Ein in - Chengdu Kryospeicher Co., Ltd

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1545 (2023) Diesen Artikel zitieren

1750 Zugriffe

21 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Hauptprotease von SARS-CoV-2 (Mpro) ist für die Spaltung des viralen Polyproteins verantwortlich. Die Selbstverarbeitung von Mpro wird als Reifung bezeichnet und ist für die Dimerisierung und Aktivität von Enzymen von entscheidender Bedeutung. Hier verwenden wir C145S Mpro, um die Struktur und Dynamik der N-terminalen Spaltung in Lösung zu untersuchen. Die native Massenspektroskopieanalyse zeigt, dass gemischte oligomere Zustände aus gespaltenen und ungespaltenen Partikeln bestehen, was darauf hindeutet, dass die N-terminale Prozessierung für die Dimerisierung nicht entscheidend ist. Eine 3,5 Å-Kryo-EM-Struktur liefert Details der N-terminalen Spaltung von Mpro außerhalb der Einschränkungen der Kristallumgebung. Wir zeigen, dass verschiedene Klassen von Inhibitoren das Gleichgewicht zwischen oligomeren Zuständen verschieben. Während der nichtkovalente Inhibitor MAT-POS-e194df51-1 die Dimerisierung verhindert, induziert der kovalente Inhibitor Nirmatrelvir die Umwandlung von Monomeren in Dimere, selbst bei intakten N-Termini. Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Mpro-Dimerisierung durch eine induzierte Anpassung aufgrund einer kovalenten Bindung während der Substratverarbeitung und nicht durch die N-terminale Verarbeitung ausgelöst wird.

Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ist der Erreger von COVID-191. Wie SARS-CoV und das Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) ist SARS-CoV-2 ein einzelsträngiges RNA-Virus (ssRNA), das zur Gattung der Beta-Coronaviren gehört1,2. Das SARS-CoV-2-Genom besteht aus fast 30.000 Nukleotiden und enthält das ORF1ab-Gen, einen großen offenen Leserahmen (ORF), der für die Kodierung von 16 nichtstrukturellen Proteinen (nsp) als zwei Polyproteine nach ribosomaler Rasterverschiebung verantwortlich ist, die als 1a und bezeichnet werden 1b1,2,3. Die proteolytische Verarbeitung viraler Polyproteine ist für den viralen Lebenszyklus von wesentlicher Bedeutung und wird von zwei SARS-CoV-2-kodierten Cysteinproteasen durchgeführt: der Papain-ähnlichen Protease (PLpro), die eine der Domänen von nsp3 ist, und der viralen Hauptprotease (Mpro oder 3CLpro), codiert durch nsp54,5. PLpro spaltet das virale Polyprotein an drei Stellen, während Mpro für die Spaltung des Polyproteins an elf verschiedenen Stellen4,5 verantwortlich ist, einschließlich seiner eigenen N- und C-Termini6. Mpro ist eines der vielversprechendsten Ziele für die Arzneimittelentwicklung gegen SARS-CoV-25,7. Alle gesammelten strukturellen und biochemischen Informationen zu diesem Ziel waren entscheidend für die schnelle Entwicklung neuer antiviraler Medikamente8,9,10,11, einschließlich des jüngsten Medikaments Paxlovid/Nirmatrelvir10, das in den USA, Europa und China für den Notfallgebrauch zugelassen wurde.

Um heterolog exprimiertes reifes Mpro zu erhalten, wählten die Forscher die allgemeine Strategie, den C-terminalen Teil von nsp4 zum N-terminalen Teil von nsp5-Konstrukten hinzuzufügen, was die Selbstspaltung und Dimerisierung von Mpro in vitro6 ermöglichte. Zuvor haben wir die Aktivität und das biochemische Profil der SARS-CoV-2-Mpro-C145S-Mutante beschrieben, die den C-terminalen Teil von nsp4 an ihren N-Termini enthält6. Diese Serinmutation erzeugte eine aktive, aber viel langsamere Version von Mpro, ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der biochemischen Aspekte dieses Enzyms. Anders als das dimere Mpro verhielt sich diese Probe in Lösung wie eine dynamische Mischung aus Monomeren, Dimeren, Trimeren und Tetrameren6. Die Restaktivität dieser Serinmutante ermöglichte die langsame Spaltung des N-Termini-nsp4-nsp5-Peptids, was es uns ermöglichte, die oligomeren Zustände von Mpro in Lösung während des Reifungsprozesses zu überwachen6. Wir beobachteten, dass die tetramere Form von Mpro C145S im Laufe von zwei Tagen das Gleichgewicht als Dimere erreicht, ein Phänomen, das direkt proportional zur N-Terminus-Spaltung ist, und folgern daraus, dass die N-Terminus-Prozessierung für die Dimerisierung entscheidend war6. Darüber hinaus haben wir zuvor die Kristallstruktur von Mpro C145S im Komplex mit dem C-terminalen Peptid nsp5-nsp6, das aus der tetrameren Mpro-Probe erhalten wurde, enthüllt und damit eine detaillierte Darstellung dieses wichtigen Spaltungsreifungsereignisses präsentiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich zwei reife Mpro-Dimere in einem transienten Dimer-Dimer-Komplex zusammensetzen, wobei der C-Terminus eines Mpro-Moleküls in Richtung des aktiven Zentrums eines anderen Moleküls positioniert wird und es anschließend zu einer C-terminalen Prozessierung in einem Transspaltungsereignis kommt6.

Hier berichten wir über die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM)-Struktur der SARS-CoV-2 Mpro C145S-Mutante, die den nsp4-nsp5-Spaltungsanteil enthält, mit einer Auflösung von 3,5 Å. In dieser Struktur erhalten wir einen Einblick in den Lösungszustand von Mpro, das während der N-terminalen Verarbeitung an zwei ungefaltete nsp5-Protomere gebunden ist. Wir zeigen, dass die Dimerisierung nicht wie zuvor angenommen von der N-terminalen Prozessierung abhängt, sondern wahrscheinlich eine Folge der induzierten Anpassung ist, die für die kovalente Bindung während der Substratprozessierung erforderlich ist.

Die native Massenspektroskopieanalyse von Peaks, die Multimere von SARS-CoV-2 Mpro C145S enthalten, ergab, dass die Probe aus einer Mischung von Monomeren, Dimeren, Trimeren und Tetrameren besteht (Abb. 1), wie zuvor durch SEC-MALS-Analyse angezeigt6. Darüber hinaus haben wir Monomerpartikel beobachtet, die Sequenzen von gefalteten und ungefalteten ungespaltenen nsp4-nsp5-Peptiden enthalten. Im Einklang mit unserem vorherigen Reifungsmodell, bei dem die Spaltung des N-terminalen Peptids als Auslöser für die Dimerisierung dient.

Von links nach rechts zeigen die Peaks gespaltene (blauer Halbkreis) und ungespaltene (roter Halbkreis) Monomere, aus gespaltenen (blaue Kreise) oder halbgespaltenen (blau-roter Kreis) Partikel gebildete Dimere und aus zwei gespaltenen und einem ungespaltenen Partikel gebildete Trimere ( zwei Drittel blaue, ein Drittel rote Kreise) und Tetramere, die aus zwei gespaltenen und zwei ungespaltenen Partikeln bestehen (zwei Viertel blau, zwei Viertel rot). Kleinere Peaks anderer Formen werden in ergänzenden Materialien beschrieben. Die Diagramme wurden aus einzelnen nativen Massenspektrometrieexperimenten erstellt.

Allerdings ergab die native Massenspektroskopie auch, dass die Peaks mit oligomeren Zuständen durch die Kombination von ungespaltenen (theoretische Masse 34.554,54 Da) und gespaltenen (theoretische Masse 33.780,58 Da) nsp4-nsp5-Partikeln gebildet werden könnten. Das Gleiche gilt sowohl für Trimer- als auch Tetramer-Peaks, die überraschenderweise aus allen Kombinationsmöglichkeiten gespaltener und nicht-gespaltener Peptide bestehen könnten (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1). Dies widerspricht vorläufigen Modellen der Mpro-Reifung, bei denen die N-terminale Verarbeitung die Dimerisierung vorgibt6,12,13. Anhand der relativen Massengrößen wird auch deutlich, dass die Gleichgewichte der oligomeren Zustände die Zustände begünstigen, in denen mehr gespaltene Elemente vorhanden sind (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1), was immer noch zu diesem Modell passt, wenn die N-terminale Spaltung direkt an der Dimerisierung beteiligt ist .

Um diese Ergebnisse zu bestätigen, führten wir eine sekundäre native Massenspektroskopieanalyse von Probe 2 mit einem anderen Aufbau durch. Mit einem Orbitrap Q-Exactive UHMR wurden sieben Ladungszustandsverteilungen beobachtet. Wir haben die Daten mit dem vorherigen Lauf des Agilent-Geräts in der ergänzenden Abbildung 6 verglichen. Eine reichlich vorhandene Ladungszustandsverteilung in der Nähe von m/z ~ 2500 und zentriert bei 11+ Ion entspricht Mpro mit einer Molekülmasse von 34.556 ± 24 Da (m1 in der ergänzenden Abbildung). . 6). Es wird auch eine Ladungszustandsverteilung mit geringer Häufigkeit und einer ähnlichen Ladungsgröße beobachtet, was einer Spezies mit einer Masse von 33.865 ± 44 Da (m2 in ergänzender Abbildung 6) entspricht. Diese beiden Ladungszustandsverteilungen können den unterschiedlichen Mpro-Monomeren zugeordnet werden. Zwischen m/z 4000–5000 sind mehrere Peakreihen zu finden (die alle im Ladungszustand 16 + zentriert sind), die Ionen mit Molekulargewichten entsprechen, die mit m1m1-Homo- und m1m2-Heterodimeren übereinstimmen, d. h. 67.687 ± 44 Da für Homodimere und 68.466 ± 9 Da für Heterodimere. Interessanterweise entsprechen die zusätzlichen Peaks im Spektrum Ladungszuständen, die sich zu Molekulargewichten entfalten, die mit oligomeren Zuständen höherer Ordnung mit unterschiedlichen Mengen an m1 und m2 übereinstimmen. Dennoch zeigen die Daten, dass Probe 2 aus nativen Partikeln besteht, die gespaltene und ungespaltene Protomere kombinieren, was unsere vorherige Beobachtung bestätigt.

