC (Thermo Fisher Scientific, Gemering, Deutschland) analysiert, der an ein TSQ Quantum Ultra-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (Thermo) angeschlossen war Fisher Scientific, San Jose, CA). Die mobile Phase A war 10 mM Ammoniumformiat mit 0,15 % (v/v) Ameisensäure in Wasser. Die mobile Phase B war Acetonitril. Der verwendete Gradient war wie folgt: anfänglich 5 % B; 0,01 Min., 19 % B; 0,68 Min., 26 % B, 1,05 Min., 75 % B; 1,8 Min., 100 % B; 2,2 Min., 100 % B; 2,3 Min., 5 % B; 3,0 Min., 5 % B bei 600 μL/Min. Das Probeninjektionsvolumen betrug 7,5 µL, der Autosampler wurde bei Umgebungstemperatur gehalten und die Säule wurde im Ruheluftmodus auf 30 °C gehalten. NMT eluierte bei 0,92 Minuten und DMT bei 0,96 Minuten. Die Elektrospray-Ionisation wurde im positiven Modus bei 4 kV verwendet. Die Kapillartemperatur betrug 325 °C, die Verdampfertemperatur betrug 300 °C, der Hüllgasdruck betrug 50 und der Hilfsgasdruck betrug 10. Ionen wurden im Tandem-Massenspektrometriemodus nachgewiesen. Die Scanparameter für alle 4 Analyten waren wie folgt. NMT: Vorläuferion m/z = 175, Produkt-Ion m/z = 143,8, Kollisionsenergie = 14, Tubuslinse = 53. d3-NMT: Vorläuferion m/z = 178, Produkt-Ion m/z = 143,8, Kollisionsenergie = 14, Tubuslinse = 65. DMT: Vorläuferion m/z = 189,1, Produktion-Ion m/z = 144,1, Kollisionsenergie = 19, Tubuslinse = 49. d6-DMT: Vorläufer-Ion m/z = 195,1, Produktion-Ion m/z = 144,1, Kollisionsenergie = 19, Tubuslinse = 49. Die automatisierte Peakintegration wurde mit der XCalibur 3.0 MS-Software durchgeführt und alle Peaks wurden visuell überprüft, um eine ordnungsgemäße Integration sicherzustellen.

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism Version 9.4.1 (La Jolla, CA) durchgeführt. Bei radiometrischen Enzymtests zeigten alle Daten eine Normalverteilung, die durch den Shapiro-Wilk-Normalitätstest bestätigt wurde. Für alle statistischen Vergleiche wurden ungepaarte, parametrische, zweiseitige T-Tests mit Welch-Korrektur verwendet. Im Text werden p-Werte, Mittelwerte ± Standardabweichungen, Mittelwerte der Differenzen, 95 %-Konfidenzintervalle (KI) und t-Werte angegeben. α = 0,05 für alle Tests.

Daten und Reagenzien sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor (JB) erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Molekulare und Integrative Physiologie, dem MCube-Stipendium (an JB, MMW und YK), einem Stipendium des Center for Consciousness Science (an JB) der University of Michigan und einem Stipendium von PharmaDrug unterstützt Inc. (an JB). Wir danken Dr. Brian Shay, der uns zu uHPLC-MS/MS-Techniken beraten hat, Gregg Sobocinski, der Phosphor-Imaging-Studien unterstützt hat, sowie Dr. Steven Barker, der wertvolle Einblicke und Ratschläge zur experimentellen Methodik und Interpretation der Ergebnisse gegeben hat. MMW wurde durch den National Institutes of Health (NIH) Grant NS099160 und den VA Grant BX003824 unterstützt. RTK wurde von NIH RF1NS128522 unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Nicolas G. Glynos und Lily Carter.

Abteilung für molekulare und integrative Physiologie, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA

Nicolas G. Glynos, Lily Carter, Michael M. Wang und Jimo Borjigin

Michigan Psychedelic Center, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA

Nicolas G. Glynos, George A. Mashour und Jimo Borjigin

Abteilung für Neurologie, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA

Soo Jung Lee, Michael M. Wang und Jimo Borjigin

Veterans Affairs Ann Arbor Healthcare System, Ann Arbor, MI, USA

So Jung Lee und Michael M. Wang

Fakultät für Chemie, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA

Youngsoo Kim & Robert T. Kennedy

Abteilung für Anästhesiologie, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA

George A. Mashour

Graduiertenprogramm für Neurowissenschaften, University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA

George A. Mashour, Michael M. Wang und Song Borjigin

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JB konzipierte die Idee der Studie und leitete die Experimente. LC und NGG führten Experimente durch und analysierten Daten mit Hilfe von JBSJL. Die Arbeit an rekombinanten Proteinen wurde von SJL und MMW geleitet und unterstützt. Die Entwicklung und Analyse von uHPLC-MS/MS-Methoden wurde von YK und RTK unterstützt. Die Erzeugung von INMT-KO-Ratten wurde von GAM unterstützt. NGG hat das Manuskript mit Hilfe von JB und LC geschrieben

Korrespondenz mit Jimo Borjigin.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Glynos, NG, Carter, L., Lee, SJ et al. Indolethylamin-N-Methyltransferase (INMT) ist für die endogene Tryptamin-abhängige Methylierungsaktivität bei Ratten nicht essentiell. Sci Rep 13, 280 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-27538-y

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Eingegangen: 26. September 2022

Angenommen: 04. Januar 2023

Veröffentlicht: 06. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27538-y

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