Hier beschreiben wir die Kryo-Em-Struktur von SARS-CoV-2 Mpro C145S bei 3,5 Å (Abb. 2). Das endgültige Modell zeigte alle 306 Reste von C145S Mpro, die für beide Ketten sichtbar waren, sowie klare Hinweise auf ein mindestens 11 Reste langes Peptid, das beide aktiven Stellen besetzte (Abb. 3a). Das endgültige Modell zeigte keine Rotamere, Cβ- oder Ramachandran-Ausreißer und einen Kartenmodell-Korrelationskoeffizienten (CC) von 0,80 (Abb. 3b, c). Modell und/oder Karte wurden unter den Codes 8EY2 (für PDB) und EMD-28666 (für EMDB) hinterlegt. Das endgültige Kryo-EM-Modell ist den durch Röntgenstrahlen bekannten Strukturen sehr ähnlich (Abb. 3d), mit einem RMSD von 0,7 Å (für 3.909 Atome) im Vergleich zur reifen dimeren Form von Mpro (PDB 7KPH) oder 1,2 Å (für 3.822 Atome) im Vergleich zur Röntgenstruktur der C145S-Mutante (PDB 7N5Z) (Abb. 3d und e). Statistiken und Parameter aus der Datenerfassung und -verarbeitung sind in Tabelle 1 verfügbar.

a Ausgerichtete mikroskopische Aufnahmen, mit Maßstabsleiste unten. b CTF-Funktion berechnet aus erhaltenen Schliffbildern. c Beispiele für extrahierte Partikel. d Detaillierte schematische Darstellung der Schritte zur endgültigen Rekonstruktion, Hervorhebung der erhaltenen 2D- und 3D-Klassen und erste hochauflösende Rekonstruktion. e Fourier-Shell-Korrelation (FSC) zwischen Halbkarten der endgültigen Rekonstruktionen. Oben zeigt die Grafik die FSCs im Verhältnis zur Ortsfrequenz, berechnet in den Richtungen x (blau), y (grün) und z (rot). Die durchschnittliche Cos-Phase ist in Schwarz dargestellt und der globale FSC ist in Gelb dargestellt. Unten der Prozentsatz des FSC pro Winkel (blau), überlagert mit dem Goldstandard-FSC-Diagramm (rot). f Lokale Auflösung, projiziert auf die endgültige Karte aus zwei Ausrichtungen.

eine vierseitige Rotationsansicht der endgültigen Karte, angezeigt als Oberfläche, mit den Ketten A und B in Weiß bzw. Grau und der Peptidkarte des aktiven Zentrums in Cyan. b Kette A (blau), Domäne III-Modell, eingepasst in die endgültige Karte (grau). c Die Grenzflächenregion der Ketten A (blau) und B (Lachs) wurde in die endgültige Kryo-EM-Karte (grau) eingepasst. d Überlagerung des Röntgen-Mpro-Modells (gelb, PDB 7KPH), des Röntgen-SARS-CoV-2 C145S Mpro (rosa, PDB 7N5Z) und des SARS-CoV-2 C145S Mpro Kryo-EM-Modells (dunkelblau). e SARS-CoV-2 C145S Mpro Kryo-EM-Modellkette A (links) und (rechts), gefärbt gemäß ihrem RMSD-gegen-Röntgenmodell von Mpro (PDB 7KPH).

Bisher wurde angenommen, dass die in der Lösung beobachtete tetramere Probe von Mpro C145S die gleiche Organisation aufwies wie die mit der Kristallstruktur der Dimer-Dimer-Assoziation erhaltene Probe6. Die Kryo-EM-Struktur von Mpro C145S zeigte jedoch ein dimeres Mpro-Partikel, das im Moment vor der Spaltung an der nsp4-nsp5-Region verankert war, mit detaillierter Dichte der P- und P'-Schlüsselreste (Abb. 3a). Die Struktur mit einer Auflösung von 3,5 Å liefert strukturelle Einblicke in einen wichtigen Schritt der Mpro-Reifung, die N-terminale Spaltung, und zeigt eine deutliche Elektronendichte des Peptids in beiden Ketten A und B des Dimers (Abb. 3a). Die elektrische Potentialkarte um das aktive Zentrum Ser145* weist auf eine nichtkovalente Wechselwirkung des nsp4/nps5-Peptids (Reste SAVLQ von nsp4 und Reste 1–6 von nsp5 Mpro, SGFRKM) hin, die ein ausgedehntes β-Faltblatt bildet, das hauptsächlich durch Wasserstoffbrückenbindungen gehalten wird bei Thr24, Gly143, Ser145*, His163, Glu166 und Gln189 (Abb. 4a). Die Substratpositionen zeigten eine Bindungsposition, die den kristallographischen Strukturen von Mpro im Komplex mit dem physiologischen Peptidsubstrat (PDBid 7N6N und 7DVP) sehr ähnlich war, mit RMSD-Werten von 0,57 bzw. 0,9, berechnet zwischen 30 und 54 Atomen.

a Ansicht des aktiven Zentrums der Mpro C145S-Ketten-A-Oberfläche (in grau), gebunden an das nsp4-nsp5-Peptid (gelbe Stäbchen). Unterstandorte werden von S4 bis S5' bezeichnet. b Detailansicht der Reste des aktiven Zentrums der Mpro C145S-Kette A (in grau), gebunden an das nsp4-nsp5-Peptid (gelbe Stäbchen), mit Kryo-EM-Karte als Oberfläche (Konturniveau 4,55). c Wechselwirkungsschema zwischen nsp4-nsp5-Peptid und Mpro-C145S-Kette A. d Ausgewählte tiefpassgefilterte Partikel, hervorgehobene Dimerpartikel (markiert mit einer blauen Linie), die an ungespaltene Monomerpartikel gebunden sind (markiert mit einer roten Linie). Die Maßstabsleiste wird unten links angezeigt. e Schematische Darstellung des Mpro C145S-Dimers (blau), gebunden an ungespaltene Partikel (rot).

Im Kryo-EM-Modell können wir sehen, dass Gln0 die S1-Unterstelle besetzt, wobei seine NE2-Seitenketteneinheit über eine Wasserstoffbrücke mit dem OE1-Atom des Rests Glu166 interagiert (2,7 Å bzw. 2,5 Å für die Ketten A bzw. B). Darüber hinaus bildet das OG-Atom von Ser145* eine Wasserstoffbindung mit der Hydroxylgruppe der Hauptkette von Gln0. Das Gly143-Hauptkettenamid spendet eine Wasserstoffbindung an P1'-Carbonylsauerstoff und stabilisiert so das Oxyanionloch während der Katalyse. Leu-1 an der S2-Unterstelle interagiert mit Gln189 über eine Wasserstoffbrücke, die zwischen dem Leu-1-Hauptkettenamid und der Gln189-Seitenkette OE1 gebildet wird (Abb. 4a, b). Met49, Met149 und Gln189 von der S2-Unterstelle nehmen im Vergleich zu eingefangenen ungebundenen Formen des Enzyms eine offenere Konformation an. An der S3-Unterstelle kommt es zu einer Wechselwirkung zwischen den polaren Atomen der Val-2-Hauptkette und der Glu166-Seitenkette (Abb. 4c). Die Hydroxylgruppe der Hauptkette Ala-3 in P4 spendet eine Wasserstoffbindung an NE2 von Gln189. Das Fehlen polarer Wechselwirkungen zwischen den Proteinstellen S2–S4 und Proteinresten würde helfen, die Vielfalt unterschiedlicher Aminosäuren zu erklären, die diese Positionen aufnehmen möchten. Die Dichtekarte des im aktiven Zentrum verankerten Mpro-Partikels erstreckt sich nur bis zu den Resten Met6 von Mpro, was darauf hindeutet, dass der Rest des Partikels für eine Modellrekonstruktion zu mobil ist.

Bei der sorgfältigen Untersuchung tiefpassgefilterter Partikel, die für die endgültige Rekonstruktion verwendet wurden, stellten wir fest, dass um jeden einzelnen Bereich der Dimer-Aktivstellen ein längliches Satellitenpartikel verankert war, dessen Größe und Form mit einem teilweise gefalteten Monomer von Mpro übereinstimmten (Abb. 4d). Im Gegensatz zu dem Dimer-Dimer-Komplex, der während der C-terminalen Spaltung gebildet wird, sind diese verlängerten Protomere zufällig um das aktive Zentrum verteilt, was darauf hindeutet, dass die Partikel falsch gefaltet sind (Abb. 4d, e). Darüber hinaus scheinen die länglichen Partikel in Form von nsp5-Monomeren keine Dimere zu bilden (Abb. 4e). Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit unserem vorherigen Modell des unreifen Mpro, in dem wir gezeigt haben, dass die Zugabe von drei nicht spaltbaren Aminosäuren an seine N-Termini die Mpro-Faltung stört und die Dimerisierung verhindert. Dennoch offenbart unsere Struktur einen einzigartigen Blick auf die dimere Form von Mpro, die während der Spaltung der N-Termini in Lösung eingefangen wird. Wir konnten keine 2D- oder 3D-Klassen generieren, die die Satellitenpartikel hervorheben, was mit der teilweise gefalteten Hypothese übereinstimmt.

Viele In-silico-Molekülsimulationen und Docking-Studien haben versucht, Mpro bei der Lösungsbewegung und der Substraterkennung zu beschreiben14,15, es ist kein experimentell ermitteltes Modell verfügbar, um diese frei von den Einschränkungen durch Kristalle zu validieren. Hier verwendeten wir das Kryo-EM-Modell, um die Dynamik von Mpro während der N-terminalen Spaltung zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden die für die Modellrekonstruktion verwendeten Partikel mit dem CryoSPARC 3DVA-Tool zur Sortierung nach Lösungsvariabilität von Mpro analysiert. Die erste von vier untersuchten Eigenvektorkomponenten erzeugte Volumina von geringer Qualität, die nicht interpretierbar waren. Die anderen drei (Komponenten 2, 3 und 4) erzeugten Volumenrahmen, die zur Analyse der Partikelvariabilität verwendet wurden. In allen drei Fällen kann man ein Volumen mit der Form von Mpro sehen, das an beiden aktiven Stellen an das nsp4-Peptid gebunden ist, was darauf hindeutet, dass Partikel anderer oligomerer Zustände während der Datenverarbeitung gefiltert wurden. Wie erwartet zeigt die Analyse, dass die höchste Konformationsplastizität in der Region des aktiven Zentrums von Mpro konzentriert ist, wobei die höchste RMSD in den Regionen der Helix 43–53 und in den β-Haarnadeln 19–27, 62–65 und 166 konzentriert ist -171. Helix 43–53 enthält Schlüsselreste, die an der Bildung der hydrophoben Unterstelle S2 beteiligt sind, einschließlich Met49. Zusammen mit Met165 bildet Met49 einen Substraterkennungshohlraum, wobei hydrophobe Seitenketten wie Leucin und Valin bevorzugt werden6. Die β-Haarnadel 19-27, die für die Bildung der S1'-Unterstelle verantwortlich ist, scheint im Vergleich zum Rest des Proteins ebenfalls bemerkenswert mobil zu sein.

Die Analyse zeigt, dass sich beide aktiven Stellen über die Rahmen hinweg allmählich ausdehnen und zusammenziehen (ergänzende Abbildung 2). Die Erweiterung des aktiven Zentrums von Mpro korrelierte bereits mit der Substrat- und Ligandenbindung6,16, daher ist es wahrscheinlich, dass diese Variabilität mit bestimmten Momenten der Substratverankerung korreliert. Die Konformationsflexibilität des aktiven Zentrums von Mpro während der Substrat- und Ligandenbindung wurde zuvor mithilfe der kryogenen Röntgenkristallographie und der Raumtemperatur-Röntgenkristallographie beobachtet6,17. Kneller et al. zeigten, dass während der Ligandenbindung sekundäre Strukturelemente, die P2-P5-Unterstellen bilden, von ihrer ursprünglichen Position für die Liganden-/Substrataufnahme um bis zu 2,4 Å verschoben werden, wodurch sich die Form und das elektrostatische Potenzial der Stelle verschieben17. Die Expansions- und Kontraktionsbewegungen des aktiven Zentrums scheinen für beide Mpro-Protomere symmetrisch zu sein (ergänzende Abbildung 2). Dies weicht erheblich von mehreren In-silico-Studien ab, die gezeigt haben, dass Mpro-Protomer unabhängig voneinander aktiv sind18,19,20, würde aber helfen zu erklären, warum die Dimerisierung für die volle Enzymeffizienz entscheidend ist. Die Plastizität des aktiven Zentrums von in Lösung befindlichen Coronaviren Mpro ist für das Verständnis der Enzymdynamik von entscheidender Bedeutung und sollte Kampagnen zur Arzneimittelentwicklung unterstützen, insbesondere für Plattformen, die auf In-silico-Analysen der Protein-Ligand-Wechselwirkung basieren, die häufig nicht mit experimentellen Daten korrelieren21.

Die C145S-Mpro-Probe erwies sich als wertvolles Werkzeug zur Untersuchung des In-vitro-Verhaltens von Mpro 6. Hier untersuchen wir die Fähigkeit unserer Methode, die Wirkung wirksamer Inhibitoren auf die Enzymreifung zu untersuchen. Unser erstes Objekt war der von der COVID Moonshot-Initiative entwickelte kompetitive nichtkovalente Inhibitor MAT-POS-e194df51-1 mit einem pIC50 von 7,5. Proben, die monomeres C145S Mpro (Probe 1) oder tetrameres C145S Mpro (Probe 2) enthielten, wurden mit zwei Konzentrationen von MAT-POS-e194df51-1 inkubiert und ihr oligomerer Zustand über einen Zeitraum von 48 Stunden durch SEC-MALS überwacht und mit verglichen Kontrolle. Zur Vereinfachung wurden Trimeren als Teil des Tetramer-Pools betrachtet.

Bei 0 h zeigte die Kontrollprobe 1 ein Verhältnis von 1,0/0,0 (Monomer/Dimer), das nach 24 h auf 0,88/0,12 und nach 48 h auf 0,39/0,61 anstieg (Abb. 5a). Was Probe 1 betrifft, die 4:1 MAT-POS-e194df51-1/Protein enthielt, blieb es zwischen 0 und 24 Stunden bei einem Verhältnis von 1,0/0,0 Monomer/Dimer und stieg erst nach 48 Stunden auf 0,004/0,996 an (Abb. 5b). Durch Reduzieren des Molverhältnisses MAT-POS-e194df51-1/Protein von 4:1 auf 0,4:1 näherte sich das Verhalten dem der Kontrolle an und erreichte ein Monomer/Dimer-Verhältnis von 0,89/0,11 nach 24 Stunden und 0,74/0,25 nach 48 Std. Probe 1 zeigte, dass ungefaltete Monomere im Laufe der Zeit grundsätzlich vollständig ausgereifte Dimere bilden. MAT-POS-e194df51-1 zu Probe 1 scheinen beide Konzentrationen die Dimerreifung zu hemmen und die Ansammlung ungefalteter Monomerpartikel zu verursachen. Mit diesem Experiment konnten wir einen einzigartigen, noch nie dagewesenen Effekt von MAT-POS-e194df51-1 auf den Enzymzyklus nachweisen, der nicht nur seine Fähigkeit zeigt, mit dem Substrat zu konkurrieren, sondern auch den Enzymreifungszyklus zu blockieren und ungespaltenes Polyprotein anzusammeln. Im Jahr 2018 zeigten Constant et al. für die Dengue-Protease NS3, dass die wirksamsten Inhibitoren gezielt auf Spaltungsstellen abzielen sollten, die ungespaltene virale Proteinvorläufer ansammeln würden22. In diesem Fall könnte dieser gehemmte Phänotyp andere virale Phänotypen in der Zelle transdominant hemmen und möglicherweise die Entstehung arzneimittelresistenter Varianten unterdrücken. Weitere Studien werden erforderlich sein, um die Wirkung nicht gespaltener Elemente im SARS-CoV-2-Stoffwechsel zu verstehen.

eine Kontrollreaktion mit Monomeren bei 0 h (oben), nach 24 h Inkubation (Mitte) und nach 48 h (unten). b Monomerumwandlungsreaktion in Gegenwart des nichtkovalenten Inhibitors MAT-POS-e194df51-1 bei 0 Stunden (oben), nach 24 Stunden Inkubation (Mitte) und nach 48 Stunden (unten). c Monomerumwandlungsreaktion in Gegenwart des kovalenten Inhibitors Nirmatrelvir bei 0 Stunden (oben), nach 24 Stunden Inkubation (Mitte) und nach 48 Stunden (unten).

Zur Kontrolle von Probe 2 sahen wir, dass das Verhältnis von 0,43/0,34/0,23 Monomer-/Dimer-/Tetramer-Proteinmasse nach 0 Stunden nachgewiesen wurde und sich nach 24 Stunden auf 0,09/0,89/0,02 und nach 48 Stunden auf 0,0/0,98/0,02 änderte (Abb. 6a). Für Probe 2, die 4:1 MAT-POS-e194df51-1/Protein enthielt, sahen wir, dass das Verhältnis von 0,49/0,45/0,05 Monomer-/Dimer-/Tetramer-Proteinmasse nach 0 Stunden nachgewiesen wurde und sich nach 24 Stunden auf 0,49/0,51/0,0 änderte 0,45/0,55/0,02 nach 48 Stunden (Abb. 6b). Für Probe 2, die 0,4:1 MAT-POS-e194df51-1/Protein enthielt, sahen wir, dass das Verhältnis von 0,46/0,47/0,06 Monomer-/Dimer-/Tetramer-Proteinmasse nach 0 Stunden nachgewiesen wurde und sich nach 24 Stunden auf 0,26/0,73/0,0 änderte 0,02/0,96/0,02 nach 48 Stunden.

eine Kontrollreaktion mit Tetrameren bei 0 h (oben), nach 24 h Inkubation (Mitte) und nach 48 h (unten). b Tetramere-Umwandlungsreaktion in Gegenwart des nichtkovalenten Inhibitors MAT-POS-e194df51-1 bei 0 Stunden (oben), nach 24 Stunden Inkubation (Mitte) und nach 48 Stunden (unten). c Tetramere-Umwandlungsreaktion in Gegenwart des kovalenten Inhibitors Nirmatrelvir bei 0 Stunden (oben), nach 24 Stunden Inkubation (Mitte) und nach 48 Stunden (unten).

Bei der Kontrolle dieses Experiments sahen wir, dass die Probe zunächst eine Mischung aus Tetrameren, Dimeren und Monomeren war. Im Laufe von 48 Stunden werden sowohl Monomere als auch Tetramere gelöscht und Dimere überwiegen. Das Vorhandensein von MAT-POS-e194df51-1 in Probe 2 scheint den gleichen Effekt wie in Probe 1 zu verursachen und den Monomerverbrauch zu blockieren, scheint aber auch den Verbrauch von Tetrameren zu beschleunigen. Wenn wir die Tetramer-Proben als den Enzym-Substrat-Komplex betrachten, ist es logisch, dass ein kompetitiver Inhibitor diese Wirkung auf die Probe haben würde, da er die Verschiebung des ungefalteten Substrats verursacht, das an das aktive Zentrum von Mpro gebunden ist. Parallel zu Probe 1 wurde auch die Umwandlung der Monomere in Probe 2 durch die Anwesenheit von MAT-POS-e194df51-1 blockiert, was zeigt, dass der Inhibitor nicht nur die Aktivität blockiert, sondern auch den Reifungsprozess verhindern könnte, was möglicherweise die antivirale Wirkung darüber hinaus verstärkt Potenz zum Ziel.

Die Wirkung des kovalenten Mpro-Inhibitors Nirmatrelvir/PF-07321332 mit einem pIC50 von 7,710 wurde auch mit C145S-Proben getestet. Die Wirkung dieses Moleküls unterschied sich deutlich von der mit MAT-POS-e194df51-1 (Abb. 5c). Für Probe 1, die 4:1 Nirmatrelvir/Protein enthielt, sahen wir das Verhältnis von 0,65/0,35 zwischen Monomeren/Dimer-Proteinmasse, das nach 0 Stunden nachgewiesen wurde, und sich nach 24 Stunden auf 0,06/0,94 und nach 48 Stunden auf 0,02/0,98 änderte (Abb. 5c). . Für Probe 2, die 4:1 Nirmatrelvir/Protein enthielt, sahen wir das Verhältnis von 0,31/0,56/0,12 zwischen der bei 0 Stunden nachgewiesenen Monomer-/Dimer-/Tetramer-Proteinmasse, das sich nach 24 Stunden auf 0,0/0,88/0,12 und 0,0/0,98/0,02 änderte nach 48 h (Abb. 6c).

In Probe 1 wurde festgestellt, dass das Vorhandensein von Nirmatrelvir die Bildung von Dimeren aus Monomeren bereits nach null Stunden stark induziert und das Verhältnis der Dimerbildung im Laufe der Zeit deutlich erhöht, wobei nach 24 Stunden eine nahezu vollständige Umwandlung erreicht wird (Abb. 5c). In Probe 2 scheint das Gleichgewicht sowohl der Monomere als auch der Tetramere ebenfalls verschoben zu sein, um die Dimerbildung zu begünstigen (Abb. 6c). Während beim Tetramer der erhöhte Verbrauch einfach durch die Konkurrenz zwischen Nirmatrelvir und dem Substrat-Enzym-Komplex erklärt werden konnte, war das beschleunigte Verhältnis der Umwandlung von Monomeren in Dimere völlig unerwartet. Dennoch könnten diese einzigartigen Ergebnisse Aufschluss über die Details des ersten Schritts der Proteinreifung, der N-terminalen Prozessierung, geben.

Unser ursprüngliches Modell für diesen Schritt war, dass die N-terminale Spaltung eine Mischung aus cis- und trans-Ereignissen ist und dass ihre ordnungsgemäße Spaltung die sterische Hinderung beseitigen würde, die die Dimerisierung verhindern würde6, was mit früheren Modellen für SARS-CoV übereinstimmte Mpro 12,13. Die Tatsache, dass der kovalente Inhibitor (aber kein nicht-kovalenter) eine Dimerisierung in einer nicht gespaltenen Probe induzieren könnte, legt jedoch nahe, dass der Auslöser der Dimerisierung nicht die N-terminale Prozessierung ist, sondern die durch die kovalente Bindung selbst verursachte induzierte Anpassung . Dieses Modell würde auch erklären, warum Oligomere durch die Kombination von ungespaltenen und gespaltenen Partikeln und nicht nur durch gespaltene Partikel gebildet werden können (ergänzende Abbildung 1).

Um diese Hypothese zu bestätigen, haben wir Mpro C145S-Monomere in Gegenwart von Nirmatrelvir kristallisiert. Die Kristallstruktur ergab, dass Nirmatrelvir trotz der C145S-Mutation kovalent an das Protein gebunden ist. Ungeachtet dessen beobachteten wir auch eine Verdrängung der Mpro-Helixe αF, αH und αI aus der benachbarten Domäne III, die offenbar durch die sterische Hinderung durch nicht gespaltene N-terminale Aminosäuren verursacht wird (Abb. 7). Dies ähnelt unserer vorherigen Struktur von unreifem Mpro, mit der Ausnahme, dass wir keine Verschiebung der Reste des aktiven Zentrums Phe140, Glu166, Pro168 und Gln1896 sehen. Dies deutet darauf hin, dass die kovalente Bindung die ordnungsgemäße Umformung des aktiven Zentrums ermöglicht und das Dimerisierungsereignis auch dann ermöglicht, wenn keine ordnungsgemäße N-terminale Spaltung erfolgt. Man könnte daraus schließen, dass ein Inhibitor zur Verhinderung der Dimerisierung nichtkovalent sein und die Bindung der Monomerform von Mpro an alle elf verschiedenen Spaltstellen am viralen Polyprotein erfolgreich hemmen muss.

Ser1- und Gln-1-Alpha-Kohlenstoffe werden als rote Kugeln hervorgehoben. Native Mpro wird als grauer, transparenter Cartoon dargestellt, wobei Ser1-Alpha-Kohlenstoff als grüne Kugel hervorgehoben ist.

Wenn man die Kryo-EM-Struktur der an ein ungespaltenes Peptid gebundenen C145S-Mutante mit unserer vorherigen Röntgenstruktur der Ketten A (gespaltenes Peptid, kovalent an Ser145 gebunden) und Kette B (nachgespaltenes Peptid) von C145S (PDB 7N6N) kombiniert, erhalten wir können die strukturellen Veränderungen von Mpro während aller Schritte der enzymatischen Verarbeitung erkennen (Abb. 8). Diese Strukturen zeigen, dass der enzymatische Prozess mit Schlüsselaminosäuren beginnt, die ähnlich wie die Apo-Struktur positioniert sind (Abb. 8a), aber die Schleife β166-171 muss in Richtung des Enzymkerns verschoben werden, um die Substratpeptide P3-P5 aufzunehmen (Abb. 8b). Als nächstes muss diese Schleife β166-171 während der kovalenten Enzym-Substrat-Zwischenstufe noch weiter in den Enzymkern verschoben werden, um einen kürzeren kovalenten Abstand zwischen C/S145 und dem spaltbaren Carbonyl-C und eine ordnungsgemäße Verankerung am aktiven Zentrum während der Helix zu ermöglichen 43-53 und 62-65 zeigen eine lockere Konformation (Abb. 8c). Nach der Spaltung ist das Produktpeptid nicht mehr an C/S145 gebunden, wodurch die Domäne des aktiven Zentrums in ihre Apo-Konformation zurückkehren kann (Abb. 8d). Während dieses Prozesses erfährt die Oberfläche des aktiven Zentrums von Mpro erhebliche strukturelle und elektrostatische Potentialmodifikationen, um alle Enzym-Substrat-Zwischenkonformationen aufzunehmen, die nun in dieser Strukturreihe detailliert beschrieben werden (Abb. 8).

a Wichtige Reste des aktiven Zentrums (grüne Stäbchen) von Mpro in Apo-Form (oben), Cartoon-Ansicht des aktiven Zentrums im Apo-Zustand in Gelb (Mitte) und berechnetes elektrostatisches Potential, projiziert in die Oberfläche des aktiven Zentrums von Mpro (unten). b Wichtige Reste des aktiven Zentrums (grüne Stäbchen) von Mpro C145S, gebunden an intaktes Peptid (oben), Cartoon-Ansicht des aktiven Zentrums der jeweiligen Form (Mitte) und berechnetes elektrostatisches Potential, projiziert auf die jeweilige Form (unten). c Wichtige Reste des aktiven Zentrums (grüne Stäbchen) von Mpro C145S, die kovalent an gespaltenes Peptid gebunden sind und den Enzym-Substrat-Zwischenkomplex bilden (oben), Cartoon-Ansicht des aktiven Zentrums aus der jeweiligen Form (Mitte) und berechnetes elektrostatisches Potential, projiziert auf die jeweilige Form (unten). ). d Wichtige Reste des aktiven Zentrums (grüne Stäbchen) von Mpro C145S im Komplex mit nachgespaltenem Peptid (oben), Cartoon-Ansicht des aktiven Zentrums der jeweiligen Form (Mitte) und berechnetes elektrostatisches Potential, projiziert auf die jeweilige Form (unten). Die transparenten Stäbe und Cartoons (grau) in der oberen und mittleren Abbildung stellen die strukturelle Position der relativen Elemente des vorherigen Schritts dar.

Das SARS-CoV-2 Mpro ist ein 34-kDa-Protein mit drei Domänen, das im Wesentlichen als Dimer aktiv ist5,6. Da die erste Röntgenstruktur von SARS-CoV-2 Mpro im Februar 202023 bei der Protein Data Bank (PDB) unter dem Code 6LU7 hinterlegt wurde, sind bei der PDB derzeit fast 450 Strukturen von Mpro bis zu 1,2 Å verfügbar Auflösung (PDB 7K3T), was den Mpro zu einem der am besten strukturell charakterisierten SARS-CoV-2-NSPs33 macht. Das Mpro wurde durch Röntgenstrahlen im Komplex mit mehreren neuen Arzneimittelkandidaten5,24,25,26,27 und umfunktionierten Molekülen24,28,29, Fragmenten aus großen Fragment-Screening-Kampagnen30 sowie endogenen Peptiden6,16,31 und Peptiden charakterisiert -Mimetika-Medikamentenkandidaten32. Darüber hinaus wurden Röntgenstrukturen bei Raumtemperatur und Kryotemperatur sowie Neutronenkristallographie erfolgreich eingesetzt, um wertvolle Informationen zur detaillierten Beschreibung des Mpro-Wirkmechanismus16,33 sowie von Konformationsänderungen während der Substrat- und Ligandenerkennung6,17 zu liefern. Dennoch offenbart die hier beschriebene Kryo-EM-Struktur von Mpro einzigartige Merkmale der Enzym-Substrat-Erkennung und der Dynamik in Lösung.

Wir haben auch gezeigt, dass die N-terminale Spaltung von Mpro für die ordnungsgemäße Faltung des Proteins wichtig, für die Dimerisierung jedoch nicht entscheidend ist. Unsere Daten legen nahe, dass das Dimerisierungsereignis durch die induzierte Anpassung des Proteins während der Bildung einer kovalenten Bindung während der Spaltung bestimmt wird. Dies bedeutet wahrscheinlich, dass die Spaltung einer der elf viralen Mpro-Zielstellen als Auslöser für die Dimerisierung dienen würde, unabhängig vom Zustand des N-Terminus. Diese Beobachtungen weichen von früheren vorgeschlagenen Modellen ab, bei denen die cis-Spaltung des N- und C-Terminus zwischen zwei Protomeren notwendigerweise der erste Schritt des Reifungsprozesses ist13,34. Tatsächlich hatten frühere Studien gezeigt, dass eine substratinduzierte Dimerisierung in einem In-vitro-Modell des viralen Polyproteins auftreten kann, bei dem N- und C-terminal an andere Proteine gebunden sind35. Unser Modell könnte auch erklären, warum Mpro-Studien, die andere Strategien zur Proteinproduktion verwendeten, einen authentischen N-Terminus erzeugten, wie zum Beispiel die Fälle von MERS-CoV Mpro, bei denen sich die Autoren für die Verwendung von Thrombin an den N-Termini entschieden (und es dem Protein daher nicht erlaubten, dies zu tun). führen interne Spaltung und vollständige Reifung durch) hatten Proteine erzeugt, die sich größtenteils wie Monomere verhalten 36. Kurioserweise haben Autoren auch berichtet, dass die Dimerisierung von MERS-CoV Mpro durch das Substrat ausgelöst werden könnte, was ebenfalls mit unserem vorgeschlagenen Modus übereinstimmt36. Dennoch sind weitere Daten erforderlich, um zu dem Schluss zu gelangen, dass entstehende Mpro verarbeitet und in reife umgewandelt werden, und wenn dieser Prozess vom Verarbeitungsereignis, dem verarbeiteten Partikel oder einer Kombination aus beiden abhängt. Diese Beobachtungen wirken sich auf unser Verständnis des Reifungsprozesses des Coronavirus Mpro sowie der pharmakodynamischen Unterschiede zwischen kovalenten und nichtkovalenten Inhibitoren aus.

Einzelheiten zur Konstruktplanung, Klonierung und Proteinexpression finden Sie an anderer Stelle6. Kurz gesagt, die virale cDNA-Matrize (GenBank MT126808.1), freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Edison Durigon (Universität São Paulo, São Paulo, Brasilien), wurde zum Klonen der kodierenden Region der kodierenden Region von Mpro (Reste 3264–3569) verwendet. unter Verwendung der Primer: Fw 5' CAGGGCGCCATGAGTGGTTTTAGAAAAATGGCATTC 3' und Rv 5' GACCCGACGCGGTTATTGGAAAGTAACACCTGAGAC 3'. Diese Sequenz wurde mit der LIC-Methode37 in den pET_M11-Vektor eingefügt. Dieses Plasmid wurde dann als Matrize für die Insertion nativer N-terminaler Mpro-Reste (GAMSAVLQ ↓ SGFRK) durch inverse PCR unter Verwendung der Primer Fw: 5' GCTGCAGAGTGGTTTTAGAAAAATGGCATTC 3' und Rv: 5' ACGGCTGACATGGCGCCCTGAAAATA 3' verwendet. Dann wurde die C145S-Mutation durch inverse PCR unter Verwendung der Primer Fw 5' CCTTAATGGTTCATCTGGTAGTG 3' und Rv 5' AATGAACCCTTAATAGTGAAATTGG 3' in dieses Plasmid eingefügt, was zum pET_M11-C145S-Mpro führte. Dieses Konstrukt enthält einen N-Termini-6x-Histidin-Tag, gefolgt von einer TEV-Spaltungsstelle, und die Aminosäuren der nsp4-C-Termini-Erkennungssequenz (Ser-4, Ala-3, Val-2, Leu-1, Gln-0 ↓) folgen durch die Mpro-Sequenz mit C145S-Substitution6.

Zur Proteinproduktion wurde pET_M11-C145S-Mpro zur Transformation von E. coli BL21-Zellen verwendet und in ZYM-5052-Medium38 bei 37 °C und 200 U/min bis zu einer OD600 von 0,8 kultiviert, gefolgt von einer 16-stündigen Expression bei 18 °C und 200 U/min . Die Zellen wurden durch 40-minütige Zentrifugation bei 5000 g und 4 °C geerntet, in Lysepuffer (20 mM Tris pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Lysat, das lösliches Protein enthielt, wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 12,00 x g und 4 °C geklärt.

C145S Mpro wurde durch immobilisierte Metallchromatographie (IMAC) unter Verwendung einer 5-ml-HisTrap-FF-Säule (GE Healthcare) gereinigt. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer A (20 mM Tris pH 7,8, 150 mM NaCl, 25 mM Imidazol) wurde das Protein mit Puffer A, ergänzt mit 250 mM Imidazol, eluiert. Die Probe wurde unter Verwendung einer 5-ml-HiTrap-Entsalzungssäule (GE Healthcare), die mit Puffer A äquilibriert war, gepuffert. Um den 6xHis-Tag zu entfernen, wurden der Probe 2 mg TEV-Protease und 4 mM DTT zugesetzt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden nicht gespaltenes Protein und TEV durch einen zweiten Schritt von IMAC in Puffer A entfernt. Das Protein wurde dann durch Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung einer mit Gel äquilibrierten HiLoad 16/60 Superdex 75-Säule (GE Healthcare) gereinigt Filtrationspuffer (20 mM Tris pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT). Das SEC-Profil dieser Probe zeigte mehrere überlappende Peaks gemischter oligomerer Zustände von Mpro, wie zuvor beschrieben6. Peaks mit höherer Retentionszeit sind hauptsächlich zusammengesetzt (Probe 1), während Peaks mit niedrigerer Retentionszeit hauptsächlich aus Tetrameren bestehen (Probe 2). Die Proteinreinheit wurde durch SDS-PAGE analysiert und unter Verwendung des theoretischen Extinktionskoeffizienten von 32.890 M−1.cm−1 quantifiziert. 39. Frische gereinigte Fraktionen beider Peaks wurden in 10 mg·mL−1 aliquotiert und sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Zur Gittervorbereitung wurden frisch gereinigte C145S Mpro-Proben aus dem Tetramer des SEC-Peaks (Probe 2) in Eis aufgetaut, zentrifugiert und in Gelfiltrationspuffer verdünnt. Dann wurden 3 µL von 0,25 mg.ml-1 Proben auf ein durch Glimmentladung entladenes Quantifoil 300 Mesh Cu R2/2-Gitter aufgetragen. Das Gitter wurde mit Vitrobot (FEI) 2,5 s lang mit der Blotstärke 1 bei einer Luftfeuchtigkeit von 100 % und 4 °C geblottet, bevor es in flüssiges Ethan eingefroren wurde.

Die Daten wurden auf Titan Krios gesammelt, der bei 300 kV mit einem K3-Detektor im gezählten Superauflösungsmodus mit einer Spaltbreite von 20 eV und einer Nennvergrößerung von 130.000 x betrieben wurde, was einer kalibrierten Pixelgröße von 0,653 Å auf Probenebene entspricht. Filme wurden über 1 Sekunde mit einer Dosisrate von 18,5 e-/px/s aufgezeichnet und in 43 Bilder fraktioniert. Die Datenerfassung erfolgte mit ThermoFisher Scientific EPU 2.12 mit einem Defokusbereich von –0,5 bis –2,5 µm.

Zur hochauflösenden Strukturbestimmung wurden die 13.770 bei Titan gesammelten hochauflösenden Filme dosisgewichtet, ausgerichtet und zweifach klassiert, wobei MotionCor240,41 in RELION v3.141 implementiert wurde, was zu einem physikalischen Pixel von 0,653 Å führte. Die Kontrastübertragungsfunktion (CTF) der resultierenden mikroskopischen Aufnahmen wurde mit CTFFIND-v4.142 geschätzt.

1.956.496 Partikel wurden mit SPHIRE-crYOLO43 ausgewählt und um den Faktor 3 verkleinert und mit einer Boxgröße von 72 px extrahiert. Die Partikel wurden mit drei Runden der 2D-Klassifizierung gefiltert und sortiert. Für das De-novo-3D-Modell wurden 569.725 gute Partikel ausgewählt. Partikel wurden mit voller Auflösung erneut extrahiert. Mit der 3D-Klassifizierung wurden die Partikel weiter gefiltert und sortiert. Die Partikel aus der besten 3D-Klasse wurden für die 3D-Verfeinerung und Bayes'sche Politur in Relion v3.144 ausgewählt.

Das Refine3D-Volumen und die 227.534 glänzenden Partikel wurden dann zur Verfeinerung in cryoSPARC v3.2.0 importiert45. Für die abgeschiedene Struktur wurde die Karte zunächst mithilfe des Homogeneous Refinement-Algorithmus mit einem zusätzlichen letzten Durchgang, einer anfänglichen Tiefpassauflösung von 7 Å und angewendeter C2-Symmetrie verfeinert, was zu einer verfeinerten Karte mit einer Goldstandard-Fourier-Shell-Korrelation (gsFSC) von 3,75 Å46 führte. Die resultierende Karte wurde für die ungleichmäßige Verfeinerung47 mit einem zusätzlichen letzten Durchgang, einer anfänglichen Tiefpassauflösung von 8 Å, angewendeter C2-Symmetrie, Defokusoptimierung pro Partikel und CTF-Optimierung pro Gruppe verwendet, was zu einer verfeinerten Karte mit einem gsFSC von 3,6 Å führte. Die resultierende Karte wurde dann mithilfe des Local Refinement-Algorithmus mit auferlegter C2-Symmetrie verfeinert, was zu einer Karte mit einem gsFSC von 3,5 Å führte. Das gleiche Protokoll wurde auch mit C1-Symmetrie getestet, was zu einer nahezu identischen Karte mit gsFSC von 3,76 Å führte. Daher wurde die C2-Karte zur weiteren Modellierung und Verfeinerung verwendet. Die Kartenauflösung wurde mit cryoSPARC Local Resolution und 3DFSC Processing Server48 berechnet. Statistiken zur Datenerfassung, -verarbeitung und Modellverfeinerung für C2 finden Sie in Tabelle 1. Eine schematische Darstellung der Datenverarbeitungsschritte finden Sie in Abb. 2.

Das anfängliche Andocken des Modells an die Karte erfolgte mit PDB 7N6N und einer geschärften Karte von cryoSPARC mit UCSF ChimeraX v1.2.549. Zum Schärfen und besseren Visualisieren der hochauflösenden Karte haben wir phenix auto-sharpen50 verwendet. Die Modellerstellung und -verfeinerung erfolgte mit Phenix Real Space Refinement51 und Coot52 und die Validierung erfolgte mit MolProbity53. Die Abbildungen wurden mit PyMOL und ChimeraX v1.2.5 erstellt. Statistiken zur Modellverfeinerung sind in Tabelle 1 verfügbar.

Um die Variabilität von SARS-CoV-2 Mpro C145S-Partikeln zu analysieren, verwendeten wir das 3D-Variabilitätsanalyse-Tool (3DVA), das in cryoSPARC v3.2.054 verfügbar ist. Zu diesem Zweck wurden die 569.725 Partikel voller Größe, die während der 3D-Klassifizierung der Kryo-EM-Datenverarbeitung (in Relion) verwendet wurden, in cryoSPARC v3.2.0 importiert. Diese Partikel und das Refine3D-Volumen wurden in einen symmetriefreien homogenen Verfeinerungszyklus einbezogen. Dann wurden Partikel und Maske verwendet, um 4 Eigenvektoren der Kovarianzmatrix der Datenverteilung unter Verwendung von 3DVA54 zu berechnen, wobei die Auflösung bei 5 Å gefiltert wurde. Modellreihen wurden mit dem 3DVA-Anzeigetool generiert. Bilder wurden mit ChimeraX v1.2.5 generiert.

Die Umkehrphasenchromatographie wurde inline vor der Massenspektrometrie unter Verwendung eines Agilent 1100 HPLC-Systems (Agilent Technologies Inc. – Palo Alto, CA, USA) durchgeführt. Eine Probe von frisch hergestelltem C145S mit tetrameren Peaks (Probe 2) wurde in 0,1 % Ameisensäure auf 20 µg/ml verdünnt und fünfzig µl wurden auf eine 2,1 mm × 12,5 mm Zorbax 5 µm 300SB-C3-Vorsäule injiziert, die in einem Gehäuse untergebracht war Säulenofen auf 40 °C eingestellt. Das verwendete Lösungsmittelsystem bestand aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser in LC-MS-Qualität (Millipore, Lösungsmittel A) und 0,1 % Ameisensäure in Methanol (LC-MS-Qualität, Chromasolve, Lösungsmittel B). Die Chromatographie wurde wie folgt durchgeführt: Die Anfangsbedingungen waren 90 % A und 10 % B und eine Flussrate von 1,0 ml/min. Nach 15 s bei 10 % B wurde ein zweistufiger linearer Gradient von 10 % B auf 80 % B über 45 s und dann von 80 % B auf 95 % B über 3 s angelegt. Die Elution verlief dann isokratisch bei 95 % B für 1 Minute und 12 Sekunden, gefolgt von einer Äquilibrierung bei den Anfangsbedingungen für weitere 45 Sekunden. Die intakte Proteinmasse wurde unter Verwendung eines orthogonalen Flugzeit-Massenspektrometers mit MSD-ToF-Elektrospray-Ionisation (Agilent Technologies Inc. – Palo Alto, CA, USA) bestimmt. Das Instrument wurde mit der Standard-ESI-Quelle konfiguriert und im Positivionenmodus betrieben. Die Ionenquelle wurde mit einer Kapillarspannung von 4000 V, einem Zerstäuberdruck von 60 psig, einem Trocknungsgas von 350 °C und einer Trocknungsgasströmungsrate von 12 l/min betrieben. Die ionenoptischen Spannungen des Instruments waren wie folgt: Fragmentor 250 V, Skimmer 60 V und Oktopol RF 250 V.

Für die native Massenspektrometrie wurde eine Probe der frisch zubereiteten Probe 2 auf Eis gehalten und durch drei Runden Gelfiltration unter Verwendung von BioGel P6 (Biorad) Spin-Säulen gemäß den Anweisungen des Herstellers in 75 µl 50 mM Ammoniumacetat, pH 7,5, gepuffert. Massenspektren wurden mit einem Agilent 6530 QTOF im Positivionen-1-GHz-Modus unter Verwendung einer Standard-ESI-Quelle aufgenommen. Die Proben wurden über eine Spritzenpumpe mit einer Flussrate von 6 µl/min eingebracht. Die Ionenquelle wurde mit einer Kapillarspannung von 3500 V, einem Zerstäuberdruck von 17 psig, einem Trocknungsgas von 325 °C und einer Trocknungsgasströmungsrate von 5 l/min betrieben. Die ionenoptischen Spannungen des Instruments waren wie folgt: Fragmentor 430 V, Skimmer 65 V und Oktopol RF 750 V. Der gleiche Aufbau wurde verwendet, um die tetramere native Form von E. coli LacZ (theoretische Masse von 465.932 Da) mit beobachteter gefalteter Masse zu beschreiben von 466.092 Da für Tetramer55.

In Lösung wurden die oligomeren Zustände der gereinigten Proben durch Größenausschlusschromatographie gekoppelt mit Mehrwinkel-Lichtstreuung (SEC-MALS) bewertet. Alle Tests wurden in Laufpuffer bestehend aus 20 mM Tris-HCl pH 7,8, 100 mM NaCl und 1 mM DTT durchgeführt, wie zuvor beschrieben6. Dazu wurde eine Probe von 50 µL jedes Mpro C145S-Oligomers in einer Konzentration von 50 µM in ein Waters 600 HPLC-System (Waters) injiziert, das in Reihe mit einem UV-Detektor, einem miniDAWN TREOS-Mehrwinkel-Lichtstreugerät (Wyatt Technology), gekoppelt war ), eine Säule Superdex 200 Improve 10/300 GL (GE Healthcare) mit einer Flussrate von 0,5 ml/min und einen Brechungsindexdetektor Optilab T-rEX (Wyatt Technology). Die Lichtstreudetektoren wurden mit Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich) normalisiert. Die Daten wurden mit der von Wyatt bereitgestellten integrierten Software ASTRA 7 gesammelt und analysiert.

Die analysierten Proben enthielten 100 µg C145S Mpro-Monomere oder -Tetramer, die mit 1 % DMSO (Kontrolle) oder Ligand 0, 24 oder 48 Stunden lang inkubiert wurden. Der nichtkovalente Inhibitor MAT-POS-e194df51-1, erhalten vom Moonshot COVID Consortium, wurde in einem Inhibitor:Protein-Verhältnis von 4:1 und 0,4:1 getestet und jeweils 0, 24 oder 48 Stunden lang inkubiert Probe. Der kovalente Inhibitor Nirmatrelvir wurde in einem Inhibitor-Protein-Verhältnis von 4:1 getestet und 0, 24 oder 48 Stunden lang inkubiert. Aufgrund der unzureichenden Auflösung der Methoden wurden Trimer- und Tetramer-Peaks summiert und als Tetramere behandelt. Alle generierten Daten sind in der ergänzenden Abbildung 3 verfügbar.

Monomerproben von C145S Mpro (Probe 1) mit 5 mg/ml wurden mit Nirmatrelvir in einem Protein:Verbindungsverhältnis von 1:5 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden sitzende Tropfenkristallisationsplatten unter Verwendung von 0,1 M MES pH 6,7, 5 % DMSO, 8 % PEG 4000 bei 20 °C aufgestellt. Die Kristalle wurden mit 30 % PEG 400 kryogeschützt und die Daten wurden an der MANACA-Beamline (SIRIUS) gesammelt. Die Daten wurden mit XDS über Autoproc56,57 verarbeitet. Die Daten wurden mit Aimless über CCP458 skaliert und der molekulare Ersatz wurde mit Phaser59 unter Verwendung von PDB 7MBG als Vorlage durchgeführt. Statistiken zur Datenerfassung sind in Tabelle 2 verfügbar. Die Daten wurden mit Coot modelliert und mit Acedrg und Refmac52,60,61,62,63 verfeinert. Die Abbildungen wurden mit ChimeraX, Pymol und BioRender.com erstellt. Die Elektronendichte dieser Struktur ist in der ergänzenden Abbildung 7 sichtbar.

Für ein Bestätigungsexperiment mit einem anderen Aufbau wurde eine native Massenspektrometrie mit einem Orbitrap Q-Exactive UHMR durchgeführt, wie zuvor beschrieben64. Kurz gesagt, die Analytlösungen wurden unter Verwendung von Zeba-Mikrospin-Entsalzungssäulen (7 kDa MWCO, Pierce) in 200 mM Ammoniumacetat, pH 7,4 (Sigma Aldrich), gepuffert. Eine Probe mit 1–3 µL Analyt (in 200 mM Ammoniumacetat) wurde in selbst hergestellte goldbeschichtete Glaskapillaren geladen, die auf einen Punkt von etwa 1 µm gezogen waren. Die Kapillare wurde mit 1,0 – 1,2 kV relativ zur erhitzten Metallkapillare (100 °C) vorgespannt, um durch Nanoelektrospray-Ionisation positive Ionen zu erzeugen. Das Massenspektrometer wurde im Positivionenmodus unter Verwendung der vom Hersteller empfohlenen Einstellungen für die Detektion mit „niedrigem m/z“ betrieben. Die folgenden Parameter wurden manuell angepasst: In-Source-Trapping-Potenzial: 20 – 50 V, 4 ms; HCD-Potenzial: 1 – 10 V; Druckeinstellung: 8,5. Native Massenspektren wurden in QualBrowser (Thermo Fisher Scientific) und OriginPro 2021 (OriginLab Corporation, Northampton, MA) visualisiert. M/z-Spektren hier und von nativem ESI-TOF wurden mit Masshunter B.07.00 (Agilent) analysiert; ESIprot65 und Verwendung einer Ionentabelle. Ladezustände wurden manuell zugewiesen. Die Ergebnisse dieses Laufs sind in der ergänzenden Abbildung 6 verfügbar.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle mit dieser Studie verbundenen Daten sind öffentlich verfügbar. Alle gesammelten Filme und polierten Partikel, die zur endgültigen Strukturbestimmung verwendet werden, sind im Electron Microscopy Public Image Archive (EMPIAR) unter dem Code EMPIAR-10810 verfügbar. Kryo-EM-Karten und Strukturmodelle sind bei der Protein Data Bank (PDB) unter dem Code 8EY2 und der Electron Microscopy Data Bank (EMDB) unter dem Code EMD-28666 verfügbar, und das Röntgenmodell ist unter dem PDB-Code 8EYJ verfügbar. Die in dieser Studie verwendeten Strukturen sind in der PDB-Datenbank unter den Codes 7N5Z, 7KPH, 7N6N, 7K3T und 7DVP verfügbar. Mit diesem Dokument wird eine Quelldatendatei für alle SEC-MALS- und native Massenspektroskopie bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Wu, F. et al. Ein neues Coronavirus, das in China mit Atemwegserkrankungen beim Menschen in Verbindung gebracht wird. Natur 579, 265–269 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, N. et al. Ein neuartiges Coronavirus von Patienten mit Lungenentzündung in China, 2019. N. Engl. J. Med. 382, 727–733 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bhatt, PR et al. Strukturelle Grundlagen der Verschiebung des ribosomalen Leserasters während der Translation des SARS-CoV-2-RNA-Genoms. Wissenschaft 372, 1306–1313 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Osipiuk, J. et al. Struktur der Papain-ähnlichen Protease aus SARS-CoV-2 und ihren Komplexen mit nichtkovalenten Inhibitoren. Nat. Komm. 12, 1–9 (2021).

Artikel Google Scholar

Zhang, L. et al. Die Kristallstruktur der SARS-CoV-2-Hauptprotease bietet eine Grundlage für die Entwicklung verbesserter a-Ketoamid-Inhibitoren. Wissenschaft 368, 409–412 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Noske, GD et al. Eine kristallographische Momentaufnahme des Reifungsprozesses der Hauptprotease von SARS-CoV-2. J. Mol. Biol. 433, 167118 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gordon, DE et al. Eine SARS-CoV-2-Proteininteraktionskarte zeigt Ziele für die Wiederverwendung von Arzneimitteln. Natur 583, 459–468 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chodera, J., Lee, AA, London, N. & von Delft, F. Crowdsourcing der Wirkstoffentdeckung für Pandemien. Nat. Chem. 12, 581 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

von Delft, F. et al. Eine spannende Fahrt zur offenen Entdeckung von COVID-Medikamenten. Natur 594, 330–332 (2021).

Artikel ADS Google Scholar

Owen, DR et al. Ein klinischer Kandidat für einen oralen SARS-CoV-2-Mpro-Inhibitor zur Behandlung von COVID-19. Science 374, 1586–1593 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Das COVID Moonshot Consortium et al. Open-Science-Entdeckung oraler nichtkovalenter SARS-CoV-2-Hauptproteaseinhibitor-Therapeutika. Vorabdruck unter https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.10.29.339317v3 (2021).

Xia, B. & Kang, X. Aktivierung und Reifung der SARS-CoV-Hauptprotease. Protein Cell 2, 282–290 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hsu, MF et al. Mechanismus des Reifungsprozesses der SARS-CoV-3CL-Protease. J. Biol. Chem. 280, 31257–31266 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Römer, RA, Römer, NS & Wallis, AK Flexibilität und Mobilität von SARS-CoV-2-bezogenen Proteinstrukturen. Wissenschaft. Rep. 11, 1–13 (2021).

Artikel Google Scholar

Zimmerman, MI et al. SARS-CoV-2-Simulationen werden im Exa-Maßstab durchgeführt, um dramatische Spitzenöffnungen und kryptische Taschen im gesamten Proteom vorherzusagen. Nat. Chem. 13, 651–659 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, J. et al. Kristallographische Struktur des Wildtyp-SARS-CoV-2-Hauptprotease-Acyl-Enzym-Zwischenprodukts mit physiologischer C-terminaler Autoprozessierungsstelle. Nat. Komm. 11, 5877 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kneller, DW et al. Strukturelle Plastizität des Hohlraums des aktiven Zentrums von SARS-CoV-2 3CL Mpro, nachgewiesen durch Röntgenkristallographie bei Raumtemperatur. Nat. Komm. 11, 7–12 (2020).

Artikel Google Scholar

Chen, H. et al. Im Dimer der SARS 3C-ähnlichen Proteinase ist nur ein Protomer aktiv. J. Biol. Chem. 281, 13894–13898 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Cho, E. et al. Dynamisches Profiling von β-Coronavirus 3CL Mpro-Protease-Ligandenbindungsstellen. J. Chem. Inf. Modell. 61, 3058–3073 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grottesi, A. et al. Computergestützte Studien zu SARS-CoV-2 3CLpro: Erkenntnisse aus MD-Simulationen. Int. J. Mol. Wissenschaft. 21, 1–18 (2020).

Artikel Google Scholar

Macip, G. et al. Eile macht Verschwendung: Eine kritische Überprüfung des dockingbasierten virtuellen Screenings bei der Wiederverwendung von Arzneimitteln zur Hemmung der SARS-CoV-2-Hauptprotease (M-pro). Med. Res. Rev. 42, 744–769 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Constant, DA, Mateo, R., Nagamine, CM und Kirkegaard, K. Targeting der intramolekularen Proteinase NS2B/3-Spaltung zur transdominanten Hemmung des Dengue-Virus. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 115, 10136–10141 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jin, Z. et al. Struktur von Mpro aus SARS-CoV-2 und Entdeckung seiner Inhibitoren. Natur 582, 289–293 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Qiao, J. et al. SARS-CoV-2 Mpro-Inhibitoren mit antiviraler Aktivität in einem transgenen Mausmodell. Wissenschaft 371, 1374–1378 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zaidman, D. et al. Eine automatische Pipeline für die Entwicklung irreversibler Derivate identifiziert einen wirksamen SARS-CoV-2-Mpro-Inhibitor. Zelle. Chem. Biol. 12, 1795–1806 (2021).

Artikel Google Scholar

Han, SH et al. Strukturbasierte Optimierung von ML300-abgeleiteten, nichtkovalenten Inhibitoren, die auf die 3CL-Protease des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus (SARS-CoV-2 3CLpro) abzielen. J. Med. Chem. 65, 2880–2904 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Dampalla, CS et al. Strukturgesteuertes Design von konformativ eingeschränkten Cyclohexan-Inhibitoren der Coronavirus-2 3CL-Protease mit schwerem akutem respiratorischem Syndrom. J. Med. Chem. 64, 10047–10058 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Günther, S. et al. Das Röntgenscreening identifiziert das aktive Zentrum und allosterische Inhibitoren der SARS-CoV-2-Hauptprotease. Wissenschaft 372, 642–646 (2021).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ma, C. et al. Boceprevir, GC-376 und die Calpain-Inhibitoren II, XII hemmen die Virusreplikation von SARS-CoV-2, indem sie auf die virale Hauptprotease abzielen. Zelle. Res. 30, 678–692 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Douangamath, A. et al. Kristallographisches und elektrophiles Fragment-Screening der SARS-CoV-2-Hauptprotease. Nat. Komm. 11, 1–11 (2020).

Artikel Google Scholar

Zhao, Y. et al. Strukturelle Basis für die Replikase-Polyprotein-Spaltung und Substratspezifität der Hauptprotease von SARS-CoV-2. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 119, e2117142119 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bai, B. et al. Peptidomimetische α-Acyloxymethylketon-Gefechtsköpfe mit sechsgliedrigem Lactam-P1-Glutamin-Nachahmer: SARS-CoV-2-3CL-Proteasehemmung, antivirale Aktivität des Coronavirus und biologische In-vitro-Stabilität. J. Med. Chem. 65, 2905–2925 (2021).

Artikel PubMed Google Scholar

Kneller, DW et al. Ungewöhnliche zwitterionische katalytische Stelle der SARS-CoV-2-Hauptprotease, entdeckt durch Neutronenkristallographie. J. Biol. Chem. 295, 17365–17373 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, S., Jonas, F., Shen, C. & Higenfeld, R. Befreiung der SARS-CoV-Hauptprotease aus dem viralen Polyprotein: N-terminale Autospaltung hängt nicht vom reifen Dimerisierungsmodus ab. Protein Cell 1, 59–74 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, C. et al. Reifungsmechanismus der 3C-ähnlichen Proteinase des Coronavirus mit schwerem akutem respiratorischem Syndrom (SARS). J. Biol. Chem. 285, 28134–28140 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ho, BL et al. Kritische Bewertung der wichtigen Reste, die an der Dimerisierung und Katalyse der MERS-Coronavirus-Hauptprotease beteiligt sind. PLoS One 10, e0144865 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Aslanidis, C. & de Jong, PJ Ligationsunabhängiges Klonen von PCR-Produkten (LIC-PCR). Nukleinsäuren Res. 18, 6069–6074 (1990).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Studier, FW Proteinproduktion durch Autoinduktion in Schüttelkulturen hoher Dichte. Proteinexpr. Purif. 41, 207–234 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wilkins, MR et al. Tools zur Proteinidentifizierung und -analyse im ExPASy-Server. Methoden Mol. Biol. 112, 531–552 (1999).

CAS PubMed Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2: Anisotrope Korrektur strahlinduzierter Bewegung für eine verbesserte Kryo-Elektronenmikroskopie. Nat. Methoden 14, 331–332 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zivanov, J. et al. Neue Werkzeuge zur automatisierten hochauflösenden Kryo-EM-Strukturbestimmung in RELION-3. Elife 7, e42166 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

A, R. & N, G. CTFFIND4: Schnelle und genaue Defokusschätzung aus elektronenmikroskopischen Aufnahmen. J. Struktur. Biol. 192, 216–221 (2015).

Artikel Google Scholar

Wagner, T. et al. SPHIRE-crYOLO ist ein schneller und präziser vollautomatischer Partikelpicker für Kryo-EM. Komm. Biol. 2, 1–13 (2019).

Artikel Google Scholar

J, Z., T, N. & SHW, S. Ein Bayes'scher Ansatz zur strahlinduzierten Bewegungskorrektur in der Kryo-EM-Einzelpartikelanalyse. IUCrJ 6, 5–17 (2019).

Artikel Google Scholar

Punjani, A., Rubinstein, JL, Fleet, DJ & Brubaker, MA CryoSPARC: Algorithmen für die schnelle unbeaufsichtigte Kryo-EM-Strukturbestimmung. Nat. Methoden 14, 290–296 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Scheres, SHW & Chen, S. Vermeidung von Überanpassung bei der Bestimmung der Kryo-EM-Struktur. Nat. Methoden 9, 853–854 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Punjani, A., Zhang, H. & Fleet, DJ Ungleichmäßige Verfeinerung: Adaptive Regularisierung verbessert die Einzelpartikel-Kryo-EM-Rekonstruktion. Nat. Methoden 17, 1214–1221 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tan, YZ et al. Berücksichtigung der bevorzugten Probenorientierung in der Einzelpartikel-Kryo-EM durch Kippen. Nat. Methoden 14, 793–796 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

EF, P. et al. UCSF ChimeraX: Strukturvisualisierung für Forscher, Pädagogen und Entwickler. Proteinwissenschaft. 30, 70–82 (2021).

Artikel Google Scholar

Terwilliger, TC, Sobolev, OV, Afonine, PV & Adams, PD Automatisierte Kartenschärfung durch Maximierung von Details und Konnektivität. Acta Crystallogr. D. Struktur. Biol. 74, 545–559 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Afonine, PV et al. Realraumverfeinerung in PHENIX für Kryo-EM und Kristallographie. Acta Crystallogr. D. Struktur. Biol. 74, 531–544 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG & Cowtan, K. Merkmale und Entwicklung von Blässhuhn. Acta Crystallogr. D. Struktur. Biol. 66, 486–501 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Chen, VB et al. MolProbity: Validierung der Gesamtatomstruktur für die makromolekulare Kristallographie. Acta Crystallogr. D. Struktur. Biol. 66, 12–21 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Punjani, A. & Fleet, DJ 3D-Variabilitätsanalyse: Auflösung kontinuierlicher Flexibilität und diskreter Heterogenität aus Einzelpartikel-Kryo-EM. J. Struktur. Biol. 213, 107702 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chalk R. In Heterologe Genexpression in E. coli: Methoden und Protokolle (Hrsg. Burgess-Brown NA) 373–395 (Humana Press, New York City, 2017).

Kabsch, W. Acta Crystallogr. D. Struktur. Biol. 66, 125–132 (2010). XDS.

Artikel CAS Google Scholar

Vonrhein, C. et al. Datenverarbeitung und -analyse mit der autoPROC-Toolbox. Acta Crystallogr. D. Struktur. Biol. 67, 293–302 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Winn, MD et al. Überblick über die CCP4-Suite und aktuelle Entwicklungen. Acta Crystallogr. D. Struktur. Biol. 67, 235–242 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

McCoy, AJ et al. Phaser-Kristallographiesoftware. J. Appl. Kristalllogr. 40, 658–674 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Murshudov, GN et al. REFMAC5 zur Verfeinerung makromolekularer Kristallstrukturen. Acta Crystallogr. D. Struktur. Biol. 67, 355–367 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Evans, PR & Murshudov, GN Wie gut sind meine Daten und wie hoch ist die Auflösung? Acta Crystallogr. D. Struktur. Biol. 69, 1204–1214 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Karplus, PA & Diederichs, K. Verknüpfung von kristallographischem Modell und Datenqualität. Wissenschaft 336, 1030–1033 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Long, F. et al. AceDRG: ein stereochemischer Beschreibungsgenerator für Liganden. Acta Crystallogr. D. Struktur. Biol. 73, 112–122 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

El-Baba, TJ et al. Allosterische Hemmung der SARS-CoV-2-Hauptprotease: Erkenntnisse aus massenspektrometrischen Tests. Angew. Chem. Int. Ed. 59, 23544 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Winkler, R. ESIprot: ein universelles Werkzeug zur Bestimmung des Ladungszustands und zur Berechnung des Molekulargewichts von Proteinen aus Daten der Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie. Schnelle Kommuni. Mass SP 24, 285–294 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Diamond Light Source für den Zugang und die Unterstützung der Kryo-EM-Einrichtungen im britischen National Electron Bio-Imaging Centre (eBIC) durch die Vorschläge BI27083 und NT29349, finanziert vom Wellcome Trust, MRC und BBSRC. Die Autoren danken dem COVID Moonshot Consortium für die Bereitstellung des Präparats und Prof. Carlos Alberto Montanari für die freundliche Bereitstellung von Nirmatrelvir. ASG dankt Andressa Patricia Alves Pinto für ihre Unterstützung bei SEC-MALS. Dieses Projekt wurde von der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES – Projekt 88887.516153/2020-00, ASG) und der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP-Projekte 2013/07600-3, 2015/16811-3) finanziert und 2016/19712-9, GO). Diese Arbeit wurde vom gemeinsamen Unternehmen EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 unterstützt (EUbOPEN-Zuschuss Nr. 875510, RC). Diese Forschung nutzte Einrichtungen des SIRIUS, Teil des brasilianischen Zentrums für Energie- und Materialforschung (CNPEM), einer privaten gemeinnützigen Organisation unter der Aufsicht des brasilianischen Ministeriums für Wissenschaft, Technologie und Innovationen (MCTI). Dem MANACA-Beamline-Personal wird für die Unterstützung während der Experimente des Vorschlags 20220605 gedankt. Die in dieser Veröffentlichung berichteten Forschungsarbeiten wurden teilweise vom NIAID des National Institute of Health unter der Fördernummer U19AI171399 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des National Institute of Health wieder. Die Forschung im Robinson-Labor wird durch einen Zuschuss des Medical Research Council (MRC)-Programms (MR/V028839/1) unterstützt. Diese Forschung wurde teilweise auch vom Wellcome Trust, Grant No. 221795/Z/20/Z, finanziert. TJE ist Junior Research Fellow am Linacre College und wurde durch ein Royal Society Newton International Fellowship unterstützt. TJE und CVR sind dankbar für die großzügige Unterstützung durch den COVID-19 Research Response Fund der University of Oxford und seine Spender (BRD00230).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Gabriela Dias Noske, Yun Song.

Eine vollständige Liste der Mitglieder und ihrer Zugehörigkeiten finden Sie in den Zusatzinformationen.

Sao Carlos Institute of Physics, Universität Sao Paulo, Av. Joao Dagnone, 1100 – Jardim Santa Angelina, Sao Carlos, 13563-120, Brasilien

Gabriela Dias Noske, Rafaela Sachetto Fernandes, Glaucius Oliva und Andre Schutzer Godoy

Electron Bio-imaging Centre, Diamond Light Source Ltd., Harwell Science and Innovation Campus, Didcot, OX11 0QX, Großbritannien

Yun Song & C. David Owen

Centre for Medicines Discovery, Universität Oxford, OX1 3QU, Oxford, Großbritannien

Rod Chalk, Haitem Elmassoudi & Lizbé Koekemoer

Labor für physikalische und theoretische Chemie, Fachbereich Chemie, Universität Oxford, South Parks Road, OX1 3TA, Oxford, Großbritannien

Tarick J. El-Baba und Carol V. Robinson

Das Kavli Institute for Nanoscience Discovery, Dorothy Crowfoot Hodgkin Building, South Parks Road, OX1 3QU, Oxford, Großbritannien

Tarick J. El-Baba und Carol V. Robinson

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

ASG hat dieses Projekt konzipiert. GDN führte biochemische und biophysikalische Experimente durch. YS hat Raster und Datenerfassung vorbereitet. ASG und YS verarbeiteten die Kryo-EM-Daten. ASG und GDN führten Modellierung und Analyse durch. LK, HE, RC, THE und CVR führten MS-Experimente durch. ASG hat dieses Manuskript geschrieben und konzipiert. ASG, RSF, YS, CDO und GO haben dieses Manuskript überarbeitet.

Korrespondenz mit Andre Schutzer Godoy.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Jeffrey Agar, Stephen Harding und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Noske, GD, Song, Y., Fernandes, RS et al. Eine Momentaufnahme des Reifungsprozesses und der Hemmung der Hauptprotease von SARS-COV-2 in Lösung. Nat Commun 14, 1545 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37035-5

Zitat herunterladen

Eingegangen: 01. August 2022

Angenommen: 28. Februar 2023

Veröffentlicht: 20. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37035-5

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.